The aim of this study was to establ

The aim of this study was to establish a simple and rapid method for the detection of F. neoformans in dairy products for use in the food industry where advanced analysis equipment and the time for quality management are often not available. We first developed a species-specific set of LAMP primers targeting the ITS2 region of F. neoformans rDNA, and then confirmed that our primer set had comparable specificity and sensitivity with previously developed species-specific primers for qPCR assay ( Makino et al., 2010). We next developed a simple method for the extraction of DNA from a probiotic dairy product that involved protease treatment followed by boiling under alkaline conditions. This novel method enabled the extraction of DNA from a probiotic dairy product in 15 min without the bead-beating step needed for advanced analysis techniques. We confirmed that this method of DNA extraction followed by LAMP assay with our species-specific primer set could detect F. neoformans in a probiotic dairy product with high detection sensitivity within 1 h, even when the template DNA was crude and possibly contained PCR inhibitors such as polysaccharides or polypeptides derived from the yeast cell wall. In contrast, qPCR assay required that the crude DNA be diluted more than 100 fold to dilute or remove PCR inhibitors ( Table 5). Several studies have shown that PCR assay has poor sensitivity when unpurified DNA is used because of the inhibitory effects biological substances have on the PCR reaction ( Kaneko et al., 2005 and Kaneko et al., 2007). The present results suggest that most of the polypeptides produced by protease treatment of the yeast cell wall or milk proteins can be removed by discarding the supernatant after centrifugation, which may explain why the sensitivity of the qPCR assay increased with dilution of the crude DNA. Our results show that the LAMP assay is extremely robust against impurities and is therefore more suitable for use with crude samples compared with PCR assay.

The extraction of nucleic acids from F. neoformans is hampered by its thick capsule that is not readily lysed ( Bose et al., 2003). Previous studies have shown that DNA extraction from F. neoformans is a complex and time-consuming process that includes steps for enzymatic treatment to weaken the capsule, bead beating, chloroform (or phenol) treatment for protein denaturation, and purification of the DNA ( Bolano et al., 2001, Mseddi et al., 2011, Sansinforiano et al., 1998 and Varma and Kwon-Chung, 1991). In contrast, the rapid DNA extraction method we report here is based on the simple procedure of protease treatment at 45 °C for 3 min followed by boiling at 100 °C for 5 min, and it showed only one order less sensitivity than that of extraction of DNA through the process of protein denaturation with benzyl chloride, bead beating, and final purification ( Table 5). Our novel method of DNA extraction therefore has huge advantages in terms of time (performed within 15 min), simplicity (protease treatment followed by boiling), and cost (requires no expensive reagents or DNA extraction kits).

The detection limit of qPCR for target microbes in a complex system is generally understood empirically, that is, qPCR has the inherent disadvantage that high concentrations of nucleic acids other than the target DNA cause a decline in detection sensitivity. However, qPCR can still be used to detect target microbes at a level 106 times lower than the total microbe concentration. In fact, orally administered probiotic strains can be detected at a level of 105 cells/g in fecal samples with a total microbe concentration of 1011 cells/g (Fujimoto et al., 2008, Fujimoto et al., 2011 and Fujimoto and Watanabe, 2013). Yogurt-type dairy products contain high concentrations of impurities in the form of lactic acid bacteria DNA and milk proteins such as casein. However, contrary to our expectations, our result showed that the LAMP assay could detect F. neoformans at a lower sensitivity threshold of 102 cells/mL not only in a pure culture of F. neoformans but also in a contaminated dairy product from which the DNA was extracted by using benzyl chloride and glass beads, indicating that our LAMP assay can be used to specifically amplify target DNA even if there is a large amount of non-target DNA in the background (lactic acid bacteria at 108–9 cells/mL in most cases). The detection time for an artificially contaminated dairy product was less than 30 min at a concentration of 102 cells/mL ( Table 4), whereas that for the pure yeast culture was about 50 min at the same concentration when DNA was extracted by using benzyl chloride and glass beads ( Table 3). This difference in time may have been caused by the increasing yield of target DNA together with the presence of high concentrations of non-targeted DNA derived from background lactic acid bacteria.

Real-time PCR-based assays are able to detect F. neoformans with high sensitivity ( Satoh et al., 2011 and Somogyvari et al., 2012), but these assays take several hours and require advanced analysis equipment. Recently, a system for the detection of the F. neoformans capsule-associated gene CAP10 by using LAMP has been reported ( Han et al., 2012); however, this method takes over 45 min, and the lower sensitivity threshold is greater than 103 copies/reaction. Therefore, the F. neoformans LAMP-based detection system combined with the simple DNA extraction method we report here is a convenient tool with high sensitivity and performance.

To our knowledge, this is the first report of the use of the LAMP assay to detect yeast contamination in a dairy product. The food production industry requires rapid methods that can give rapid feedback to control the spoilage of food products and prevent the handling of pathogen-contaminated products. Although traditional culture-based methods for the identification and detection of yeast contamination in dairy products close to their expiration date remain essential with regard to cost and equipment needed, we believe that the LAMP assay is a suitable alternative technique because final results can be obtained more quickly (typically within 1 h) than those from qPCR analysis.

