A human embryonic cell line (H9 lin

A human embryonic cell line (H9 line, National Stem Cell Bank code WA09) ordered
from Wicell was cultured and maintained in mTeSR™-1 medium (Stemcell
Technologies) (Supplementary Fig. 1A).
The HFS-1 human iPS cell line was generated from human foreskin fibroblasts by
transfection with the 7F-2 combination of episomal plasmids (pEP4EO2SEN2K,
pEP4EO2SET2K and pCEP4-M2L), as previously reported 23
. Briefly, approximately
3.0 µg of pEP4EO2SEN2K, 3.2 µg of pEP4EO2SET2K and 2.4 µg of the pCEP4-M2L
plasmids were co-transfected into ~1.0×10^6 human neonatal foreskin fibroblasts via
Nucleofector™ (VPD-1001 with program U-20, Lonza). The transfected fibroblasts were
then plated and maintained in fibroblast culture medium. One day after transfection, the
fibroblast medium was replaced with a reprogramming medium consisting of
DMEM/F12 supplemented with N-2 supplement (Life Technologies), B-27 supplement
(Life Technologies), 0.1 mM non-essential amino acids (NEAA), 1 mM GlutaMAX™, 0.1
mM β-mercaptoethanol, 0.5 µM PD0325901, 3 µM CHIR99021, 0.5 µM A-83-01, 1000
U/ml human LIF and 10 µM HA-100. The putative iPSC colonies were then picked and
plated onto Matrigel-coated plates in mTeSR™-1 after approximately 20 days in culture,
and the pluripotency of the iPSCs was verified as previously described 23
.
Neuronal initiation to generate neurospheres and neuroectoderm from the
h/iPSCs
The h/iPSCs (70-80% confluent) were treated with collagenase IV (2 mg ml−1
, Life
Technologies), and harvested for neural differentiation. To generate the neuroectoderm,
the collagenase IV-treated h/iPSC fragments were resuspended in knockout serum
replacement medium (KSRM, Life Technologies) supplemented with 10 ng/ml bFGF
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
6
(Life Technologies) and 10 µM ROCK inhibitor (Y-27632, Tocris Bioscience) and then
equally distributed onto Matrigel-coated plates. To generate neurospheres, the
collagenase IV-treated h/iPSC fragments were plated onto a low adhesion suspension
culture plate (Olympus) with KSRM supplemented with 10 ng ml−1 bFGF, 10 µM ROCK
inhibitor, 50 ng ml−1 EGF (R&D Systems), 1000 Unit ml−1 LIF (Millipore) and 1 µg ml−1
heparin (Sigma-Aldrich), which was termed “SKSRM”. Both of the cultures were
incubated with 10% CO2 in a 37°C incubator for 3 days. A duplicate set of cultures were
maintained in a 5% CO2/37°C incubator to compare the effects of the culture conditions
on neuronal initiation.
Neuronal induction of the neurospheres and neuroectoderm
After the neuronal initiation, the neurospheres and neuroectoderm were maintained in
neuronal induction medium (NIM). NIM is neuronal maintenance medium (NMM)
supplemented with 10 μM SB431542 (Tocris Bioscience) and 1 μM dorsomorphin
(Tocris Bioscience). NMM is a 1:1 mixture of supplemented DMEM/F12 (Life
Technologies) and supplemented Neurobasal (Life technologies) media (detailed
description in supplementary table1). During the 7 days of neuronal induction, the
SKSRM media was gradually replaced with NIM media by increasing the ratio of NIM
versus SKSRM by 20% every two days. The media shifted from 0% NIM and 100%
SKSRM to 100% NIM and 0% SKSRM over 10 days and 5 media changes.
