2. Materials and methods2.1. Chemic

2. Materials and methods
2.1. Chemicals
Fetal bovine serum (FBS)was purchased fromCellgro. Rosiglitazone (BRL49653)was
purchased fromCayman Chemical. Ellagic acid (EA), quercetin (Quer),myricetin (My) and
kaempferol (KMP) were purchased from Sigma-Aldrich.
2.2. Animals
Adipose tissue and liver samples were collected from our previous study [13].
Briefly, male C57BL/6 mice were fed with low-fat (LF), high-fat (HF; 60% kcal from fat)
diet alone or HF plus 0.4% MGP for 15 weeks. Diet composition is found in Gourineni
et al. [13]. At the time of necropsy, freshly isolated epididymal fat and liver tissue was
either fixed in 10% buffered formaldehyde for paraffin embedding or snap-frozen with
liquid nitrogen and kept at −80°C. All protocols and procedures were approved by the
Institutional Animal Care and Use Committee at the University of Florida.
2.3. Preparation of MGP and subfractionation
Preparation and composition of MGP has been described [13]. Briefly, MGPs were
prepared from Noble muscadine grapes by acidified-methanol extraction (0.5% acetic
acid) and subsequent purification using Amberlite FPX66 column (Rohm Hass). The
subfractionation of MGP into non-anthocyanin (NAcy) and anthocyanin (Acy) was
completed as described previously [15]. The analysis of phytochemical composition of
NAcy was performed on an Agilent 1200 HPLC system (Agilent Technologies). Briefly, a
total of 5 mg of NAcy in 1 ml of HCl/methanol solution (1:1) was analyzed by HPLC
using an Agilent Zorbax Stablebond SB-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5-μm particle
size). The binary mobile phase consisted of 0.5% aqueous formic acid (A) and
acetonitrile (B); the flow rate was mL/min and a 25-min gradient was used (the
gradient was 0–5 min of 10%–30% B, 5–10 min of 30%–40% B, 10–20 min of 40%–50% B,
20–23 min of 50%–70% B, 23–25 min of 70%–100% B, followed by 5 min of
reequilibration of the column before the next run). The detection wavelength for the
EA and flavonols was 360 nm using UV–Vis diode array detector (Fig. 3A).
2.4. Cell culture and phytochemical treatment
For isolation of human adipose-derived stem cells (hASCs), abdominal adipose
tissue was obtained from females with a body mass index of ~30 kg/m2 during
liposuction or abdominoplasty surgery. Isolation of hASCs and differentiation of
adipocytes was conducted as we described previously [16,17]. All protocols and
procedures were approved by the institutional review board (#693-2011) at the
University of Florida and the University of Nebraska-Lincoln. To examine the effects of
different MGP phytochemicals on adipocyte differentiation (Figs. 2 and 3), confluent
cultures of hASCs (d0 preadipocyte) were induced to differentiate in an increasing dose
of MGP subfraction (0–25 μg/ml of NAcy or Acy), or 10 μmol/l of individual
phytochemicals of EA, Quer, My and KMP in human adipocyte medium (AM-1,
ZenBio) in differentiation cocktail for 3 days (d1–d3 adipocyte). Upon 4 days of
differentiation (d4), medium was changed with AM-1 plus fresh phytochemical
without differentiation cocktail. Medium was then replenished with fresh addition of
each phytochemical every other day and harvested on day 10 of differentiation. All
treatments were paralleled with vehicle controls (0.1% DMSO). The experimental
design to investigate the effects of EA on lipid metabolism in mature adipocytes is
summarized in Fig. 4A.
Huh7 cells were a kind gift from Dr. Jae Sung Kim (University of Florida). Huh7 cells
weremaintained inDulbecco'smodification of Eagle'smediumcontaining 1%L-glutamine,
10% FBS, 100 units/ml penicillin, 100g/ml streptomycin in 5% CO2 at 37°C.
2.5. Adipocyte size measurement
Hematoxylin and eosin (H&E)-stained sections of epididymal adipose tissue were
used for size determination by following the published protocol by Chen et al. [18]. Briefly,
adipocyte sizewas examined by analyzing digital images of H&E-stained paraffin sections
(n=300 cells/mouse, total=1500–2000 adipocytes from 7–9 mice/diet group) by using
Image J software.
2.6. Lipid accumulation
The colorimetric TG quantification kit (BioVision, K622‐100) was used to quantify
hepatic TG content according to the manufacturer's protocol. To measure lipid
accumulation in human adipocytes and Huh7 cells, cells were fixed with isopropanol
and stained with oil-red O (ORO). For determination of relative TG content, bright field
images were taken by EVOS XL microscope (AMG), or ORO dye was extracted for
quantification (OD 500 nm).
2.7. [3H]-oleic acid and [3H]-acetyl CoA incorporation into FFA and TG
To measure FA esterification rate into TG, we followed the previously published
methods [19] in cultures of mature adipocytes or human hepatoma Huh7 cells. Briefly,
cells were incubated with serum-free low glucose media (1000 mg/l D-glucose)
overnight before experiments. [3H]-oleic acid (OA) (Perkin Elmer; final concentration
of 0.5 μCi/ml in 0.5×106 cells) was complexed with FA-free BSA, then added to cells for
3 h. Incorporation of [3H]-OA into TG was increased linearly over a 6-h period (data not
shown). After 3-h incubation with [3H]-OA, medium containing unincorporated
isotope was removed by washing with phosphate-buffered saline (PBS). Cellular lipids
were extracted as published [20]. Then thin layer chromatography was performed to
fractionate FFA and TG, and the [3H] was measured by liquid scintillation counting
(Beckman LS 6000; Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA). Radioactivity was
normalized by protein concentration quantified by bicinchoninic acid colorimetric
assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Similarly, for the measurement of de novo synthesis of
FA, [3H]-acetyl CoA (Perkin Elmer; final concentration of 0.5 μCi/ml in 0.5×106 cells)
was added to cells for 3 h and unincorporated isotope was removed by washing with
PBS three times.
