Analysis of the change in stability

Analysis of the change in stability upon mutation

DSC measurements on the wild-type enzyme and the four single mutants D182N, D58N, G306A and Y295F showed a slight increase in the Tm for the variants in correspondence with the PROPKA predicted values, see Table 2. The standard deviations were however in the range of 0.03 to 0.34 °C, emphasizing the difficulties in measuring very low ∆Tm in proteins. Taking into account these standard deviation we estimate that the increase in G306A is definitely significant, that the increase in Tm observed for D58N is probably significant, but that the increase observed for D182N and Y295F are within experimental error. These results do however show that PROPKA 3.0 might be a valuable tool in predicting the magnitude of the change in Tm upon mutation before experiments are taken on. Also, that the higher thermal stability of MtGal compared to AaGal obviously cannot be assigned to one specific residue, but is a combined effect of many small contributions.

The double mutants S185D/Q188T and G104D/A156R showed no change or decrease in Tm upon mutation, suggesting that the predicted hydrogen bond is not formed between Asp185 and Thr188 in S185D/Q188T, and neither is the predicted salt bridge between Asp104 and Arg156 in G104D/A156R, presumably due to unforeseen interactions with neighbouring residues. This emphasizes the importance of accurate predictions of mutant structures when redesigning enzymes, restricting the use of PROPKA 3.0 alone for this specific application.

There are ways to improve these predictions, such as relaxing the structure around the mutations with molecular dynamics, but the computational effort and general uncertainties increase as these techniques become more complex making it less of an attractive option for screening. A compromise can be reached by using scoring functions and only consider rotation around dihedral angles. This reduces the dimension of the problem, but it again requires accurate energy expressions for the protein structure and it is not obvious that it actually refines the geometry.
4.4. Analysis of the thermal inactivation of AaGal

WT AaGal and its variants G306A, D182N and D58N, with a ∆Tm of at least 0.5 °C were also compared with respect to their thermostabilities by recording time courses of the irreversible decay of enzyme activity at 55 °C. The inactivation temperature of 55 °C was chosen to obtain practically useful inactivation rates. Tm was recorded to be in the range of 60.87 to 62.00 °C. The inactivation time courses were obtained for the enzymes under identical conditions. The decrease of azo-galactan activity (A) for each variant was plotted as a function of preincubation time. The so obtained activity vs time curves displayed a biphasic deactivation pattern, see Fig. 3, more clearly seen in semilogarithmic plots (shown in the inset of Fig. 3 for WT).