Generation of the neurosphederm from neurospheres using “AdSTEP”
After neuronal induction, the neurospheres were collected in a 15 ml tube and
centrifuged for 5 min at 400 x g. The supernatant was aspirated, the pellets were gently
resuspended with cell dissociation solution (Stem Cell Technologies), and incubated for

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สั่งรายการเซลล์ตัวอ่อนมนุษย์ (H9 บรรทัด รหัส ธนาคารสเต็มเซลล์แห่งชาติ WA09)จาก Wicell ถูกสื่อ™ 1 อ่าง และยังคงอยู่ใน mTeSR (Stemcellเทคโนโลยี) (เสริม Fig. 1A)รายการเซลล์มนุษย์ iPS HFS-1 ถูกสร้างจาก fibroblasts มนุษย์หนังหุ้มปลายโดยtransfection ด้วยชุด episomal plasmids (pEP4EO2SEN2K, 7F-2pEP4EO2SET2K และ pCEP4-M2L), รายงาน 23 เป็นก่อนหน้านี้. สั้น ๆ ประมาณไมโครกรัมเป็นเครื่อง 3.0 ของ pEP4EO2SEN2K, 3.2 ไมโครกรัมเป็นเครื่องของ pEP4EO2SET2K และไมโครกรัมเป็นเครื่อง 2.4 ของ pCEP4 M2Lplasmids ได้ร่วม transfected ใน fibroblasts หนังหุ้มปลายที่ทารกแรกเกิดมนุษย์ ~1.0×10^6 ผ่านNucleofector ™ (VPD-1001 กับโปรแกรม U-20, Lonza) มี transfected fibroblastsแล้วสื่อวัฒนธรรม fibroblast ชุบ และยังคงอยู่ใน หลังจากการ transfection การfibroblast กลางถูกแทนที่ ด้วยสื่อ reprogramming ประกอบด้วยDMEM/F12 เสริม ด้วยอาหารเสริม N 2 (ชีวิตเทคโนโลยี), ภาคผนวก B-27(ชีวิตเทคโนโลยี), 0.1 มม.ไม่เป็นกรดอะมิโน (NEAA), 1 mM GlutaMAX ™ 0.1β-mercaptoethanol มม. 0.5 µM PD0325901, 3 µM CHIR99021, 0.5 µM A-83-01, 1000ปรัอากาศมนุษย์ U/ml และ 10 µM ฮา-100 แล้วรับของอาณานิคม putative iPSC และชุบลงบนแผ่นที่เคลือบ Matrigel ใน mTeSR ™ 1 หลังประมาณ 20 วันในวัฒนธรรมและมีการตรวจสอบ pluripotency ของ iPSCs อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 23.เริ่มต้น neuronal เพื่อสร้าง neurospheres และ neuroectoderm จากการh/iPSCsH/iPSCs (confluent 70-80%) ได้รับการรักษา ด้วย collagenase IV (ml−1 2 mgชีวิตเทคโนโลยี), และเก็บเกี่ยวในประสาทสร้างความแตกต่าง สร้าง neuroectodermcollagenase IV ถือว่า h/iPSC ชิ้นส่วนถูก resuspended ในซีรั่มน่าพิศวงเปลี่ยนกลาง (KSRM เทคโนโลยีชีวิต) เสริม ด้วย 10 ng/ml bFGF ฉบับที่ยอมรับฉบับที่ยอมรับ6(เทคโนโลยีชีวิต) และ 10 µM หินผล (Y-27632 ซื้อ Tocris) แล้วกระจายเท่า ๆ กัน บนแผ่นเคลือบ Matrigel สร้าง neurospheres การcollagenase IV ถือว่า h/iPSC ในชิ้นส่วนที่ชุบไประงับการยึดเกาะต่ำวัฒนธรรมจาน (Olympus) มี KSRM เสริม ด้วย 10 bFGF ml−1 ng, 10 µM ร็อคสารยับยั้ง ng 50 ml−1 EGF (R & D ระบบ), 1000 หน่วย ml−1 ปรัอากาศ (มาก) และ 1 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง ml−1เฮพาริน (ซิก-Aldrich), ซึ่งถูกเรียกว่า "SKSRM" วัฒนธรรมทั้งสองได้incubated 10% CO2 incubator ที่ 37° C ในวันที่ 3 ชุดซ้ำของวัฒนธรรมได้รักษาในแบบ 5% CO2/37 ° C incubator เพื่อเปรียบเทียบผลกระทบของสภาพวัฒนธรรมในการเริ่มต้นที่ neuronalการเหนี่ยวนำของ neurospheres และ neuroectoderm neuronalหลังจากเริ่มต้น neuronal, neurospheres และ neuroectoderm ถูกรักษาไว้ในเหนี่ยวนำ neuronal ปานกลาง (นิ่ม) นิ่มเป็น neuronal บำรุงกลาง (NMM)เสริม ด้วย 10 μM SB431542 (Tocris ซื้อ) และ dorsomorphin μM ที่ 1(Tocris ซื้อ) ส่วนผสม 1:1 ของ DMEM เสริม F12 (ชีวิตเป็น NMMเทคโนโลยี) และเสริมสื่อ Neurobasal (ชีวิตเทคโนโลยี) (รายละเอียดคำอธิบายใน table1 เสริม) ในระหว่างวันที่ 7 ของ neuronal การSKSRM สื่อที่ค่อย ๆ ถูกแทนที่ ด้วยสื่อนิ่ม โดยการเพิ่มอัตราส่วนของนิ่มเมื่อเทียบกับ SKSRM 20% ทุก 2 วัน สื่อที่เปลี่ยนจาก 0% นิ่มและ 100%SKSRM 100% นิ่มและ 0% SKSRM 10 วันและ 5 สื่อเปลี่ยนแปลงรุ่น neurosphederm จาก neurospheres ที่ใช้ "AdSTEP"หลังจากเหนี่ยวนำ neuronal, neurospheres ถูกเก็บในหลอด 15 ml และcentrifuged ใน 5 นาทีที่ 400 x g Supernatant ถูก aspirated ขี้จะได้เบา ๆresuspended กับเซลล์ dissociation โซลูชัน (เทคโนโลยีสเต็มเซลล์), และ incubated สำหรับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สายเซลล์จากตัวอ่อนมนุษย์ (สาย H9, ต้นกำเนิดของเซลล์ธนาคารแห่งชาติรหัส WA09)
ได้รับคำสั่งจากWicell เป็นที่เพาะเลี้ยงและการบำรุงรักษาใน mTeSR ™ -1 ปานกลาง
(อัเทคโนโลยี) (รูปที่เสริม. 1A).
HFS-1 มนุษย์สายพันธุ์ของเซลล์ iPS ถูกสร้างขึ้น จากเซลล์หนังหุ้มปลายลึงค์ของมนุษย์โดยการ
transfection กับ 7F-2 รวมกันของพลาสมิด episomal (pEP4EO2SEN2K,
pEP4EO2SET2K และ pCEP4-M2L) ตามที่รายงานก่อนหน้านี้
23. สั้น ๆ ประมาณ
3.0 ไมโครกรัมของ pEP4EO2SEN2K 3.2 ไมโครกรัมของ pEP4EO2SET2K และ 2.4 ไมโครกรัมของ pCEP4-M2L
พลาสมิดที่ถูกร่วม transfected เข้าไป ~ 1.0 × 10 ^ 6 ทารกแรกเกิดของมนุษย์หนังหุ้มปลายลึงค์รบราผ่าน
Nucleofector ™ (VPD-1001 กับโปรแกรม U-20, Lonza) รบรา transfected
ถูกชุบแล้วและยังคงอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อลาสท์ วันหนึ่งหลังจาก transfection
ที่กลางfibroblast ถูกแทนที่ด้วยสื่อ reprogramming ประกอบด้วย
DMEM / F12 เสริมด้วย N-2 อาหารเสริม (เทคโนโลยีชีวิต) อาหารเสริม B-27
(ไลฟ์เทคโนโลยีส์) 0.1 มิลลิกรดอะมิโนที่ไม่จำเป็น (NEAA) 1 มิลลิ GlutaMAX ™ 0.1
มิลลิβ-mercaptoethanol, 0.5 ไมครอน PD0325901 3 ไมครอน CHIR99021, 0.5 ไมครอน A-83-01, 1000
U / ml LIF มนุษย์และ 10 ไมครอน HA-100 อาณานิคม IPSC
สมมุติถูกหยิบแล้วชุบลงบนแผ่นเคลือบMatrigel ใน mTeSR ™ -1 หลังจากนั้นประมาณ 20
วันในวัฒนธรรมและpluripotency ของ iPSCs ได้รับการตรวจสอบว่าอธิบายไว้ก่อนหน้า
23.
