for subsequent analyses. Aliquots o

for subsequent analyses. Aliquots of the combined homogenates containing
a total of 6 μg of branchial protein were added to 1× NuPAGE
LDS Sample Buffer (Life Technologies Australia, Mulgrave, Victoria,
Australia) and then denatured at 70 °C for 10 min before being loaded
in triplicate into 4–12% Bis–Tris gels (Novex, Life Technologies
Australia) and electrophoresed at 200 V for 45 min (XCell SureLock®
Mini, Life Technologies Australia). Samples were then transferred from
the gels to 0.45 μm Invitrolon PVDF membranes at 35 V for 90 min in
an XCell II™ Blot Module (Life Technologies Australia). Membranes
were blocked with 5% skim milk in TBST and then incubated in primary
antibody (αRB1 1:1000 in TBST) for 60 min at room temperature. A
biotinylated goat anti-rabbit secondary antibody (1:2000, Antibodies
Australia) was then applied to membranes for 60 min at room
temperature. A HRP-streptavidin conjugate (1:1000 in TBST; Vector
Laboratories, USA) was added to themembranes for 30min followed
by the chromagen 3,3′-Diaminobenzidine (DAB). Membranes were
washed and dried and digitised using a Canon flatbed scanner.
Densitometric analysis of bands was conducted using Quantity One
software (Bio-Rad, Gladesville, NSW, Australia).
3. Statistics
All data are presented as means ± the standard error of the mean
(SE). Plasma osmolality, solute concentrations and tissue-specific NKA
activity were analysed by one-way ANOVA and pairwise post hoc t-tests
(Holm adjusted alpha level). Rectal gland masses were compared
across treatments using ANCOVA with body mass as the co-variate.
Within salinity treatments, plasma osmolality and environmental
osmolality were compared using one-sample t-tests. All analyses
were run using R (R Core Team, 2013).
4. Results
4.1. Haematocrit and plasma solute concentrations
HCT did not show significant variation between 25‰(11.18±2.13%),
34‰(13.95 ± 0.65%) and 40‰ (15.01 ± 1.2%) acclimated C. punctatum
(ANOVA F2, 12=1.57, P = 0.25; Table 2). Environmental salinity significantly
influenced plasma osmolality (ANOVA F2, 12 = 369.9, P =
1.65e−11; Fig. 1B) with osmolality of animals acclimated to 40‰
(1153 ± 6 mOsm kg−1) significantly higher than sharks acclimated to
either 25‰ (787 ± 6 mOsm kg−1) or 34‰ (1019 ± 10 mOsm kg−1)
(P=1.6e−11 and P=3.5e−7, respectively). Plasma osmolality of sharks
in the 25‰ treatment was also significantly lower than those from the
34‰ group (P =6.5e−10). Sharks maintained plasma osmolalities that
were either isosmotic with the environment (34‰) or higher than the
environment (25‰ and 40‰) (Fig. 1). Acclimation salinity significantly
affected the concentration of Na+, Cl− and urea in the plasma (ANOVA,
Na+: F2,12 = 18.91, P = 1.95 e−4; Cl−: F2,12 = 8.5, P = 0.005; urea:
F2,12 = 37.3, P = 7.08e−6; Table 2). In all cases, ion and urea concentrations
were highest in the 40‰ treatment and lowest in the 25‰
treatment. A significant effect of salinity on K+ ion concentration within
the plasma was not observed (ANOVA F2, 12 = 0.94, P = 0.42; Table 2).