In conclusion, we developed a rapid method of extracting DNA from a probiotic dairy product and combined this with LAMP assay with a specific primer set targeting ITS2 in F. neoformans rDNA. This simple and rapid method enabled us to improve the detection procedure of F. neoformans in terms of time, labor, and advanced equipment needed. This novel LAMP assay system will be suitable for primary screening because it does not require advanced equipment or a high level of expertise for operation. This assay has potential applications in the analysis of other foods and the detection of other yeasts or bacteria in food monitoring.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้ได้สร้างวิธีที่ง่าย และรวดเร็วตรวจ F. neoformans ในนมสำหรับใช้ในอุตสาหกรรมอาหารที่วิเคราะห์ขั้นสูงอุปกรณ์และเวลาสำหรับการจัดการคุณภาพมักจะไม่มี เราก่อน พัฒนาชุดไพรเมอร์ไฟกำหนดเป้าหมายภูมิภาค ITS2 ของ F. neoformans rDNA species-specific กแล้ว ยืนยันว่า ชุดของเรารองพื้นมี specificity สามารถเปรียบเทียบและความไวกับไพรเมอร์ species-specific พัฒนาก่อนหน้านี้สำหรับทดสอบ qPCR (มะกิ et al., 2010) ต่อไปเราพัฒนาวิธีการสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกส์ซึ่งรักษารติเอสตามเดือดสภาวะด่าง ง่าย การสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกส์ใน 15 นาทีการเปิดใช้งานวิธีนี้นวนิยาย โดยขั้นตอนทั้งลูกปัดที่จำเป็นสำหรับเทคนิคการวิเคราะห์ขั้นสูง เรายืนยันว่า วิธีการสกัดดีเอ็นเอตามหลอดทดสอบกับชุดของเราพื้น species-specific นี้สามารถตรวจพบ F. neoformans ในผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกส์ มีความไวในการตรวจสูงภายใน 1 h แม้แบบดีเอ็นเอหยาบ และอาจมี PCR inhibitors เช่น polysaccharides หรือเปปไทด์ได้จากผนังเซลล์ยีสต์ ในทางตรงกันข้าม qPCR วิเคราะห์ต้องว่า ดีเอ็นเอน้ำมันจะผสมพับมากกว่า 100 การ dilute หรือเอา PCR inhibitors (ตาราง 5) หลายการศึกษาได้แสดงว่า PCR assay มีความไวต่ำเมื่อมีใช้ดีเอ็นเอ unpurified เนื่องจากผลของลิปกลอสไขสารชีวภาพมีปฏิกิริยา PCR (Kaneko et al., 2005 และ Kaneko et al., 2007) ผลลัพธ์ปัจจุบันแนะนำว่า สามารถเอาของเปปไทด์ที่ผลิต โดยรักษารติเอสของผนังเซลล์ของยีสต์หรือโปรตีนนม โดยละทิ้ง supernatant ที่หลัง centrifugation ซึ่งอาจอธิบายทำไมความไวของการทดสอบ qPCR เพิ่มกับเจือจางเอ็นดิบ ผลของเราแสดงว่า ทดสอบหลอดไฟมีประสิทธิภาพมากกับสิ่งสกปรก และจึงเหมาะสำหรับใช้กับตัวอย่างน้ำมันดิบเทียบกับ PCR assayการสกัดกรดนิวคลีอิกจากเอฟ neoformans มี hampered โดยแคปซูลความหนาที่ไม่พร้อม lysed (ขนาด et al., 2003) การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าสกัดดีเอ็นเอจากเอฟ neoformans กระบวนการซับซ้อน และใช้เวลานานซึ่งประกอบด้วยขั้นตอนการรักษาเอนไซม์ในระบบโรยลูกปัดแคปซูล ตี คลอโรฟอร์ม (หรือวาง) รักษา