การเริ่มต้นในการสร้างเส้นประสาท neurospheres และ neuroectoderm
จากเอช/ iPSCs
H / iPSCs (70-80% ไหลมารวมกัน) ได้รับการรักษาที่มีคอลลา IV (2 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร-1
ชีวิตเทคโนโลยี) และเก็บเกี่ยวสำหรับความแตกต่างของระบบประสาท
เพื่อสร้าง neuroectoderm
ที่คอลลาได้รับการรักษา-IV เอช / ชิ้นส่วน IPSC ถูก resuspended
ในซีรั่มที่น่าพิศวงกลางแทน(KSRM ชีวิตเทคโนโลยี) เสริมด้วย 10 ng / ml bFGF ที่ยอมรับต้นฉบับที่ยอมรับต้นฉบับ6 (เทคโนโลยีชีวิต) และ 10 ไมครอนยับยั้ง ROCK (Y -27632, Tocris ชีววิทยาศาสตร์) และจากนั้นกระจายอย่างเท่าเทียมกันบนแผ่นMatrigel เคลือบ เพื่อสร้าง neurospheres ที่คอลลาได้รับการรักษา-IV เอช / ชิ้นส่วน IPSC ถูกชุบลงในการยึดเกาะระงับต่ำแผ่นวัฒนธรรม(Olympus) กับ KSRM เสริมด้วย 10 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร-1 bFGF 10 ไมครอน ROCK ยับยั้ง 50 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร-1 EGF (R & D ระบบ ) 1,000 หน่วยมล LIF-1 (ค) และ 1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร-1 เฮ (Sigma-Aldrich) ซึ่งถูกเรียกว่า "SKSRM" ทั้งสองวัฒนธรรมที่ถูกบ่มกับ CO2 10% ใน 37 ° C ศูนย์บ่มเพาะเป็นเวลา 3 วัน ชุดที่ซ้ำกันของวัฒนธรรมที่ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน CO2 5% / 37 °ศูนย์บ่มเพาะ C เพื่อเปรียบเทียบผลของภาวะวัฒนธรรมในการเริ่มต้นของเซลล์ประสาท. การเหนี่ยวนำเส้นประสาทของ neurospheres และ neuroectoderm หลังจากการเริ่มต้นของเซลล์ประสาทที่ neurospheres และ neuroectoderm ได้รับการดูแลในการเหนี่ยวนำเส้นประสาทปานกลาง (NIM) ส่วนต่างอัตราดอกเบี้ยเป็นสื่อการบำรุงรักษาเส้นประสาท (NMM) เสริมด้วย 10 ไมครอน SB431542 (Tocris ชีววิทยาศาสตร์) และ 1 ไมครอน dorsomorphin (Tocris ชีววิทยาศาสตร์) NMM เป็น 1: 1 ผสมเสริม DMEM / F12 (ชีวิตเทคโนโลยี) และตบท้าย Neurobasal (เทคโนโลยีชีวิต) สื่อ (รายละเอียดคำอธิบายในtable1 เสริม) ในช่วง 7 วันของการเหนี่ยวนำเส้นประสาทที่สื่อSKSRM ค่อยๆถูกแทนที่ด้วยสื่อส่วนต่างอัตราดอกเบี้ยโดยการเพิ่มอัตราส่วนของส่วนต่างอัตราดอกเบี้ยเมื่อเทียบกับSKSRM 20% ทุกสองวัน สื่อเปลี่ยนจาก 0% ส่วนต่างอัตราดอกเบี้ยและ 100% SKSRM ถึง 100% ส่วนต่างอัตราดอกเบี้ย 0% SKSRM กว่า 10 วันและ 5 การเปลี่ยนแปลงสื่อ. การสร้าง neurosphederm จาก neurospheres การใช้ "AdSTEP" หลังจากการเหนี่ยวนำเส้นประสาทที่ neurospheres ถูกเก็บไว้ในหลอดมล. 15 และปั่นเป็นเวลา5 นาทีที่ 400 x กรัม สารละลายได้รับการสำลักเม็ดถูกเบา ๆresuspended กับการแก้ปัญหาการแยกตัวของเซลล์ (Stem เทคโนโลยีเซลล์) และบ่มเป็นเวลา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เป็นเซลล์ตัวอ่อนมนุษย์ ( h9 บรรทัดธนาคารสเต็มเซลล์รหัสแห่งชาติ wa09 ) สั่ง
จาก wicell เลี้ยงและดูแลใน mtesr ™ - กลาง 1 ( เทคโนโลยีสเต็มเซลล์
) ( เพิ่มเติมรูปที่ 1A )
hfs-1 มนุษย์ถูกสร้างขึ้นจากเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่ใช้เส้นหนังหุ้มปลายของมนุษย์โดย