2.8. [3H] 2-deoxy-glucose uptake
To determine basal and insulin-stimulated glucose uptake, cultures of mature
human adipocytes were incubated with or without 10 μmol/l of EA for 3 days. The day
before the experiment, cultures were incubated with 1 ml serum-free basal medium
containing 1000 mg/l D-glucose and 20 pmol/l human insulin (Thermo Scientific;
SH30021.01) in the presence of vehicle or treatment. After 24 h in serum-free media,
culture media was removed and replaced with 1 ml of HBSS buffer containing 100
nmol/l human insulin for 10 min, followed by addition of [3H]-2DOG (Perkin Elmer;
final concentration was 0.5 μCi/ml) and incubation at 37°C for 90 min. Glucose uptake
was terminated by adding 1 ml of stop buffer [ice-cold Krebs–Ringers bicarbonate
(KRBC) buffer supplemented with 25 mmol/l D-glucose]. After washing cells with KRBC
buffer three times to reduce background radioactivity, cells were lysed in 0.1% SDS.
Glucose uptake was determined by liquid scintillation counting [21].
2.9. Oxygen consumption rate
Huh7 cells were seeded into 96-well clear bottom black polystyrene sterile plate
(Corning). Oxygen consumption rate (OCR) was determined by using MitoXpress
(Cayman Chemical, 600800) according to the manufacturer's protocol. Briefly, an
increase of phosphorescent signal from an oxygen-sensitive probe was measured every
3 min for 5 h using a Synergy H1 multi-mode microplate reader (BioTek).
2.10. Quantitative polymerase chain reaction
Gene-specific primers for quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were
obtained from Integrated DNA Technologies (Chicago, IL, USA). Total RNA of hASCs was
isolated using Trizol reagent (Invitrogen). To remove genomic DNA contamination,
RNA was treated with DNase (Mediatech); 2 μg of RNA was converted into cDNA in a
total volume of 20 μl (iScript cDNA synthesis kit; Bio-Rad). Gene expression was
determined by real-time qPCR (CFX96; Bio-Rad), and relative gene expression was
normalized by 36B4 (primer sequences are available upon request).
2.11. Western blot analysis
To prepare tissue lysates, 0.1 g of snap-frozen tissue was homogenized in ice-cold
RIPA buffer (Thermo Scientific) with protease inhibitors (Sigma) and phosphatase
inhibitors (2 mmol/l Na3VO4, 20 mmol/l β-glycerophosphate and 10 mmol/l NaF).
Adipose tissue lysate was incubated on ice for 10 min to remove the solidified fat cake.
To prepare total cell lysates, monolayers of differentiated cultures of human adipocytes
were harvested with RIPA buffer. Proteins were fractionated using 4%–15% gradient
SDS-PAGE (Biorad), transferred to PVDF membranes with a semidry transfer unit
(Hoefer TE77X) and incubated with the relevant antibodies. Chemiluminescence from

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. เคมีภัณฑ์เซรั่มวัวและทารกในครรภ์ (FBS) ถูกซื้อ fromCellgro ได้ Rosiglitazone (BRL49653)ซื้อ fromCayman เคมี Ellagic กรด (เอ), quercetin (Quer), myricetin (ของฉัน) และkaempferol (KMP) ถูกซื้อจากซิก Aldrich2.2. สัตว์เปลวและตัวอย่างตับถูกรวบรวมจากการศึกษาของเราก่อนหน้านี้ [13]สั้น ๆ ชาย C57BL/6 หนูถูกเลี้ยง ด้วยไขมันต่ำ (LF), สูงไขมัน (HF; 60% กิโลแคลอรี่จากไขมัน)อาหารเพียงอย่างเดียว หรือ HF บวก 0.4% MGP 15 สัปดาห์ องค์ประกอบอาหารที่พบใน Gourineniร้อยเอ็ด al. [13] ในขณะ necropsy สดแยก epididymal ไขมันและเนื้อเยื่อตับได้การถาวรใน 10% buffered ฟอร์มาลดีไฮด์ในพาราฟินฝัง หรือสแนปแช่ด้วยไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส โปรโตคอลและขั้นตอนทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยการสถาบันสัตว์ดูแล และใช้คณะกรรมการที่มหาวิทยาลัยฟลอริดา2.3. เตรียม MGP และ subfractionationเตรียมการและองค์ประกอบของ MGP แล้วอธิบาย [13] สั้น ๆ MGPs ได้เตรียมจากองุ่น muscadine โนเบิล โดยแยกเมธานอ acidified (0.5% อะซิติกกรด) และภายหลังฟอกโดยใช้คอลัมน์ Amberlite FPX66 (Hass โรม) ที่มี subfractionation MGP ไม่มีโฟเลทสูง (NAcy) และมีโฟเลทสูง (Acy)เสร็จสมบูรณ์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15] การวิเคราะห์องค์ประกอบสารพฤกษเคมีNAcy ที่ดำเนินการบนระบบการ HPLC Agilent 1200 (Agilent เทคโนโลยี) สั้น ๆ การจำนวน NAcy มก. 5 ใน 1 ml ของ HCl/เม ทานอล (1:1) ได้วิเคราะห์ ด้วย HPLCใช้คอลัมน์เพิ่ม Agilent Zorbax Stablebond SB-C18 (250 มม. × 4.6 mm อนุภาค 5-μmขนาด) เฟสเคลื่อนที่ไบนารีประกอบด้วยกรดฟอร์มิกอควี 0.5% (A) และacetonitrile (B); อัตราการไหลเป็น mL/min และใช้ไล่ 25 นาที(การไล่ระดับสี 0 – 5 นาที 10% – 30% B, 5 – 10 นาทีบี 30%-40%, 10 – 20 นาที 40% – 50% บีต่ำสุด 20-23 ของ 50% – 70% B, 23 – 25 นาทีของ B 70% – 100% ตาม ด้วย 5 นาทีของreequilibration ของคอลัมน์ก่อนถัดไป) ความยาวคลื่นตรวจจับสำหรับการEA และ flavonols 360 nm โดยใช้ไดโอดอาร์เรย์ตรวจจับ UV – Vis (Fig. 3A)2.4. วัฒนธรรมและสารพฤกษเคมีบำบัดเซลล์สำหรับแยกของ adipose มาเกิดเซลล์ (hASCs), adipose ท้องเนื้อเยื่อได้รับจากหญิงที่มีดัชนีมวลกายเป็นของ ~ 30 kg/m2 ในระหว่างผ่าตัดดูดไขมันหรือ abdominoplasty แยก hASCs และสร้างความแตกต่างของadipocytes ได้ดำเนินการ ตามที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [16,17] โพรโทคอทั้งหมด และกระบวนงานที่ได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการตรวจสอบสถาบัน (#693-2011) ที่จะมหาวิทยาลัยฟลอริดาและมหาวิทยาลัยของรัฐเนแบรสกาลินคอล์น ตรวจสอบผลกระทบของphytochemicals MGP ต่าง ๆ ใน adipocyte สร้างความแตกต่าง (Figs. 2 และ 3), confluentนำวัฒนธรรมของ hASCs (d0 preadipocyte) เพื่อแยกความแตกต่างในปริมาณเพิ่มขึ้นMGP subfraction (0-25 μg/ml NAcy หรือ Acy), หรือ μmol 10 l ของแต่ละบุคคลphytochemicals ของ EA, Quer ของฉัน และ KMP ใน adipocyte มนุษย์ (AM-1ZenBio) ในค็อกเทล 3 วัน (adipocyte ดีง 1 – 3) สร้างความแตกต่าง เมื่อวันที่ 4สร้างความแตกต่าง (d4), มีการเปลี่ยนแปลงสื่อพร้อม AM-1 สดสารพฤกษเคมีโดยไม่สร้างความแตกต่างค็อกเทล แล้วมีเติมกลางสดบวกสารพฤกษเคมีแต่ละวันและเก็บเกี่ยวในวันที่ 10 ของสร้างความแตกต่างอื่น ๆ ทุก ทั้งหมดรักษาได้แห่งดวงควบคุมยานพาหนะ (0.1% DMSO) การทดลองรูปแบบการตรวจสอบผลกระทบของเอการเผาผลาญไขมันใน adipocytes ผู้ใหญ่สรุปใน Fig. 4AHuh7 เซลล์ได้เป็นของขวัญที่ดีจากคิมสูงแจดร. (มหาวิทยาลัยฟลอริดา) เซลล์ Huh7inDulbecco'smodification weremaintained ของ Eagle'smediumcontaining 1 %L glutamine10% FBS, 100 หน่วย/มลยาเพนนิซิลลิน streptomycin 100g/ml 5% CO2 ที่ 37 องศาเซลเซียส2.5. adipocyte ขนาดวัดHematoxylin และ eosin (H & E) -ส่วนทิ้งคราบของเปลว epididymal ได้ใช้สำหรับกำหนดขนาดตามโพรโทคอลประกาศโดย Chen et al. [18] สั้น ๆadipocyte sizewas ตรวจสอบ โดยการวิเคราะห์ภาพดิจิตอลของ H และพาราฟินสี E ส่วน(n = 300 เซลล์/เมาส์ รวม = 1500 – 2000 adipocytes จากกลุ่มหนู/อาหาร 7 – 9) โดยซอฟต์แวร์ภาพ J2.6. ไขมันสะสมชุดการนับ TG เทียบเคียง (BioVision, K622‐100) ถูกใช้เพื่อกำหนดปริมาณเนื้อหา TG ตับตามโพรโทคอของผู้ผลิต การวัดระดับไขมันในเลือดสะสมในมนุษย์ adipocytes และ Huh7 เซลล์ เซลล์ได้คง มี isopropanolและทิ้งคราบด้วยสีแดงน้ำมัน O (ORO) สำหรับการกำหนดเนื้อหาสัมพันธ์ TG ฟิลด์ที่สดใสภาพที่ถ่าย ด้วยกล้องจุลทรรศน์ EVOS XL (AMG), หรือสีโอโรถูกสกัดสำหรับนับ (OD 500 nm)2.7. [3H] -กรด oleic และ [3H] - acetyl CoA ประสานเป็น FFA และ TGวัดอัตรา esterification FA เป็น TG เราตามประกาศก่อนหน้านี้วิธี [19] ในวัฒนธรรมของผู้ใหญ่ adipocytes หรือเซลล์มนุษย์ hepatoma Huh7 สั้น ๆเซลล์ถูก incubated กับน้ำตาลในซีรั่มฟรีต่ำสื่อ (1000 mg/l D-กลูโคส)นอนก่อนทดลอง [3H] -oleic กรด (OA) (เพอร์เอลเมอ ความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.5 μCi/ml ใน 0.5 × 106 เซลล์) เป็น complexed กับ FA ฟรีบีเอสเอ แล้วเพิ่มเซลล์h. 3 ประสาน [3H] -OA เป็น TG ขึ้นเชิงเส้นระยะ 6 h (ข้อมูลไม่แสดง) หลังจากฟักตัว 3-h ด้วย [3H] -OA กลางประกอบด้วย unincorporatedไอโซโทปถูกเอาออก โดยการซักผ้ากับ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS) โครงการโทรศัพท์มือถือได้ขยายเผยแพร่ [20] แล้วบางชั้น chromatography ได้ดำเนินการกับfractionate FFA และ TG และ [3H] ถูกวัด โดยการนับ scintillation