4.2. Branchial and rectal gland NKA activity
There was no effect of salinity on the mass of the rectal gland after
correcting for the effect of body mass (ANCOVA, F(2, 11) = 0.1322,
P = 0.8775). There was no significant effect of environmental salinity
on the specific activity of the enzyme NKA in either rectal gland
(ANOVA F2, 12 = 0.223, P = 0.80; Fig. 2A) or branchial tissue (ANOVA
F2, 12 = 1.57, P = 0.248, Fig. 2B). In all treatments, NKA activity was
almost ten-fold higher in the rectal gland relative to the gills.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์ภายหลัง Aliquots บรรจุรวม homogenatesจำนวน μg 6 โปรตีน branchial เพิ่มเข้า 1 × NuPAGEแอลดีเอสอย่างบัฟเฟอร์ (ชีวิตเทคโนโลยีออสเตรเลีย Mulgrave, Victoriaออสเตรเลีย) และ denatured ที่ 70 ° C สำหรับ 10 นาทีก่อนที่จะโหลดใน triplicate เป็นเจ Bis-ตรี 4 – 12% (Novex เทคโนโลยีชีวิตออสเตรเลีย) และ electrophoresed 200 V สำหรับ 45 นาที (XCell SureLock ®มินิ ออสเตรเลียเทคโนโลยีชีวิต) ตัวอย่างแล้วโอนย้ายมาจากเจกับ μm 0.45 Invitrolon PVDF เข้าที่ 35 V สำหรับ 90 นาทีในการ™ XCell II คืนในตาโมดูล (ชีวิตเทคโนโลยีออสเตรเลีย) เยื่อหุ้มถูกบล็อค ด้วย 5% skim นมใน TBST และ incubated แล้ว ในหลักแอนติบอดี (αRB1 1:1000 ใน TBST) ใน 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง Abiotinylated แพะกระต่ายป้องกันรองแอนติบอดี (1:2000 แอนตี้ออสเตรเลีย) ได้แล้วใช้สารสำหรับห้อง 60 นาทีอุณหภูมิ ค่าสังยุค HRP streptavidin (1:1000 ใน TBST เวกเตอร์ห้องปฏิบัติการ สหรัฐอเมริกา) ถูกเพิ่มเข้าไป themembranes ใน 30 นาทีตามโดย chromagen 3, 3′-Diaminobenzidine (เล็กน้อย) มีเยื่อหุ้มหิน และแห้ง และ digitised ใช้สแกนเนอร์สแกนเนอร์แคนนอนการวิเคราะห์ densitometric ของวงถูกดำเนินการโดยใช้ปริมาณหนึ่งซอฟต์แวร์ (Bio Rad, Gladesville นิวเซาธ์เวลส์ ออสเตรเลีย)3. สถิติข้อมูลทั้งหมดจะแสดงเป็นหมายความว่า ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย±(SE) พลาสม่า osmolality ความเข้มข้นของตัวถูกละลาย และเนื้อเยื่อเฉพาะ NKAกิจกรรมถูก analysed โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวและแบบเฉพาะกิจลงแพร์ไวส์ t-ทดสอบ(Holm ปรับปรุงระดับอัลฟา) มีการเปรียบเทียบมวลชนต่อมไส้ในการรักษาโดยใช้ ANCOVA มีมวลกายเป็น variate ร่วมภายในเค็มรักษา พลาสม่า osmolality และสิ่งแวดล้อมosmolality ถูกเปรียบเทียบโดยใช้ t-ทดสอบตัวอย่างหนึ่ง วิเคราะห์ทั้งหมดถูกเรียกใช้โดยใช้ R (R Core ทีม 2013)4. ผลลัพธ์4.1 ความเข้มข้นตัว Haematocrit และพลาสม่าHCT ไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง 25‰(11.18±2.13%)34‰ (13.95 ± 0.65%) และ 40‰ (15.01 ± 1.2%) acclimated C. punctatum(การวิเคราะห์ความแปรปรวน F2, 12 = 1.57, P = 0.25 ตาราง 2) เค็มสิ่งแวดล้อมอย่างมีนัยสำคัญผลพลาสม่า osmolality (การวิเคราะห์ความแปรปรวน F2, 12 = 369.9, P =1.65e−11 Fig. 1B) มี osmolality ของสัตว์ acclimated เพื่อ 40‰(1153 ± 6 mOsm kg−1) อย่างมีนัยสำคัญสูงกว่าปลาฉลาม acclimated เพื่อ25‰ (787 ดรีม± 6 mOsm kg−1) หรือ 34‰ (1019 ± 10 mOsm kg−1)(P = 1.6e−11 และ P = 3.5e−7 ตามลำดับ) พลาสม่า osmolality ของฉลามใน 25‰ การ รักษานั้นยังต่ำกว่าจากการกลุ่ม 34‰ (P = 6.5e−10) ปลาฉลามรักษาพลา osmolalities ที่ถูก isosmotic กับสิ่งแวดล้อม (34‰) หรือสูงกว่าสิ่งแวดล้อม (25‰ และ 40‰) (Fig. 1) Acclimation เค็มมากความเข้มข้นของ Na + Cl− และ urea ในพลาสมา (การวิเคราะห์ความแปรปรวน