The rate constant k1 at 55 °C is approximately 2.5 times lower and k2 is approximately 1.8 times lower of G306A compared to that of WT AaGal, see Table 3, (k1 is 0.0390 min− 1 and 0.0158 min− 1, k2 is 0.0514 min− 1 and 0.0219 min− 1 corresponding to half-lives of t½,1 of 17.8 min and 43.9 min and t½,2 of 13.5 min and 23.8 min, for WT and G306A, respectively), implying that the stability indeed has been increased upon mutation. The mutation of Asp182 to an asparagine did however not change the thermal irreversible inactivation rate, implying that this mutation do not alter the thermostability of the enzyme. The mutation of Asp58 to an asparagine, was observed to increase the rate constants k1 and k2 from 0.0390 min− 1 and 0.0.0514 min− 1 to 0.193 min− 1 and 0.231 min− 1 and thereby lowering the thermostability of the enzyme significantly.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงในความมั่นคงตามการกลายพันธุ์วัดเอนไซม์ชนิดป่าและสายพันธุ์เดียวสี่ D182N, D58N, G306A และ Y295F พบว่า การเพิ่มขึ้นเล็กน้อยใน Tm สำหรับตัวแปรในการติดต่อกับ PROPKA ทำนายค่า DSC ดูตารางที่ 2 ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานได้อย่างไรก็ตามในช่วง 0.03-0.34 ° C เน้นความยากลำบากในการวัด ∆Tm ต่ำมากในโปรตีน คำนึงถึงความเบี่ยงเบนมาตรฐานเหล่านี้เราประเมินว่า เพิ่ม G306A เป็นอย่างมากแน่นอน ที่เพิ่มใน Tm สังเกตสำหรับ D58N เป็นสำคัญอาจจะ แต่ที่สังเกตสำหรับ D182N และ Y295F เพิ่มขึ้นมีข้อผิดพลาดทดลอง ผลลัพธ์เหล่านี้อย่างไรก็ตามแสดงว่า PROPKA 3.0 อาจเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าในการทำนายขนาดของการเปลี่ยนแปลงใน Tm เมื่อการกลายพันธุ์ก่อนดำเนินการทดลองใน ยัง ความมั่นคงความร้อนสูงของ MtGal เมื่อเปรียบเทียบกับ AaGal อย่างชัดเจนไม่ให้ตกค้างเฉพาะหนึ่ง ได้เป็นผลรวมของผลงานขนาดเล็กมากคู่สายพันธุ์ S185D/Q188T และ G104D/A156R แสดงให้เห็นว่าไม่เปลี่ยนแปลง หรือลดตามการกลายพันธุ์ใน Tm แนะนำว่า พันธะไฮโดรเจนคาดการณ์ไม่ได้เกิดขึ้นระหว่าง Asp185 และ Thr188 ใน S185D/Q188T และไม่มีสะพานเกลือจะเคลื่อนระหว่าง Asp104 และ Arg156 ใน G104D/A156R สันนิษฐานว่าเนื่องจากการโต้ตอบที่ไม่คาดฝันกับประเทศเพื่อนบ้านตก นี้เน้นความสำคัญของการคาดคะเนที่ถูกต้องของโครงสร้างกลายพันธุ์เมื่อ redesigning เอนไซม์ การจำกัดการใช้ PROPKA 3.0 เพียงอย่างเดียวสำหรับโปรแกรมประยุกต์นี้เฉพาะมีวิธีการปรับปรุงการคาดการณ์เหล่านี้ เช่นพักผ่อนสถานกลายพันธุ์มี dynamics โมเลกุล ความพยายามคำนวณโครงสร้าง และแนวทั่วไปเพิ่มขึ้นเนื่องจากเทคนิคเหล่านี้กลายเป็นซับซ้อนให้น้อยตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับการคัดกรอง การประนีประนอมสามารถเข้าถึงได้ โดยใช้ฟังก์ชั่นให้คะแนน และพิจารณาหมุนรอบมุม dihedral เท่านั้น นี้ช่วยลดขนาดของปัญหา แต่อีกต้องการนิพจน์ของพลังงานที่ถูกต้องสำหรับโครงสร้างโปรตีน และไม่ชัดเจนว่า มันจริงบรรยากาศในเรื่องเรขาคณิต4.4 การวิเคราะห์ของการยกเลิกการเรียกความร้อนของ AaGalWT AaGal และของตัวแปร G306A, D182N และ D58N มี ∆Tm น้อย 0.5 องศาเซลเซียสก็ยังเปรียบเทียบกับ thermostabilities ของพวกเขา โดยบันทึกเวลาคอร์สของผุควมของเอนไซม์ที่ 55 องศาเซลเซียส ยกเลิกการเรียกอุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสได้รับเลือกให้ได้รับประโยชน์จริงยกเลิกการเรียกราคา Tm ถูกบันทึกอยู่ในช่วงของ 60.87-62.00 องศาเซลเซียส หลักสูตรนี้เวลายกเลิกการเรียกได้รับสำหรับเอนไซม์ภายใต้เงื่อนไขเหมือนกัน ลดลงของ azo galactan กิจกรรม (A) สำหรับแต่ละย่อยถูกพล็อตเป็นฟังก์ชันของเวลา preincubation เส้นโค้งเพื่อให้ได้รับกิจกรรมเทียบกับเวลารูปแบบ biphasic ปิดใช้งานแสดง ดู Fig. 3 เห็นชัดเจนมากในผืน semilogarithmic (แสดงในแทรก Fig. 3 สำหรับ WT)K1 คงอัตราที่ 55 ° C จะประมาณ 2.5 ครั้งล่าง และ k2 คือประมาณ 1.8 เวลาล่างของ G306A เมื่อเทียบกับที่ของ WT AaGal ดูตาราง 3, (k1 คือ 0.0390 min− 1 และ 0.0158 min− 1, k2 คือ 0.0514 min− 1 และการ 0.0219 min min− 1 ตรงกับครึ่งชีวิตของ t½, 1 นาทีที่ 17.8 และ 43.9 และ t½ , 2 13.5 นาทีและต่ำสุด 23.8, WT และ G306A ตามลำดับ), หน้าที่ว่า ความมั่นคงแน่นอนได้ถูกเพิ่มขึ้นตามการกลายพันธุ์ การกลายพันธุ์ของ Asp182 จะเป็น asparagine ได้แต่ไม่เปลี่ยนอัตรายกเลิกการให้ความร้อนเรียก