denaturation โปรตีน และทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ (Bolano และ al., 2001, Mseddi et al., 2011, Sansinforiano และ al., 1998 และ Varma และ ชุ Kwon, 1991) ในทางตรงกันข้าม วิธีอย่างรวดเร็วการสกัดดีเอ็นเอเรารายงานนี่เป็นไปตามขั้นตอนง่าย ๆ รักษารติเอสที่ 45 ° C สำหรับ 3 นาทีตาม ด้วยเดือดที่ 100 ° C สำหรับ 5 นาที และก็พบว่าใบสั่งเดียวความไวน้อยกว่าของสกัดดีเอ็นเอผ่านกระบวนการ denaturation โปรตีน benzyl คลอไรด์ เต้นลูกปัด และสุดท้ายฟอก (ตาราง 5) วิธีการสกัดดีเอ็นเอของเรานวนิยายดังนั้นจึงมีประโยชน์มากในแง่ของเวลา (ดำเนินการภายใน 15 นาที), ความเรียบง่าย (รติเอสรักษาตามเดือด), และต้นทุน (ต้องไม่แพง reagents หรือชุดสกัดดีเอ็นเอ)ตรวจสอบจำนวน qPCR เป้าหมายกลุ่มจุลินทรีย์ในระบบที่ซับซ้อนเป็นโดยทั่วไปเข้าใจ empirically คือ qPCR มีข้อเสียโดยธรรมชาติที่ความเข้มข้นสูงของกรดนิวคลีอิกไม่ใช่เป้าหมายทำไวตรวจดีเอ็นเอลดลง อย่างไรก็ตาม qPCR ยังใช้ตรวจพบจุลินทรีย์เป้าหมายที่ระดับ 106 ครั้งต่ำกว่าความเข้มข้น microbe รวม ในความเป็นจริง ปกครองเนื้อหาโปรไบโอติกส์สายพันธุ์สามารถตรวจพบระดับของเซลล์ 105 g ในตัวอย่าง fecal กับความเข้มข้นรวม microbe ของ 1011 เซลล์/g (ฟุจิโมะโตะ et al., 2008, al. et ฟุจิโมะโตะ 2011 และฟุจิโมะโตะ และ เบะ 2013) นมโยเกิร์ตชนิดประกอบด้วยความเข้มข้นสูงของสิ่งสกปรกในรูปของแบคทีเรียกรดแลคติดีเอ็นเอและโปรตีนนมเช่นเคซีน อย่างไรก็ตาม ขัดกับความคาดหวังของเรา ผลของเราแสดงให้เห็นว่า ทดสอบโคมไฟสามารถตรวจพบ neoformans เอฟที่เป็นขีดจำกัดความไวต่ำของ 102 เซลล์/mL ไม่เพียงแต่ ในวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของ F. neoformans แต่ยังอยู่ ในผลิตภัณฑ์นมปนเปื้อนซึ่งดีเอ็นเอถูกแยกโดย benzyl คลอไรด์และแก้วลูกปัด บ่งชี้ว่า สามารถใช้ทดสอบโคมไฟของเราขยายดีเอ็นเอเป้าหมายโดยเฉพาะแม้ว่าจะมีดีเอ็นเอไม่ใช่เป้าหมายใน(พื้นหลังขนาดใหญ่ แบคทีเรียกรดแลกติกที่ 108-9 เซลล์/mL ในกรณีส่วนใหญ่) เวลาตรวจสอบผลิตภัณฑ์นมปนเปื้อนเหือดเป็นไม่น้อยกว่า 30 นาทีที่ความเข้มข้นของเซลล์ 102 mL (ตาราง 4), ในขณะที่ในวัฒนธรรมยีสต์บริสุทธิ์ถูกประมาณ 50 นาทีที่ความเข้มข้นเดียวกันเมื่อมีสกัดดีเอ็นเอโดย benzyl คลอไรด์และแก้วลูกปัด (ตาราง 3) ได้เกิดจากความแตกต่างนี้ในเวลา โดยผลผลิตที่เพิ่มขึ้นของดีเอ็นเอเป้าหมายร่วมของความเข้มข้นสูงของเป้าหมายไม่ใช่ดีเอ็นเอจากแบคทีเรียกรดแลคติพื้นหลังAssays ผลแบบเรียลไทม์จะตรวจสอบเอฟ neoformans มีความไวสูง (al. et โยะ 2011 และ Somogyvari et al., 2012), แต่ assays เหล่านี้ใช้เวลาหลายชั่วโมง และต้องการการวิเคราะห์ขั้นสูงอุปกรณ์ ล่าสุด ระบบตรวจ F. neoformans สัมพันธ์แคปซูลยีน CAP10 โดยใช้โคมไฟได้รับรายงาน (Han et al., 2012); อย่างไรก็ตาม วิธีการนี้ใช้เวลากว่า 45 นาที และขีดจำกัดความไวต่ำมากกว่าปฏิกิริยา 103 สำเนา ดังนั้น ตามโคมไฟตรวจระบบ neoformans เอฟรวม ด้วยวิธีง่าย ๆ การสกัดดีเอ็นเอเรารายงานนี่เป็นเครื่องมือจึง