เหลว(Beckman LS 6000 Beckman เครื่องมือ ดัลลัส CA, USA) Radioactivity ได้ตามปกติ โดย quantified โดยเทียบเคียง bicinchoninic กรดความเข้มข้นของโปรตีนวิเคราะห์ (เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด IL สหรัฐอเมริกา) สำหรับการประเมินของ de novo สังเคราะห์คล้ายFA [3H] -acetyl CoA (เพอร์เอลเมอ ความเข้มข้นสุดท้ายของ μCi 0.5 ml ในเซลล์ 0.5 × 106)เพิ่มเซลล์สำหรับไอโซโทป h และ unincorporated 3 ถูกเอาออก โดยการซักผ้าด้วยPBS สามครั้ง2.8 การดูดซับกลูโคส 2-deoxy [3H]กำหนดดูดซับกลูโคส และอินซูลินถูกกระตุ้นโรค วัฒนธรรมของผู้ใหญ่มนุษย์ adipocytes ได้ incubated หรือ ไม่ μmol 10 l ของ EA สำหรับ 3 วัน วันก่อนทดลอง วัฒนธรรมถูก incubated มี 1 ml เซรั่มปราศจากโรคปานกลางประกอบด้วย 1000 mg/l D-กลูโคสและ 20 pmol/l มนุษย์อินซูลิน (เทอร์โมวิทยาศาสตร์SH30021.01) ในต่อหน้าของรถหรือรักษา หลังจาก 24 ชมฟรีเซรั่มสื่อสื่อวัฒนธรรมถูกเอาออก และแทนที่ ด้วย ml 1 บัฟเฟอร์ HBSS ประกอบด้วย 100อินซูลินมนุษย์ nmol/l ใน 10 นาที ตาม ด้วยเพิ่ม [3H] -2DOG (เพอร์เอลเมอความเข้มข้นสุดท้ายเป็น μCi 0.5 ml) และบ่มที่ 37 ° C สำหรับดูดซับกลูโคส 90 นาทีถูกยกเลิก โดยเพิ่ม 1 ml ต้องบัฟเฟอร์ [ฉ่ำเครบส์ – Ringers ไบคาร์บอเนต(KRBC) บัฟเฟอร์เสริม ด้วย 25 mmol/l D-กลูโคส] หลังจากการล้างเซลล์ ด้วย KRBCบัฟเฟอร์สามครั้งเพื่อลด radioactivity พื้นหลัง เซลล์ถูก lysed ใน 0.1% SDSดูดซับกลูโคสถูกกำหนด โดยสภาพคล่อง scintillation นับ [21]2.9 อัตราการใช้ออกซิเจนHuh7 เซลล์ถูก seeded เป็นแผ่นใส่โฟมล้างดี 96 ล่างสีดำ(คอร์นทำ) กำหนดอัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) โดย MitoXpress(เคย์เคมี 600800) ตามโพรโทคอลของบริษัทผู้ผลิต สั้น ๆ การเพิ่มสัญญาณ phosphorescent จากโพรบลับของออกซิเจนถูกวัดทุก3 นาทีสำหรับ 5 h โดยใช้เครื่องอ่านหลายโหมด microplate Synergy H1 (BioTek)2.10 การปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสที่เชิงปริมาณมียีนเฉพาะไพรเมอร์สำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเชิงปริมาณ (qPCR)ได้รับจากเทคโนโลยีดีเอ็นเอ (ชิคาโก IL สหรัฐอเมริกา) เป็นอาร์เอ็นเอทั้งหมดของ hASCsแยกต่างหากโดยใช้ Trizol รีเอเจนต์ (Invitrogen) เอา genomic DNA ปนอาร์เอ็นเอได้รับ DNase (Mediatech); แปลง μg 2 ของอาร์เอ็นเอ cDNA ในการปริมาตรรวมของ 20 μl (ชุดการสังเคราะห์ cDNA iScript Bio-Rad) แสดงออกของยีนได้กำหนด โดย qPCR แบบเรียลไทม์ (CFX96 Bio-Rad), และยีนที่เกี่ยวข้องตามปกติ โดย 36B4 (ลำดับรองพื้นตามคำร้องขอ)2.11. เวสเทิร์นคืนในตาวิเคราะห์การเตรียมเนื้อเยื่อ lysates, 0.1 กรัมของเนื้อเยื่อแช่แข็งสแนปถูก homogenized เป็นกลุ่มในฉ่ำริป้าราคาบัฟเฟอร์ (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) รติเอส inhibitors (ซิกมา) และฟอสฟาเตสinhibitors (2 mmol/l Na3VO4, 20 mmol/l β-glycerophosphate และ 10 mmol/l NaF)เปลว lysate มี incubated บนน้ำแข็ง 10 นาทีเอาเค้กไขมัน solidifiedการเตรียมเซลล์รวม lysates, monolayers ของวัฒนธรรมต่าง ๆ ของมนุษย์ adipocytesได้เก็บเกี่ยวกับบัฟเฟอร์ริป้าราคา โปรตีนถูกแบ่งใช้การไล่ระดับ 4% – 15%SDS-หน้า (Biorad), โอนย้ายไปสาร PVDF ด้วยหน่วยโอน semidry(Hoefer TE77X) และ incubated กับแอนตี้ที่เกี่ยวข้อง Chemiluminescence จาก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมี
ในซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) ถูกซื้อ fromCellgro Rosiglitazone (BRL49653) ถูก
ซื้อ fromCayman เคมี กรด ellagic (EA) quercetin (Quer) myricetin (ของฉัน) และ
เฟอรอล (เคเอ็มพี) ได้รับซื้อมาจาก Sigma-Aldrich.
2.2 สัตว์
เนื้อเยื่อไขมันตับและตัวอย่างที่ถูกเก็บรวบรวมจากการศึกษาก่อนหน้านี้ [13].
สั้น ๆ , ชาย C57BL / 6 หนูที่ถูกเลี้ยงด้วยอาหารไขมันต่ำ (LF) ไขมันสูง (HF; กิโลแคลอรี 60% จากไขมัน)
อาหารเพียงอย่างเดียวหรือ HF บวก 0.4% MGP เป็นเวลา 15 สัปดาห์ที่ผ่านมา ส่วนประกอบของอาหารที่พบใน Gourineni
et al, [13] ในช่วงเวลาของการชันสูตรศพไขมัน epididymal แยกสดและเนื้อเยื่อตับเป็น
ทั้งการแก้ไขในไฮด์บัฟเฟอร์ 10% สำหรับการฝังพาราฟินหรือสแน็ปแช่แข็งด้วย
ไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส โปรโตคอลทั้งหมดและขั้นตอนการได้รับอนุมัติจาก
สถาบันการดูแลสัตว์และการใช้คณะกรรมการที่มหาวิทยาลัยฟลอริด้า.