การกลายพันธุ์นี้ทำหน้าที่เปลี่ยน thermostability ของเอนไซม์นี้ไม่ การกลายพันธุ์ของ Asp58 จะเป็น asparagine ถูกสังเกตเพื่อเพิ่มอัตราคง k1 และ k2 0.0390 min− 1 และ 0.0.0514 min− min− 1 กับ 0.193 1 และ 0.231 min− 1 และจึงลด thermostability ของเอนไซม์นี้อย่างมาก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงในความมั่นคงเมื่อกลายพันธุ์วัด DSC เกี่ยวกับเอนไซม์ชนิดป่าและสี่กลายพันธุ์เดียว D182N, D58N, G306A Y295F และแสดงให้เห็นเพิ่มขึ้นเล็กน้อยใน Tm สำหรับสายพันธุ์ในการติดต่อกับ PROPKA ที่คาดการณ์ค่าดูตารางที่ 2 เบี่ยงเบนมาตรฐานเป็นอย่างไรในช่วง 0.03-0.34 ° C เน้นความยากลำบากในการวัดΔTmที่ต่ำมากในโปรตีน คำนึงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานเหล่านี้เราคาดว่าการเพิ่มขึ้น G306A แน่นอนอย่างมีนัยสำคัญที่เพิ่มขึ้นในการ Tm ที่สังเกตสำหรับ D58N น่าจะเป็นอย่างมีนัยสำคัญ แต่ที่เพิ่มขึ้นสังเกต D182N และ Y295F อยู่ในข้อผิดพลาดในการทดลอง ผลลัพธ์เหล่านี้ แต่ไม่แสดงให้เห็นว่า PROPKA 3.0 อาจจะเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าในการทำนายความสำคัญของการเปลี่ยนแปลงใน Tm เมื่อกลายพันธุ์ก่อนที่จะทดลองดำเนินการใน นอกจากนี้ว่าเสถียรภาพทางความร้อนที่สูงขึ้นของ MtGal เมื่อเทียบกับ AaGal เห็นได้ชัดว่าไม่สามารถกำหนดให้เป็นหนึ่งในสารตกค้างเฉพาะ แต่เป็นผลรวมของผลงานขนาดเล็กจำนวนมาก. กลายพันธุ์คู่ S185D / Q188T และ G104D / A156R แสดงให้เห็นว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงหรือลดลงใน Tm เมื่อเกิดการกลายพันธุ์ บอกว่าพันธะไฮโดรเจนที่คาดการณ์ไม่ได้เกิดขึ้นระหว่าง Asp185 และ Thr188 ใน S185D / Q188T และไม่เป็นสะพานเกลือคาดการณ์ระหว่าง Asp104 และ Arg156 ใน G104D / A156R สันนิษฐานว่าเกิดจากการมีปฏิสัมพันธ์ที่ไม่คาดฝันกับสารตกค้างที่อยู่ใกล้เคียง นี้เน้นความสำคัญของการคาดการณ์ที่ถูกต้องของโครงสร้างกลายพันธุ์เมื่อปรับเปลี่ยนการออกแบบเอนไซม์ จำกัด การใช้ PROPKA 3.0 เพียงอย่างเดียวสำหรับการใช้งานที่เฉพาะเจาะจงนี้. มีวิธีการในการปรับปรุงการคาดการณ์เหล่านี้เช่นการผ่อนคลายโครงสร้างรอบการกลายพันธุ์ที่มีการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลมี แต่ความพยายามในการคำนวณ และความไม่แน่นอนโดยทั่วไปเพิ่มขึ้นเป็นเทคนิคเหล่านี้กลายเป็นความซับซ้อนมากขึ้นทำให้มันน้อยเลือกที่น่าสนใจสำหรับการคัดกรอง ประนีประนอมสามารถเข้าถึงได้โดยใช้ฟังก์ชั่นการให้คะแนนและจะพิจารณาการหมุนรอบมุม dihedral ซึ่งจะช่วยลดขนาดของปัญหาที่เกิดขึ้น แต่มันอีกครั้งต้องใช้พลังงานการแสดงออกที่ถูกต้องสำหรับโครงสร้างโปรตีนและมันไม่ได้เป็นที่เห็นได้ชัดว่ามันจริงกลั่นเรขาคณิต. 4.4 การวิเคราะห์ของพลังความร้อนของ AaGal WT AaGal และตัวแปรของมัน G306A, D182N และ D58N กับΔTmอย่างน้อย 0.5 องศาเซลเซียสเมื่อเทียบกับความเคารพ thermostabilities ของพวกเขาโดยการบันทึกหลักสูตรของการสลายตัวกลับไม่ได้ของการทำงานของเอนไซม์ที่ 55 ° ซี อุณหภูมิใช้งาน 55 ° C ได้รับการคัดเลือกจะได้รับประโยชน์จริงอัตราการใช้งาน Tm ถูกบันทึกไว้จะอยู่ในช่วงของการที่จะ 60.87 62.00 ° C หลักสูตรเวลาการใช้งานที่ได้รับเอนไซม์ภายใต้เงื่อนไขที่เหมือนกัน การลดลงของกิจกรรม azo-galactan (A) สำหรับตัวแปรแต่ละคนถูกวางแผนเป็นหน้าที่ของเวลา preincubation กิจกรรมที่ได้รับเทียบกับเส้นโค้งเพื่อเวลาที่แสดงรูปแบบการเสื่อม biphasic ดูรูป 3 มากขึ้นเห็นได้อย่างชัดเจนในแปลง semilogarithmic (แสดงในภาพประกอบของรูปที่ 3. สำหรับน้ำหนัก). อัตรา k1 คงที่ที่ 55 องศาเซลเซียสจะอยู่ที่ประมาณ 2.5 เท่าต่ำกว่าและ k2 จะอยู่ที่ประมาณ 1.8 เท่าต่ำกว่าของ G306A เมื่อเทียบกับ WT AaGal, ดูตารางที่ 3 (k1 เป็น 0.0390 min- ที่ 1 และ 0.0158 min- 1, k2 เป็น 0.0514 min- ที่ 1 และ 0.0219 min- 1 สอดคล้องกับชีวิตครึ่งหนึ่งของt½ 1 นาที 17.8 และ 43.9 นาทีและt½ 2 13.5 นาที และ 23.8 นาทีสำหรับ WT และ G306A ตามลำดับ) หมายความว่าความมั่นคงแน่นอนได้รับเพิ่มขึ้นจากการกลายพันธุ์ กลายพันธุ์ของ Asp182 เพื่อ asparagine ที่ได้ แต่ไม่เปลี่ยนความร้อนอัตราการใช้งานกลับไม่ได้หมายความว่าการกลายพันธุ์นี้ไม่เปลี่ยนแปลงทนร้อนของเอนไซม์ กลายพันธุ์ของ Asp58 เพื่อ asparagine ที่ถูกตั้งข้อสังเกตที่จะเพิ่มค่าคงที่อัตรา k1 และ k2 จาก 0.0390 min- ที่ 1 และ 0.0.0514 min- 1-0.193 min- ที่ 1 และ 0.231 min- 1 และจึงลดทนร้อนของเอนไซม์อย่างมีนัยสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงในเสถียรภาพเมื่อมิว

จากการวัดในของเอนไซม์และสี่เดี่ยวกลายพันธุ์ d182n d58n g306a y295f , , และพบเพิ่มขึ้นเล็กน้อยใน TM สำหรับตัวแปรในการติดต่อกับ propka ทำนายค่า ดูจากตารางที่ 2 ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน อย่างไรก็ตามในช่วง 0.03 0.34 ° Cเน้นความยากในการวัดต่ำมาก∆ TM ในโปรตีน ถ่ายลงในบัญชี เหล่านี้ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานเราประเมินว่า การเพิ่ม g306a เป็นมั่นเหมาะสำคัญที่เพิ่มขึ้นใน TM ) d58n อาจสำคัญ แต่ที่เพิ่มขึ้น ) d182n y295f ภายในข้อผิดพลาดและทดลอง ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า ทำแต่ propka 30 เป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าในการประมาณการขนาดของการเปลี่ยนแปลง ซึ่งเมื่อการกลายพันธุ์ก่อนการทดลองจะถ่ายต่อ นอกจากนี้ ที่ สูงกว่า เสถียรภาพต่อความร้อนของ mtgal เมื่อเทียบกับ aagal อย่างเห็นได้ชัดไม่สามารถมอบหมายให้หนึ่งเฉพาะ กาก แต่ เป็น ผลรวมของเงินขนาดเล็กมาก