มีความไวสูงและประสิทธิภาพความรู้ของเรา นี้เป็นรายงานแรกของการใช้ทดสอบโคมที่ตรวจพบยีสต์ปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์นม อุตสาหกรรมการผลิตอาหารต้องมีวิธีการอย่างรวดเร็วที่สามารถให้ผลตอบสนองอย่างรวดเร็วเพื่อควบคุมการเน่าเสียของผลิตภัณฑ์อาหาร และป้องกันการจัดการศึกษาปนเปื้อนผลิตภัณฑ์ แม้ว่าแบบดั้งเดิมตามวัฒนธรรมวิธีการระบุและตรวจหาการปนเปื้อนของยีสต์ในนมใกล้หมดอายุวันยังคงจำเป็นที่เกี่ยวกับต้นทุนและอุปกรณ์ที่จำเป็น เราเชื่อว่า ทดสอบโคมไฟ เทคนิคอื่นเหมาะสมเนื่องจากผลสุดท้ายได้รวดเร็วขึ้น (ปกติภายใน 1 h) กว่าจาก qPCR วิเคราะห์เบียดเบียน เราพัฒนาวิธีการสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกส์อย่างรวดเร็ว และรวมนี้ มีหลอดไฟทดสอบกับรองพื้นเฉพาะที่ตั้งเป้าหมาย ITS2 ใน F. neoformans rDNA วิธีนี้ง่าย และรวดเร็วช่วยให้เราสามารถพัฒนากระบวนการตรวจสอบของ neoformans F. เวลา แรงงาน และอุปกรณ์ขั้นสูงที่จำเป็น นวนิยายนี้หลอดทดสอบระบบจะเหมาะสำหรับการคัดกรองหลักเนื่องจากมันไม่ต้องใช้อุปกรณ์ขั้นสูงหรือระดับของความเชี่ยวชาญสำหรับการดำเนินงาน ทดสอบนี้มีโปรแกรมประยุกต์ที่มีศักยภาพในการวิเคราะห์ของอาหารอื่น ๆ และการตรวจพบ yeasts หรือแบคทีเรียในอาหารการตรวจสอบอื่น ๆ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือการสร้างวิธีที่ง่ายและรวดเร็วในการตรวจหาเอฟ neoformans ในผลิตภัณฑ์นมสำหรับใช้ในอุตสาหกรรมอาหารที่อุปกรณ์วิเคราะห์ขั้นสูงและเวลาสำหรับการจัดการคุณภาพมักจะไม่สามารถใช้ได้ ครั้งแรกที่เราได้รับการพัฒนาสายพันธุ์เฉพาะชุดของไพรเมอร์โคมไฟที่กำหนดเป้าหมายในภูมิภาค ITS2 ของเอฟ neoformans rDNA แล้วยืนยันว่าชุดไพรเมอร์ของเรามีความจำเพาะและความไวเทียบเคียงกับการพัฒนาไพรเมอร์โดยเฉพาะสายพันธุ์ก่อนหน้านี้สำหรับการทดสอบ qPCR (Makino et al., 2010 ) ต่อไปเราพัฒนาวิธีการที่ง่ายสำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกที่เกี่ยวข้องกับการรักษาน้ำย่อยตามด้วยการต้มภายใต้เงื่อนไขที่อัลคาไลน์ วิธีนี้นวนิยายเปิดใช้งานการสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกใน 15 นาทีโดยไม่มีขั้นตอนลูกปัดเต้นที่จำเป็นสำหรับเทคนิคการวิเคราะห์ขั้นสูง เรายืนยันว่าวิธีการสกัดดีเอ็นเอนี้ตามด้วยการทดสอบกับชุดโคมไฟไพรเมอร์สายพันธุ์เฉพาะของเราสามารถตรวจสอบ neoformans เอฟในผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกที่มีความไวสูงการตรวจสอบภายใน 1 ชั่วโมงแม้ในขณะที่แม่แบบของดีเอ็นเอเป็นน้ำมันดิบที่มีอยู่และอาจจะเป็นสารยับยั้ง PCR ดังกล่าว เป็น polysaccharides หรือ polypeptides มาจากผนังเซลล์ยีสต์ ในทางตรงกันข้ามการทดสอบ qPCR จำเป็นที่ดีเอ็นเอน้ำมันดิบปรับลดกว่า 100 เท่าเพื่อเจือจางหรือลบยับยั้ง PCR (ตารางที่ 5) งานวิจัยหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่าการทดสอบ PCR มีความไวที่ดีเมื่อดีเอ็นเอ unpurified ถูกนำมาใช้เพราะผลกระทบที่ยับยั้งสารชีวภาพที่มีอยู่ในปฏิกิริยา