สำหรับกับการรวมกัน 7f-2 ของ episomal พลาสมิด ( pep4eo2sen2k
pep4eo2set2k , และ pcep4-m2l ) ก่อนหน้านี้รายงาน 23
. สั้นๆ ประมาณµ
3.0 กรัม pep4eo2sen2k 3.2 กรัม และµ pep4eo2set2k 2.4 µ G ของพลาสมิด pcep4-m2l
เป็น Co transfected เป็น ~ 1.0 × 10
6
nucleofector หนังหุ้มปลายเกิดจากมนุษย์ผ่าน™ ( vpd-1001 กับ U-20 โปรแกรม Power ) การ transfected fibroblasts อยู่
แล้วชุบ และรักษาวัฒนธรรมในส่วนกลาง วันหนึ่งหลังจาก transfection
,ส่วนกลางถูกแทนที่ด้วย reprogramming medium ซึ่งประกอบด้วย
dmem / F12 เสริมด้วย n-2 เสริม ( ไลฟ์ เทคโนโลยี ) , b-27 เสริม
( เทคโนโลยี ) , 0.1 มม. ไม่มีกรดอะมิโน ( neaa ) ™ glutamax 1 มม. , 0.1
อืมบีตา - mercaptoethanol 0.5 µ M pd0325901 3 µ M chir99021 0.5 µ M a-83-01 1000
U / ml Lif มนุษย์และ 10 ha-100 M µ . อาณานิคม IPSC แล้วเลือกเฉพาะหน้าและ
ชุบเคลือบลงบนแผ่น matrigel ใน mtesr ™ - 1 หลังประมาณ 20 วันในวัฒนธรรม
และเพลอริโพเทนซีของ ipscs ยืนยันตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า 23
.
และเริ่มต้นในการสร้างและ neurospheres neuroectoderm จาก ipscs

H / H / ipscs ( 70-80% กระจู๋กระจี๋ ) ได้รับการรักษาด้วยคอลลาเจน 4 ( 2 มก. มล − 1

) เทคโนโลยีกับชีวิต และเก็บเกี่ยวประสาทความแตกต่าง .เพื่อสร้าง neuroectoderm
4 , คอลลาเจนรักษา H / IPSC ชิ้นส่วนถูก resuspended ในมหัศจรรย์เซรั่ม
แทนกลาง ( ไลฟ์ เทคโนโลยี ksrm ) เสริมด้วย 10 ng / ml bfgf

ยอมรับยอมรับต้นฉบับต้นฉบับ
6
( ไลฟ์ เทคโนโลยี ) และ 10 µ M Rock inhibitor ( y-27632 tocris , วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ) แล้ว
เท่าๆ กัน การกระจายบนแผ่นเคลือบ matrigel . เพื่อสร้าง neurospheres
,คอลลาจีเนส 4 รักษา H / IPSC ชิ้นส่วนถูกชุบลงต่ำ การระงับ
วัฒนธรรมจาน ( Olympus ) กับ ksrm 4-D 10 − 1 bfgf ng มิลลิลิตร , 10 µ M 50 นาโนกรัม ซึ่งหิน
, − 1 ( 1 ) ( R & D ระบบ ) , 1000 หน่วยมิลลิลิตร− 1 ยก ( 1 µมิลลิกรัม ) และ มล − 1
เฮปาริน ( ซิกม่า Aldrich ) ซึ่งถูกเรียกว่า " sksrm " ทั้งวัฒนธรรมถูก
แยก 10% CO2 ใน 37 ° C บ่มเป็นเวลา 3 วันซ้ำชุดของวัฒนธรรมถูก
รักษาใน 5% CO2 / 37 ° C เครื่องฟักไข่ เพื่อศึกษาและเปรียบเทียบผลของเงื่อนไขในการริเริ่มวัฒนธรรม
.
และการเหนี่ยวนำของ neurospheres neuroectoderm
และหลังจากการเริ่มต้นการ , และถูกเก็บรักษาไว้ใน neurospheres neuroectoderm
ขนาดกลางและเหนี่ยวนำ ( นิม ) นิ่มปานกลาง และการบำรุงรักษา ( อืม )
อาหาร 10 sb431542 M μ ( tocris วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ) และ 1 μ M dorsomorphin
( tocris วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ) อืม เป็น 1 : 1 ผสมเสริม dmem / F12 ( เทคโนโลยีกับชีวิต
) และเสริม neurobasal ( เทคโนโลยี ) สื่อ ( รายละเอียด
รายละเอียดในหนังสือ table1 ) ในช่วง 7 วันของการเหนี่ยว ,
sksrm สื่อก็ค่อยๆ แทนที่ด้วยนิมสื่อโดยการเพิ่มอัตราส่วนของนิม