2.3 การจัดทำและ MGP subfractionation
เตรียมและองค์ประกอบของ MGP ได้รับการอธิบาย [13] สั้น ๆ , MGPs ถูก
จัดทำขึ้นจากองุ่น muscadine โนเบิลโดยการสกัดกรดเมทานอล (0.5% อะซิติก
กรด) และการทำให้บริสุทธิ์ตามมาโดยใช้คอลัมน์ Amberlite FPX66 (Rohm Hass)
subfractionation ของ MGP เข้าไปในที่ไม่ anthocyanin (Nacy) และ anthocyanin (Acy) ได้รับการ
เสร็จสิ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15] การวิเคราะห์องค์ประกอบของพฤกษเคมีของ
Nacy ได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับระบบ Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies) สั้น ๆ
จำนวน 5 มิลลิกรัม Nacy ใน 1 มิลลิลิตรของ HCl / แก้ปัญหาเมทานอล (1: 1) ได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี HPLC
โดยใช้ Agilent Zorbax Stablebond คอลัมน์ SB-C18 (250 × 4.6 มมมมอนุภาค 5 ไมครอน
ขนาด) เฟสเคลื่อนที่ไบนารีประกอบด้วย 0.5% กรดน้ำ (A) และ
acetonitrile (B); อัตราการไหลเป็นมิลลิลิตร / นาทีและการไล่ระดับสี 25 นาทีถูกนำมาใช้ (
ลาดเป็น 0-5 นาที 10% -30% B, 5-10 นาที 30% -40% B 10-20 นาที 40% -50% B,
20-23 นาที 50% -70% B, 23-25 ​​นาที 70% -100% B ตามด้วย 5 นาทีของ
reequilibration ของคอลัมน์ก่อนที่จะวิ่งต่อไป) สำหรับการตรวจจับคลื่น
อีเอและ flavonols เป็น 360 นาโนเมตรโดยใช้ UV-Vis ตรวจจับอาร์เรย์ไดโอด (รูป. 3A).
2.4 การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษาพฤกษเคมี
สำหรับการแยกเซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์ที่ได้มาจากไขมัน (hASCs) ไขมันในช่องท้อง
เนื้อเยื่อที่ได้รับจากหญิงที่มีค่าดัชนีมวลกายของ ~ 30 กก. / m2 ในระหว่างการ
ดูดไขมันหรือการผ่าตัด abdominoplasty แยก hASCs และความแตกต่างของ
adipocytes ได้ดำเนินการในขณะที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้า [16,17] โปรโตคอลทั้งหมดและ
ขั้นตอนการได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบสถาบัน (# 693-2011) ที่
มหาวิทยาลัยฟลอริด้าและ University of Nebraska-Lincoln เพื่อศึกษาผลของ
MGP phytochemicals แตกต่างกันในความแตกต่างของ adipocyte (มะเดื่อ. 2 และ 3) ไหลมารวมกัน
ของวัฒนธรรม hASCs (d0 preadipocyte) ที่ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดความแตกต่างในปริมาณที่เพิ่มขึ้น
ของ MGP subfraction (0-25 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร Nacy หรือ Acy) หรือ 10 ไมโครโมล / ลิตรของแต่ละ
phytochemicals ของอีเอ Quer ของฉันและ KMP ในสื่อ adipocyte มนุษย์ (AM-1
ZenBio) ความแตกต่างในค๊อกเทลเป็นเวลา 3 วัน (D1-d3 adipocyte) เมื่อ 4 วันของ
ความแตกต่าง (d4) กลางได้รับการเปลี่ยนแปลงกับ AM-1 บวกพฤกษเคมีสด
โดยไม่ต้องแตกต่างค๊อกเทล ขนาดกลางได้รับการเติมเต็มแล้วด้วยนอกจากนี้ใหม่ของ
แต่ละพฤกษเคมีทุกวัน ๆ และเก็บเกี่ยวในวันที่ 10 ของความแตกต่าง ทั้งหมด
ได้รับการรักษาขนานกับการควบคุมคัน (0.1% DMSO) การทดลอง
การออกแบบเพื่อศึกษาผลของ EA ในการเผาผลาญไขมันใน adipocytes ผู้ใหญ่จะ
สรุปในรูป 4A.
เซลล์ Huh7 เป็นของที่ระลึกจากดรชนิด Jae Sung คิม (มหาวิทยาลัยฟลอริด้า) เซลล์ Huh7
weremaintained inDulbecco'smodification ของ Eagle'smediumcontaining 1% L-glutamine,
10% FBS 100 หน่วย / ยาปฏิชีวนะมล., 100 กรัม / มล. ใน streptomycin CO2 5% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส.
2.5 adipocyte ขนาดวัด
Hematoxylin และ Eosin (H & E) -stained ในส่วนของเนื้อเยื่อไขมัน epididymal ถูก
นำมาใช้สำหรับการกำหนดขนาดโดยทำตามโปรโตคอลที่ตีพิมพ์โดยเฉินและอัล [18] สั้น ๆ ,
adipocyte sizewas การตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ภาพดิจิตอลของ H & E-สีส่วนพาราฟิน
(n = 300 เซลล์ / เมาส์รวม = 1500-2000 adipocytes 7-9 หนู / กลุ่มอาหาร) โดยใช้
ซอฟแวร์ภาพเจ.