PCR (Kaneko et al., 2005 และคาเน et al., 2007) ผลลัพธ์ที่ได้แสดงให้เห็นว่าส่วนใหญ่ของ polypeptides ที่ผลิตโดยการรักษาโปรติเอสของเซลล์ยีสต์ผนังหรือโปรตีนนมสามารถลบออกได้โดยการทิ้งใสหลังจากการหมุนเหวี่ยงซึ่งอาจอธิบายได้ว่าทำไมความไวของการทดสอบ qPCR เพิ่มขึ้นด้วยการลดสัดส่วนของดีเอ็นเอน้ำมันดิบ ผลของเราแสดงให้เห็นว่าการทดสอบเป็นโคมไฟที่มีประสิทธิภาพอย่างมากกับสิ่งสกปรกและดังนั้นจึงเหมาะสำหรับการใช้งานกับตัวอย่างน้ำมันดิบเมื่อเทียบกับการทดสอบ PCR. สกัดกรดนิวคลีอิกจากเอฟ neoformans จะถูกขัดขวางโดยแคปซูลหนาที่ไม่พร้อม lysed (โบสเอต al., 2003) การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าการสกัดดีเอ็นเอจากเอฟ neoformans เป็นกระบวนการที่ซับซ้อนและใช้เวลานานที่มีขั้นตอนในการรักษาเอนไซม์จะลดลงแคปซูลเต้นลูกปัด, คลอโรฟอร์ม (หรือฟีนอล) การรักษาสูญเสียสภาพธรรมชาติของโปรตีนและการทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ (Bolano et al., 2001 Mseddi et al., 2011 Sansinforiano et al., 1998 และวาร์และควอนจุง 1991) ในทางตรงกันข้ามวิธีการสกัดดีเอ็นเออย่างรวดเร็วเรารายงานที่นี่จะขึ้นอยู่กับขั้นตอนง่ายๆของการรักษาน้ำย่อยที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วยเดือดที่ 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีและมันแสดงให้เห็นเพียงคนเดียวเพื่อความไวน้อยกว่าการสกัด ดีเอ็นเอผ่านกระบวนการของการสูญเสียสภาพธรรมชาติของโปรตีนที่มีคลอไรด์เบนซิล, เต้นลูกปัดและการทำให้บริสุทธิ์สุดท้าย (ตารางที่ 5) วิธีนวนิยายของเราในการสกัดดีเอ็นเอจึงมีข้อได้เปรียบอย่างมากในแง่ของเวลา (ดำเนินการภายใน 15 นาที) ความเรียบง่าย (การรักษาน้ำย่อยตามด้วยการต้ม) และค่าใช้จ่าย (ไม่ต้องใช้สารเคมีที่มีราคาแพงหรือชุดสกัดดีเอ็นเอ). ขีด จำกัด การตรวจสอบของ qPCR เป้าหมาย จุลินทรีย์ในระบบที่ซับซ้อนเป็นที่เข้าใจกันโดยทั่วไปสังเกตุ, ที่อยู่, qPCR มีข้อเสียโดยธรรมชาติที่มีความเข้มข้นสูงของกรดนิวคลีอิกอื่นที่ไม่ใช่ดีเอ็นเอเป้าหมายก่อให้เกิดการลดลงของความไวของการตรวจสอบ อย่างไรก็ตาม qPCR ยังสามารถใช้ในการตรวจสอบจุลินทรีย์เป้าหมายที่ระดับ 106 ครั้งต่ำกว่าความเข้มข้นของจุลินทรีย์รวม ในความเป็นจริงผู้รับประทานสายพันธุ์โปรไบโอติกสามารถตรวจพบได้ในระดับ 105 เซลล์ / กรัมในตัวอย่างอุจจาระที่มีความเข้มข้นจุลินทรีย์รวมของ 1,011 เซลล์ / g (Fujimoto et al., 2008 Fujimoto et al., 2011 และ Fujimoto และวาตานาเบะ 2013) โยเกิร์ตชนิดผลิตภัณฑ์นมมีความเข้มข้นสูงของสิ่งสกปรกในรูปแบบของแบคทีเรียกรดแลคติก DNA และโปรตีนนมเช่นเคซีน แต่ตรงกันข้ามกับความคาดหวังของเราผลของเราแสดงให้เห็นว่าการทดสอบโคมไฟสามารถตรวจสอบ neoformans เอฟในเกณฑ์ที่ต่ำกว่าความไว 102 เซลล์ / มิลลิลิตรไม่เพียง แต่ในวัฒนธรรมอันบริสุทธิ์ของ neoformans เอฟ แต่ยังอยู่ในผลิตภัณฑ์นมที่ปนเปื้อนจากการที่ดีเอ็นเอ ถูกสกัดโดยใช้เบนซิลคลอไรด์และลูกปัดแก้วแสดงให้เห็นว่าการทดสอบโคมไฟของเราสามารถนำมาใช้เพื่อขยายเฉพาะดีเอ็นเอเป้าหมายแม้ว่าจะมีจำนวนมากของดีเอ็นเอไม่ใช่เป้าหมายในพื้นหลัง (แบคทีเรียกรดแลคติกที่ 108-9 เซลล์ / มิลลิลิตรใน กรณีส่วนใหญ่) เวลาการตรวจสอบสำหรับผลิตภัณฑ์นมปนเปื้อนน้อยกว่า 30 นาทีที่ระดับความเข้มข้น 102 เซลล์ / มิลลิลิตร (ตารางที่ 4) ในขณะที่วัฒนธรรมยีสต์บริสุทธิ์เป็นประมาณ 50 นาทีที่ความเข้มข้นเดียวกันเมื่อดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้คลอไรด์เบนซิล และลูกปัดแก้ว (ตารางที่ 3) ความแตกต่างในเวลานี้อาจมีสาเหตุมาจากผลผลิตที่เพิ่มขึ้นของดีเอ็นเอเป้าหมายพร้อมกับการปรากฏตัวของความเข้มข้นสูงของดีเอ็นเอที่ไม่ใช่เป้าหมายที่ได้มาจากพื้นหลังแบคทีเรียกรดแลคติค. เวลาจริงการตรวจ PCR-based สามารถตรวจสอบ neoformans เอฟสูง ความไว (Satoh et al., 2011 และ Somogyvari et al., 2012) แต่การตรวจเหล่านี้ใช้เวลาหลายชั่วโมงและต้องใช้อุปกรณ์วิเคราะห์ขั้นสูง เมื่อเร็ว ๆ นี้ซึ่งเป็นระบบสำหรับการตรวจสอบของเอฟ neoformans CAP10 ยีนแคปซูลที่เกี่ยวข้องโดยใช้หลอดไฟที่ได้รับรายงาน (Han et al, 2012.); แต่วิธีการนี้จะใช้เวลามากกว่า 45 นาทีและเกณฑ์ความไวต่ำมีค่ามากกว่า 103 copies / ปฏิกิริยา ดังนั้นเอฟ neoformans ระบบตรวจจับโคมไฟที่ใช้ร่วมกับวิธีการสกัดดีเอ็นเอง่ายที่เรารายงานที่นี่เป็นเครื่องมือที่สะดวกที่มีความไวสูงและประสิทธิภาพ. เพื่อความรู้ของเรานี้เป็นรายงานแรกของการใช้งานของหลอดทดสอบเพื่อตรวจหายีสต์ การปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์นม อุตสาหกรรมการผลิตอาหารที่ต้องใช้วิธีการอย่างรวดเร็วที่สามารถให้ข้อเสนอแนะอย่างรวดเร็วในการควบคุมการเน่าเสียของผลิตภัณฑ์อาหารและป้องกันการจัดการของผลิตภัณฑ์เชื้อที่ปนเปื้อน แม้ว่าวิธีการวัฒนธรรมตามแบบดั้งเดิมสำหรับการระบุและการตรวจสอบการปนเปื้อนยีสต์ในผลิตภัณฑ์นมใกล้เคียงกับวันหมดอายุของพวกเขายังคงเป็นสิ่งจำเป็นในเรื่องเกี่ยวกับค่าใช้จ่ายและอุปกรณ์ที่จำเป็นเราเชื่อว่าการทดสอบโคมไฟเป็นเทคนิคทางเลือกที่เหมาะสมเพราะผลสุดท้ายจะได้รับมากขึ้น ได้อย่างรวดเร็ว (ปกติภายใน 1 ชั่วโมง) กว่าที่ได้จากการวิเคราะห์ qPCR. สรุปได้ว่าเราพัฒนาวิธีการที่รวดเร็วในการสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นมโปรไบโอติกและรวมนี้กับโคมไฟทดสอบกับชุดไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงในการกำหนดเป้าหมาย ITS2 เอฟ neoformans rDNA ซึ่งวิธีที่ง่ายและรวดเร็วช่วยให้เราสามารถปรับปรุงขั้นตอนการตรวจสอบของเอฟ neoformans ในแง่ของเวลาแรงงานและอุปกรณ์ที่ทันสมัยจำเป็น โคมไฟนวนิยายทดสอบระบบนี้จะเหมาะสำหรับการคัดกรองหลักเพราะมันไม่ต้องใช้อุปกรณ์ขั้นสูงหรือระดับสูงของความเชี่ยวชาญในการดำเนินงาน การทดสอบนี้มีการใช้งานที่มีศักยภาพในการวิเคราะห์อาหารอื่น ๆ และการตรวจสอบอื่น ๆ ยีสต์หรือแบคทีเรียในการตรวจสอบอาหาร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือ การสร้างที่ง่ายและวิธีที่รวดเร็วในการตรวจหา neoformans F . ในผลิตภัณฑ์จากนม