สองสายพันธุ์ และ s185d / q188t g104d / a156r พบไม่มีการเปลี่ยนแปลงหรือลดลงใน TM เมื่อกลายพันธุ์แนะนำว่า คาดการณ์ไม่ได้สร้างพันธะไฮโดรเจนระหว่างและใน asp185 thr188 s185d / q188t และไม่มีสะพานเกลือและคาดการณ์ระหว่าง asp104 arg156 ใน g104d / a156r , สันนิษฐานว่าเนื่องจากการปฏิสัมพันธ์กับตกค้างกับเพื่อนบ้าน นี้เน้นความสำคัญของการคาดการณ์ที่ถูกต้องของโครงสร้างเอนไซม์กลายพันธุ์ เมื่อออกแบบการใช้ propka 30 คนเดียวสำหรับโปรแกรมที่เฉพาะเจาะจงนี้

มีวิธีการปรับปรุงการคาดการณ์เหล่านี้ เช่นผ่อนคลายโครงสร้างรอบการกลายพันธุ์ด้วยวิธีพลศาสตร์โมเลกุล แต่ความพยายามในการคำนวณและความไม่แน่นอนทั่วไปเพิ่มขึ้นเป็นเทคนิคเหล่านี้กลายเป็นความซับซ้อนมากขึ้นทำให้น้อยของตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับการคัดกรองการประนีประนอม สามารถเข้าถึงได้โดยการใช้ฟังก์ชันการให้คะแนนและพิจารณา dihedral การหมุนรอบมุม นี้ช่วยลดขนาดของปัญหา แต่มันต้องใช้พลังงานอีกสำนวนที่ถูกต้องสำหรับโครงสร้างโปรตีนและมันไม่ได้ชัดเจนว่ามันจริงการกลั่นเรขาคณิต .
4.4 . การวิเคราะห์ความร้อนทำให้ของ aagal

WT aagal และตัวแปรของ g306a d182n d58n , และ ,กับ TM ∆อย่างน้อย 0.5 ° C มาเปรียบเทียบกับการ thermostabilities ของพวกเขาโดยการบันทึกเวลาเรียนผุกลับไม่ได้ของเอนไซม์ที่ 55 องศา C อุณหภูมิ 55 องศา C เมื่อถูกเลือก เพื่อให้ได้อัตราการทำให้เป็นประโยชน์ในทางปฏิบัติ ซึ่งได้รับการบันทึกอยู่ในช่วง 60.87 เพื่อ 62.00 ° Cโดยเมื่อเวลาหลักสูตรที่ได้รับสำหรับเอนไซม์ภายใต้เงื่อนไขที่เหมือนกัน การลดลงของกิจกรรมกาแลคแทนอะโซ ( ) สำหรับแต่ละตัวแปรคือพล็อตเป็นฟังก์ชันของเวลาพบ . จึงได้กิจกรรม VS เส้นโค้งแสดงเวลาแบบ biphasic เสื่อม เห็นรูปที่ 3 อย่างชัดเจน เห็นใน semilogarithmic แปลง ( แสดงในรูปที่ 3 ให้ใส่ของ WT ) .

อัตราคงที่ K1 ที่ 55 องศา C ประมาณ 2.5 เท่า และต่ำกว่า K2 เป็นประมาณ 1.8 ครั้งกว่า g306a เมื่อเทียบกับที่ของ WT aagal เห็นโต๊ะ 3 ( K1 0.0390 มินมิน และ 0.0158 − 1 − 1 , − 1 K2 เป็น 0.0514 มินมิน และ 0.0219 − 1 สอดคล้องกับครึ่งชีวิตของ T ½ 1 ปี และรายได้ของมินมินและ T ½ , 2 ของมินมินและ 13.5 23.8 , WT และ g306a ตามลำดับ )หมายถึง ความมั่นคงแน่นอนได้เพิ่มขึ้นตามการเปลี่ยนแปลง การกลายพันธุ์ของ asp182 มีแอสปาราจีนได้ แต่ไม่สามารถเปลี่ยนความร้อนเท่ากันทำให้กลับไม่ได้หมายความว่าการกลายพันธุ์นี้ไม่ได้เปลี่ยนทดลของเอนไซม์ การกลายพันธุ์ของ asp58 เป็นแอสพาราจีน พบว่า การเพิ่มค่าคงที่อัตรา K1 และ K2 จาก 0.0390 มินมิน และ 0.0.0514 − 1 − 1 0ถ้ามินมินและ− 1 0.231 − 1 และจึงช่วยลดการทำงานของเอนไซม์ทดลอย่างมีนัยสำคัญ