2.6 การสะสมไขมัน
สีชุดปริมาณ TG (BioVision, K622-100) ถูกใช้ในการวัดปริมาณ
เนื้อหา TG ตับตามโปรโตคอลของผู้ผลิต การวัดไขมัน
สะสมใน adipocytes มนุษย์และเซลล์ Huh7 เซลล์ได้รับการแก้ไขด้วย isopropanol
และย้อมด้วยสีน้ำมันโอสีแดง (ORO) สำหรับการกำหนดเนื้อหา TG ญาติฟิลด์สดใส
ภาพถูกถ่ายโดยกล้องจุลทรรศน์ EVOS XL (AMG) หรือสีย้อม ORO ถูกสกัดสำหรับ
ปริมาณ (OD 500 นาโนเมตร).
2.7 [3H] กรด -oleic และ [3H] -acetyl CoA การรวมตัวกันเข้ามาปรับปรุงคุณภาพและ TG
การวัดอัตราการ esterification เอฟเอเข้า TG เราใช้เผยแพร่ก่อนหน้านี้
วิธีการ [19] ในวัฒนธรรมของ adipocytes ผู้ใหญ่หรือเซลล์ตับของมนุษย์ Huh7 สั้น ๆ ,
เซลล์ถูกบ่มด้วยเซรั่มฟรีสื่อระดับน้ำตาลต่ำ (1000 mg / l D-กลูโคส)
ในชั่วข้ามคืนก่อนการทดลอง [3H] กรด -oleic (OA) (Perkin Elmer; เข้มข้นสุดท้าย
0.5 μCi / มล. ใน 0.5 × 106 เซลล์) ได้รับการ complexed กับบีเอสเอเอฟเอฟรีแล้วเพิ่มไปยังเซลล์สำหรับ
3 ชั่วโมง รวมตัวกันของ [3H] -OA เข้า TG เพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงในระยะเวลา 6 ชั่วโมง (ข้อมูลไม่
แสดง) หลังจากการบ่ม 3 ชั่วโมงกับ [3H] -OA กลางที่มีหน่วยงาน
ไอโซโทปจะถูกลบออกโดยการล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) ไขมันเซลลูลาร์
ถูกสกัดการตีพิมพ์ [20] แล้วชั้นบางโคได้รับการดำเนินการเพื่อ
ปรับปรุงคุณภาพและ fractionate TG และ [3H] โดยวัดจากการนับประกายเหลว
(แอลเอเบคค์ 6000; เครื่องมือเบคค์, พาโลอัลโต, CA, USA) กัมมันตภาพรังสีก็
ปกติโดยความเข้มข้นของปริมาณโปรตีนโดยสีกรด bicinchoninic
ทดสอบ (เพียร์ซ, ฟอร์ด, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) ในทำนองเดียวกันการวัดการสังเคราะห์โนโวของ
เอฟเอ [3H] -acetyl CoA (Perkin Elmer; เข้มข้นสุดท้าย 0.5 μCi / มล. ใน 0.5 × 106 เซลล์)
ถูกบันทึกอยู่ในเซลล์เป็นเวลา 3 ชั่วโมงและไอโซโทปหน่วยงานจะถูกลบออกโดยการล้างด้วย
พีบีเอสสามครั้ง.
2.8 [3H] การดูดซึม 2 Deoxy กลูโคส
การตรวจสอบฐานและการดูดซึมกลูโคสอินซูลินกระตุ้นวัฒนธรรมของผู้ใหญ่
adipocytes มนุษย์ถูกบ่มที่มีหรือไม่มี 10 ไมโครโมล / ลิตรอีเอเป็นเวลา 3 วัน วัน
ก่อนการทดลองวัฒนธรรมถูกบ่มกับสื่อพื้นฐานในซีรั่มฟรี 1 มล.
ที่มี 1,000 มิลลิกรัม / ลิตร D-กลูโคสและ 20 pmol / ลิตรอินซูลินของมนุษย์ (เทอร์โมวิทยาศาสตร์;
SH30021.01) ในการปรากฏตัวของยานพาหนะหรือการรักษา หลังจาก 24 ชั่วโมงในสื่อเซรั่มฟรี
สื่อวัฒนธรรมถูกลบออกไปและแทนที่ด้วย 1 มิลลิลิตรของ buffer HBSS มี 100
nmol / ลิตรอินซูลินของมนุษย์เป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยการเพิ่มของ [3H] -2DOG (Perkin Elmer;
เข้มข้นสุดท้ายคือ 0.5 μCi / ml) และการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 นาที การดูดซึมกลูโคส
ถูกยกเลิกโดยการเพิ่ม 1 มิลลิลิตรของ buffer หยุด [เย็น Krebs-Ringers ไบคาร์บอเนต
(KRBC) กันชนเสริมด้วย 25 มิลลิโมล / ลิตร D-กลูโคส] หลังจากล้างเซลล์ที่มี KRBC
บัฟเฟอร์สามครั้งเพื่อลดรังสีพื้นหลังเซลล์ถูก lysed ใน 0.1% SDS.
การดูดซึมกลูโคสถูกกำหนดโดยการนับประกายเหลว [21].
2.9 อัตราการใช้ออกซิเจน
เซลล์ Huh7 เมล็ดลงใน 96 หลุมที่ชัดเจนด้านล่างสีดำแผ่นสไตรีนหมัน
(Corning) อัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) ถูกกำหนดโดยใช้ MitoXpress
(เคย์แมนเคมี 600800) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต สั้น ๆ ,
การเพิ่มขึ้นของสัญญาณเรืองแสงจากหัววัดออกซิเจนที่ไวต่อการวัดทุก
3 นาทีเป็นเวลา 5 ชั่วโมงโดยใช้ Synergy H1 โหมดหลายผู้อ่าน microplate (Biotek).