สำหรับใช้ในอุตสาหกรรมอาหาร ซึ่งเครื่องมือในการวิเคราะห์ขั้นสูง และเวลาสำหรับการจัดการคุณภาพมักจะไม่สามารถใช้ได้ แรกที่เราพัฒนาชุดเฉพาะ - ขยายพันธุ์ของโคมไฟชนิดเป้าหมาย its2 ภาค F . neoformans rDNAและก็ยืนยันว่าชุดของเรามีความไวและความจำเพาะกับรองพื้นด้วยไพรเมอร์ที่พัฒนาก่อนหน้านี้เผ่าพันธุ์ - เฉพาะ qpcr assay ( มาคิโนะ et al . , 2010 ) เราต่อไปพัฒนาวิธีการที่ง่ายสำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากโปรไบโอติกผลิตภัณฑ์นมที่เกี่ยวข้องสามารถรักษาตามด้วยการต้มภายใต้สภาวะที่เป็นด่างวิธีการใหม่นี้ใช้การสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นม โปรไบโอติกใน 15 นาทีไม่มีลูกแก้วเต้นขั้นตอนที่จำเป็นสำหรับเทคนิคการวิเคราะห์ขั้นสูง เรายืนยันว่าวิธีการสกัดดีเอ็นเอนี้ตามด้วยโคมไฟตรวจสอบด้วยชุดไพรเมอร์ของเราเฉพาะ - ขยายพันธุ์สามารถตรวจหา F . neoformans ในผลิตภัณฑ์นม โปรไบโอติกที่มีความไวสูงในการตรวจสอบ 1 ชั่วโมงแม้เมื่อแม่แบบดีเอ็นเอ และอาจเพิ่มการดิบที่มีอยู่เช่น polysaccharides หรือโปรตีนที่ได้จากผนังเซลล์ของยีสต์ . ในทางตรงกันข้าม qpcr assay ที่ต้องดีเอ็นเอดิบให้เจือจางกว่า 100 เท่า เพื่อเจือจาง หรือเอา PCR inhibitors ( ตารางที่ 5 )หลายการศึกษาแสดงวิธี PCR มีความไวที่ดีเมื่อ unpurified ดีเอ็นเอมาใช้เพราะผลของสารชีวภาพ สารในปฏิกิริยา PCR ( คาเนโกะ et al . , 2005 และคาเนโกะ et al . , 2007 )ผลชี้ให้เห็นว่าส่วนใหญ่ของโปรตีนที่ผลิตโดยการรักษาโปรตีนของเซลล์ยีสต์ผนังหรือโปรตีนนมสามารถลบออกได้โดยการนำหลังการปั่นเหวี่ยง ซึ่งอาจอธิบายได้ว่า ทำไมความไวของการทดสอบ qpcr เพิ่มขึ้นเจือจางดีเอ็นเอดิบผลการทดสอบของเราแสดงให้เห็นว่าโคมไฟที่แข็งแกร่งมากกับสิ่งสกปรกและดังนั้นจึงเหมาะสำหรับใช้กับดิบตัวอย่างเปรียบเทียบกับ PCR assay .

การสกัดกรดนิวคลีอิกจาก F neoformans เป็น hampered โดยแคปซูลหนาของมันที่ไม่ยอม lysed ( Bose et al . , 2003 ) การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าการสกัดดีเอ็นเอจาก Fneoformans มีความซับซ้อนและใช้เวลานานกระบวนการที่มีขั้นตอนสำหรับเอนไซม์ ( แคปซูล , ลูกปัดเต้น คลอโรฟอร์ม ( หรือฟีนอล ) สำหรับการรักษา ( โปรตีน และการทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ ( bolano et al . , 2001 , mseddi et al . , 2011 , sansinforiano et al . , 1998 และ Varma และโจควอนชุง , 1991 ) ในทางตรงกันข้ามการสกัดดีเอ็นเออย่างรวดเร็ววิธีที่เรารายงานที่นี่จะขึ้นอยู่กับขั้นตอนง่ายๆของการรักษาที่ 45 ° C และเอนไซม์สำหรับ 3 นาทีตามด้วยเดือดที่ 100 องศา C เป็นเวลา 5 นาที และพบว่ามีเพียงหนึ่งเพื่อความไวน้อยกว่าของการสกัดดีเอ็นเอผ่านกระบวนการของโปรตีน ( กับเบนซิลคลอไรด์ , ลูกปัดและการเต้น สุดท้าย ( ตารางที่ 5 )วิธีการใหม่ของการสกัดดีเอ็นเอจึงมีขนาดใหญ่ ข้อดีในแง่ของเวลา ( แสดงภายใน 15 นาที ) , ความเรียบง่าย ( ติรักษา ตามด้วยต้ม ) และค่าใช้จ่าย ( ต้องไม่มีสารเคมีราคาแพง หรือชุดสกัดดีเอ็นเอ ) .