2.10 ห่วงโซ่ปฏิกิริยาโพลิเมอร์ปริมาณ
ไพรเมอร์โดยเฉพาะยีนปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์เชิงปริมาณ (qPCR) ได้รับ
ที่ได้รับจากดีเอ็นเอแบบบูรณาการเทคโนโลยี (ชิคาโก, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) รวมอาร์เอ็นเอของ hASCs ถูก
แยกโดยใช้น้ำยา Trizol (Invitrogen) ในการลบปนเปื้อนดีเอ็นเอจีโนม
อาร์เอ็นเอได้รับการรักษาด้วย DNase (Mediatech); 2 ไมโครกรัมของ RNA ถูกดัดแปลงเป็นยีนใน
ปริมาณรวมของ 20 ไมโครลิตร (ชุดการสังเคราะห์ยีน iScript; Bio-Rad) การแสดงออกของยีนที่ถูก
กำหนดโดยเรียลไทม์ qPCR (CFX96; Bio-Rad) และการแสดงออกของยีนที่สัมพันธ์ก็
ปกติโดย 36B4 (ลำดับไพรเมอร์มีให้บริการตามคำขอ).
2.11 การวิเคราะห์ดวงตะวัน
เพื่อเตรียมความพร้อม lysates เนื้อเยื่อ 0.1 กรัมของเนื้อเยื่อสแนปอินแช่แข็งก็หดหายในเย็น
บัฟเฟอร์ RIPA (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) กับน้ำย่อยโปรตีน (ซิกม่า) และฟอสฟา
สารยับยั้ง (2 มิลลิโมล / ลิตร Na3VO4 20 มิลลิโมล / ลิตรβ-glycerophosphate และ 10 มิลลิโมล / ลิตร NaF).
lysate เนื้อเยื่อไขมันถูกบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาทีที่จะเอาเค้กไขมันแข็ง.
เพื่อเตรียมความพร้อม lysates เซลล์รวม monolayers ของวัฒนธรรมที่แตกต่างของมนุษย์ adipocytes
เก็บเกี่ยวกับบัฟเฟอร์ RIPA โปรตีนถูก fractionated โดยใช้ 4% -15% ลาด
SDS-PAGE (Biorad) โอนไปยังเยื่อ PVDF กับหน่วยโอน semidry
(Hoefer TE77X) และบ่มกับแอนติบอดีที่เกี่ยวข้อง chemiluminescence จาก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สารเคมี
ครรภ์วัว เซรั่ม ( FBS ) ซื้อ fromcellgro . โรสิกลีตาโซน ( brl49653 ) คือ
ซื้อ fromcayman เคมี ลาจิค แอซิด ( EA ) , เคอร์ ( Brandenburg ) ไมริซีทิน ( ของฉัน ) และ
แคมเฟอรอล ( kmp ) ซื้อจาก ซิกม่า Aldrich .
2.2 . สัตว์
เนื้อเยื่อไขมันและตับ โดยเก็บตัวอย่างจากการศึกษาก่อนหน้า [ 13 ] .
สั้น ๆชาย c57bl / 6 หนูกินอาหารไขมันต่ำ ( LF ) , ไขมันสูง ( HF ; 60% แคลอรี่จากไขมัน )
อาหารคนเดียวหรือ HF บวก mgp 0.4% เป็นเวลา 15 สัปดาห์ องค์ประกอบของอาหารที่พบใน gourineni
et al . [ 13 ] เวลาที่สดใหม่และสาเหตุที่แยกไขมันดันเนื้อเยื่อตับคือ
ให้คงที่ 10% ฟอร์มาลดีไฮด์ในพาราฟินหรือฝัง snap แช่แข็งด้วย
ไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่− 80 องศาขั้นตอนและวิธีการได้รับการอนุมัติโดย
สถาบันการดูแลสัตว์และใช้คณะกรรมการที่มหาวิทยาลัยฟลอริดา .
2.3 การเตรียม mgp และการเตรียม subfractionation
และองค์ประกอบของ mgp ได้รับการอธิบาย [ 13 ] สั้น ๆ , mgps ถูก
ที่เตรียมจากโนเบิล muscadine องุ่นสกัดเมทานอล ( 0.5% ปรับกรด
กรด ) และต่อมาการใช้สารละลาย fpx66 คอลัมน์ ( Rohm แฮส )
subfractionation ของแอนโทไซยานิน ( mgp เข้าไม่เนซี่ ) และแอนโธไซยานิน ( มีคุณสมบัติ ) คือ
แล้วเสร็จตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 15 ] การวิเคราะห์องค์ประกอบทางพฤกษเคมีของ
เนซี่แสดงในระบบ ( Agilent เทคโนโลยี Agilent 1200 กรัม ) สั้น ๆ ,
รวม 5 มิลลิกรัม เนซี่ ใน 1 มิลลิลิตร สารละลาย HCl / เมทานอล ( 11 ) วิเคราะห์โดย HPLC
ใช้เลนต์ zorbax stablebond sb-c18 คอลัมน์ ( 250 มม. × 4.6 มม. , 5 - μ M อนุภาค
ขนาด ) ระยะเคลื่อนที่ไบนารีประกอบด้วยสารละลาย 0.5% กรดฟอร์มิก ( A ) และ ( B )
ไน ; อัตราการไหลเท่ากับมิลลิลิตรต่อนาทีและ 25 นาทีการใช้สี (
0 – 5 นาที 10 % - 30 % B , 5 – 10 นาที 30 % - 40 % B 10 – 20 นาที 40 % และ 50 % B ,
20 – 23 นาที 50 % - 70 % B23 – 25 นาที 70 % - 100 % B , ตามด้วย 5 นาที
reequilibration ของคอลัมน์ก่อนวิ่งต่อไป ) แสงตรวจจับ
EA และ flavonols คือ 360 nm ใช้ UV Vis ไดโอดและอาร์เรย์เครื่อง ( รูปที่ 3 ) .
2.4 . การเพาะเลี้ยงเซลล์และ
รักษาไฟเพื่อแยกมนุษย์ไขมันได้มาสเต็มเซลล์ ( hascs หน้าท้องไขมัน
)เนื้อเยื่อที่ได้รับจากผู้ที่มีดัชนีมวลกาย 30 kg / m2
~ ระหว่างดูดไขมันหรือการผ่าตัดกระทง . การแยกและความแตกต่างของ hascs
ได้ที่มีวัตถุประสงค์ที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ อันเป็น ] โปรโตคอลและ
ขั้นตอนที่ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบสถาบัน ( # 693-2011 ) ที่
มหาวิทยาลัยฟลอริดาและมหาวิทยาลัยเนแบรสกาลิงคอล์นเพื่อศึกษาผลของ phytochemicals ในความแตกต่าง
แตกต่างกัน mgp อะดิโปซัยท์ ( Figs 2 และ 3 ) วัฒนธรรมของ hascs กระจู๋กระจี๋
( + preadipocyte ) ที่มีความแตกต่างในการเพิ่มปริมาณของ subfraction mgp
( 0 - 25 μ g / ml เนซี่ หรือมีคุณสมบัติ ) หรือ 10 μ mol / L ของบุคคล
phytochemicals ของ EA โรของฉันกับ kmp ขนาดกลาง ( am-1 อะดิโปซัยท์ของมนุษย์
,zenbio ) ในการผสม 3 วัน ( D1 และ D3 อะดิโปซัยท์ ) เมื่อ 4 วัน
ความแตกต่าง ( D4 ) กลางก็เปลี่ยนด้วย am-1 บวก
ไฟสดโดยไม่มีความแตกต่างหลากหลาย ) แล้วเติมด้วยนอกจากนี้ใหม่ของ
แต่ละไฟทุกวัน และเก็บเกี่ยวได้ในวันที่ 10 ของการ . ทั้งหมดปลูกขนานกับการควบคุมยานพาหนะ
( 0.1% DMSO )การออกแบบการทดลองเพื่อศึกษาผลของ EA
ต่อการเมแทบอลิซึมในผู้ใหญ่ได้ที่เป็น
สรุปในรูปที่ 4a
huh7 cells ของขวัญชนิดจาก ดร. เจซุง คิม ( มหาวิทยาลัยฟลอริดา ) huh7 เซลล์
weremaintained indulbecco'smodification ของ eagle'smediumcontaining 1 % L Glutamine ,
10% FBS , 100 หน่วยต่อมิลลิลิตร เพนนิซิลิน , 100 g / ml streptomycin ในคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ที่ 37 ° C .
2.5
การวัดขนาดอะดิโปซัยท์ย้อมและ eosin ( H & E ) - ย้อม ส่วนดันเนื้อเยื่อไขมันถูก
ใช้สำหรับการกำหนดขนาดตามเผยแพร่พิธีสารโดย Chen et al . [ 18 ] สั้น ๆ ,
อะดิโปซัยท์ sizewas ตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ภาพดิจิตอลของ H & e-stained ส่วนพาราฟิน
( n = 300 เซลล์ / เมาส์ , รวม = 1500 - 2000 ได้ที่จาก 7 – 9 กลุ่มไมซ์ / อาหาร ) โดยการใช้ซอฟต์แวร์ภาพ J
.
2.6
การสะสมไขมันที่ TG ปริมาณ 7.4 ชุด ( biovision k622 ‐ , 100 ) ถูกใช้เพื่อวัดปริมาณ
ตับ TG เนื้อหาตามขั้นตอนของผู้ผลิต เพื่อวัดการสะสมไขมัน
ในได้ที่มนุษย์และ huh7 เซลล์ เซลล์ก็แก้ด้วยไอโซโพรพานอล
และเปื้อนน้ำมันสีแดง O ( ทอง ) สำหรับการหาญาติ TG เนื้อหา ภาพสดใสฟิลด์
โดน โวส XL กล้องจุลทรรศน์ ( AMG )หรือโอโรสีถูกสกัดให้
( OD ปริมาณ 500 nm ) .
2.7 . [ 3 ] - กรดโอเลอิก และ [ 3 ] - อะเซทิลโคยาเข้าไปใน FFA และ TG
เพื่อวัดอัตราปฏิกิริยาเอสเทอริฟิเคชันฟ้าเป็น TG เราตามวิธีการเผยแพร่ก่อนหน้านี้
[ 19 ] ในวัฒนธรรมของผู้ใหญ่ huh7 ได้ที่หรือเซลล์ตับมนุษย์ สั้น ๆ ,
เซลล์มีการแยก serum-free สื่อกลูโคสต่ำ ( 1000 mg / l ดี กูลโคส )
ค้างคืนก่อนการทดลอง [ 3 ] - กรดโอเลอิก ( OA ) ( เพอร์กินเอลเมอร์ ;
ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 μ CI 0.5 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร ) คือ complexed กับเอฟเอเอฟรี แล้วเพิ่มไปยังเซลล์สำหรับ
3 H . ประสาน [ 3 ] - OA ใน TG เพิ่มขึ้นเฉลี่ยกว่า 6-h ระยะเวลา ( ข้อมูลไม่
แสดง ) หลังจาก 3-h บ่มด้วย [ 3 ] - โอเอ ขนาดกลาง ที่มีหน่วยงาน
ไอโซโทปถูกลบออกโดยล้างด้วยเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( PBS ) ไขมันเซลล์
สกัดเผยแพร่ [ 20 ] แล้วข้อเหวี่ยงได้
fractionate FFA และ TG และ [ 3 ] วัดจากของเหลวประกายนับ
( เบคมี 6000 เครื่องมือ พาโล อัลโต แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา เบคแมน ) กัมมันตภาพรังสีคือ
ปกติ โดยโปรตีนปริมาณกรดโดย bicinchoninic 7.4
assay ( เพียร์ซ , Rockford , IL , USA ) ในทำนองเดียวกันสำหรับการวัดของเดอโนโวสังเคราะห์
ฟ้า [ 3 ] - อะ COA ( เพอร์กินเอลเมอร์ ; ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 μ CI 0.5 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร )
ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ 3 H และหน่วยงานที่ออกโดยไอโซโทปกับเครื่องซักผ้า
PBS 3 ครั้ง
2.8 . [ 3 ] 2-deoxy-glucose การดูดซึม