ขีดจำกัดของ qpcr สำหรับจุลินทรีย์เป้าหมายในระบบที่ซับซ้อน เป็นที่เข้าใจกันโดยทั่วไปเชิงประจักษ์ นั่นคือ ,qpcr มีข้อเสียโดยธรรมชาติที่ความเข้มข้นสูงของกรดนิวคลีอิกนอกจาก DNA เป้าหมายให้ลดลงในความไวของการตรวจหา อย่างไรก็ตาม qpcr ยังสามารถใช้ตรวจหาเชื้อจุลินทรีย์เป้าหมายที่ต่ำกว่าระดับความเข้มข้นของจุลินทรีย์ทั้งหมด 106 ครั้ง ในความเป็นจริงโดยการใช้โปรไบโอติกสามารถตรวจพบเชื้อที่ระดับ 105 เซลล์ / กรัมในตัวอย่างอุจจาระที่มีทั้งหมดจุลินทรีย์เข้มข้นชั้นเซลล์ / กรัม ( ฟูจิโมโตะ et al . , 2008 , ฟูจิโมโต้ et al . , 2011 และ ฟูจิโมโตะ และ วาตานาเบะ , 2013 ) ไอศกรีมประเภทนมมีความเข้มข้นสูงของสิ่งสกปรกในรูปของแบคทีเรียกรดแลคติกที่ดีเอ็นเอและโปรตีนนม เช่น เคซีน . อย่างไรก็ตามขัดกับความคาดหวังของเรา ผลการทดสอบของเราแสดงให้เห็นว่าโคมไฟสามารถตรวจหา F . neoformans ที่ลดความไวของ 102 เซลล์ / มล. ไม่เพียง แต่ในวัฒนธรรมที่บริสุทธิ์ ของ เอฟ neoformans แต่ยังปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์นมที่ดีเอ็นเอโดยใช้เบนซิลคลอไรด์ และลูกปัดแก้วระบุว่าการทดสอบโคมไฟของเราสามารถใช้เฉพาะขยายดีเอ็นเอเป้าหมาย แม้จะมีจำนวนมากของเป้าหมายในพื้นหลัง ( ไม่ใช่ DNA ของแบคทีเรียกรดแลคติกที่ 108 – 9 เซลล์ / มล. ในกรณีส่วนใหญ่ ) เวลาการตรวจสอบการปนเปื้อนนมเทียมผลิตภัณฑ์น้อยกว่า 30 นาทีที่ความเข้มข้น 0 เซลล์ / มล. ( ตารางที่ 4 )ส่วนที่ให้ยีสต์บริสุทธิ์วัฒนธรรมประมาณ 50 นาทีที่ความเข้มข้นเดียวกันเมื่อดีเอ็นเอโดยใช้เบนซิลคลอไรด์และลูกปัดแก้ว ( ตารางที่ 3 ) ความแตกต่างนี้ในเวลาที่อาจจะเกิดจากการเพิ่มผลผลิตของดีเอ็นเอเป้าหมายพร้อมกับการปรากฏตัวของความเข้มข้นสูงของพื้นหลังที่ไม่ใช่เป้าหมาย ดีเอ็นเอที่ได้มาจากแบคทีเรียกรดแลคติก

เวลาจริงที่ใช้วิธี PCR สามารถตรวจพบ เอฟซี neoformans ที่มีความไวสูง ( ซาโต้ et al . , 2011 และ somogyvari et al . , 2012 ) แต่วิธีนี้ใช้เวลาหลายชั่วโมง และต้องใช้เครื่องมือวิเคราะห์ขั้นสูง เมื่อเร็วๆ นี้ ระบบ การตรวจสอบของ อย. neoformans แคปซูลที่ยีน cap10 โดยใช้โคมไฟที่ได้รับรายงาน ( Han et al . , 2012 ) ; แต่วิธีนี้ใช้เวลากว่า 45 นาทีและลดความไวของมากกว่า 103 ฉบับ / ปฏิกิริยา ดังนั้น . neoformans โคมไฟตามระบบการตรวจสอบรวมกับดีเอ็นเอด้วยวิธีการง่ายๆที่เรารายงานที่นี่เป็นเครื่องมือที่สะดวก มีความไวสูงและประสิทธิภาพ

ความรู้ของเรา นี่คือรายงานแรกของการใช้โคมไฟ assay เพื่อตรวจหาการปนเปื้อนเชื้อในผลิตภัณฑ์จากนมอุตสาหกรรมการผลิตอาหารต้องใช้วิธีการอย่างรวดเร็วที่สามารถให้ความคิดเห็นอย่างรวดเร็วเพื่อควบคุมการเน่าเสียของอาหารและผลิตภัณฑ์ป้องกันการปนเปื้อนของเชื้อโรค ผลิตภัณฑ์ แม้ว่าวัฒนธรรมแบบดั้งเดิมที่ใช้วิธีการในการระบุและการตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อในนมใกล้หมดอายุของพวกเขายังคงจำเป็นเกี่ยวกับค่าใช้จ่ายและอุปกรณ์ที่จำเป็นเราเชื่อว่าหลอดทดสอบเทคนิคทางเลือกที่เหมาะสม เพราะผลลัพธ์สุดท้ายได้เร็วขึ้น ( ปกติภายใน 1 ชั่วโมงกว่า จากการวิเคราะห์ qpcr .

สรุป เราได้พัฒนาวิธีที่รวดเร็วของการสกัดดีเอ็นเอจากผลิตภัณฑ์นม โปรไบโอติก และรวมนี้กับโคมไฟใช้กับรองพื้นเฉพาะการตั้งค่าเป้าหมาย its2 ใน F neoformans ด้วย .วิธีนี้ง่ายและรวดเร็วที่ช่วยให้เราสามารถปรับปรุงการตรวจสอบขั้นตอนของ F . neoformans ในแง่ของเวลา แรงงานและอุปกรณ์ที่จำเป็นขั้นสูง โคมไฟทดสอบระบบใหม่นี้จะเหมาะกับการคัดกรอง เพราะมันไม่ต้องใช้เครื่องมือขั้นสูง หรือระดับของความเชี่ยวชาญในการดำเนินงานวิธีนี้มีศักยภาพในการวิเคราะห์ของอาหารอื่น ๆและการตรวจหายีสต์หรือแบคทีเรียอื่น ๆในการตรวจสอบอาหาร