การได้รับผลกระทบนา +: F2, 12 = 18.91, P = 1.95 e−4 Cl−: F2, 12 = 8.5, P = 0.005 urea:F2, 12 = 37.3, P = 7.08e−6 ตาราง 2) ในทุกกรณี ความเข้มข้นไอออนและยูเรียอยู่สูงสุด ในการรักษา 40‰ และต่ำสุด 25‰รักษา สำคัญผลของเค็ม K + ไอออนสมาธิภายในพลาสม่าไม่ได้ถูกตรวจสอบ (การวิเคราะห์ความแปรปรวน F2, 12 = 0.94, P = 0.42 ตาราง 2)4.2. branchial และไส้ต่อม NKA กิจกรรมมีผลไม่เค็มใหญ่ของต่อมไส้หลังการแก้ไขสำหรับผลของร่างกายโดยรวม (ANCOVA, F (2, 11) = 0.1322P = 0.8775) มีไม่มีผลที่สำคัญของสิ่งแวดล้อมเค็มในกิจกรรมของเอนไซม์ NKA ในต่อมทั้งสองไส้(การวิเคราะห์ความแปรปรวน F2, 12 = 0.223, P = 0.80 Fig. 2A) หรือเนื้อเยื่อ branchial (การวิเคราะห์ความแปรปรวนF2, 12 = 1.57, P = 0.248, Fig. 2B) ในการรักษาทั้งหมด มีกิจกรรม NKAten-fold เกือบสูงในต่อมไส้สัมพันธ์ gills

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับการวิเคราะห์ที่ตามมา aliquots ของ homogenates รวมกันมี
จำนวน 6 ไมโครกรัมของโปรตีน branchial ถูกเพิ่มเข้าไปใน 1 × NuPAGE
โบถส์ตัวอย่างบัฟเฟอร์ (ไลฟ์เทคโนโลยีส์ออสเตรเลีย Mulgrave วิกตอเรีย
ออสเตรเลีย) แล้วเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีก่อนที่จะถูกโหลด
เข้าไปในเพิ่มขึ้นสามเท่า 4-12% เจล Bis-Tris (Novex ชีวิตเทคโนโลยี
ออสเตรเลีย) และ electrophoresed ที่ 200 V 45 นาที (XCell SureLock®
มินิไลฟ์เทคโนโลยีส์ออสเตรเลีย) ตัวอย่างจากนั้นก็ย้ายจาก
เจล 0.45 ไมโครเมตร Invitrolon เยื่อ PVDF ที่ 35 V 90 นาทีใน
XCell II ™ Blot Module (ไลฟ์เทคโนโลยีส์ออสเตรเลีย) เยื่อ
ถูกบล็อก 5% นมพร่องมันเนยใน TBST และบ่มแล้วในเบื้องต้น
แอนติบอดี (αRB1ที่ 1: 1,000 ใน TBST) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
biotinylated ป้องกันแพะกระต่ายรองแอนติบอดี (1: 2000, แอนติบอดี
ออสเตรเลีย) ถูกนำมาใช้แล้วที่แผ่นเยื่อ 60 นาทีที่ห้อง
อุณหภูมิ ผัน HRP-streptavidin (1: 1,000 ใน TBST; เวกเตอร์
ห้องปฏิบัติการ, สหรัฐอเมริกา) ถูกบันทึกอยู่ใน themembranes สำหรับ 30 นาทีตาม
ด้วยการ chromagen 3,3'-diaminobenzidine (DAB) เยื่อถูก
ล้างและแห้งและดิจิตอลโดยใช้เครื่องสแกนแบบแท Canon.
วิเคราะห์ Densitometric ของวงดนตรีที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้จำนวนหนึ่ง
ซอฟต์แวร์ (Bio-Rad, Gladesville, NSW, ออสเตรเลีย).
3 สถิติ
ข้อมูลทั้งหมดจะถูกนำเสนอเป็นหมายถึง±ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย
(SE) พลาสม่า osmolality ความเข้มข้นของตัวถูกละลายและเนื้อเยื่อเฉพาะ NKA
กิจกรรมการวิเคราะห์ทางเดียว ANOVA และโพสต์เฉพาะกิจคู่เสื้อทดสอบ
(โฮล์มปรับระดับอัลฟา) ฝูงต่อมทวารหนักเปรียบเทียบ
ข้ามการรักษาโดยใช้ ANCOVA กับมวลกายเป็นผู้ร่วม variate.
ภายในการรักษาความเค็ม osmolality พลาสม่าและสิ่งแวดล้อม
osmolality ถูกนำมาเปรียบเทียบโดยใช้หนึ่งในตัวอย่างเสื้อทดสอบ การวิเคราะห์ทั้งหมด
ได้รับการทำงานโดยใช้ R (R ทีมแกน 2013).
4 ผล
4.1 ฮีมาโตและความเข้มข้นของตัวถูกละลายพลาสม่า
HCT ไม่ได้แสดงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง 25 ‰ (11.18 ± 2.13%)
34 ‰ (13.95 ± 0.65%) และ 40 ‰ (15.01 ± 1.2%) ปรับตัวซี punctatum
(ANOVA F2, 12 = 1.57, p = 0.25; ตารางที่ 2) ความเค็มสิ่งแวดล้อมอย่างมีนัยสำคัญ
อิทธิพล osmolality พลาสม่า (ANOVA F2, 12 = 369.9, P =
1.65e-11. รูปที่ 1B) กับ osmolality ของสัตว์ที่ปรับตัวถึง 40 ‰
(1,153 ± 6 mOsm กิโลกรัม 1) สูงกว่าปลาฉลามปรับตัว
ทั้ง 25 ‰ (787 ± 6 mOsm กิโลกรัม 1) หรือ 34 ‰ (1,019 ± 10 mOsm กิโลกรัม 1)
(P = 1.6e-11 และ P = 3.5e-7 ตามลำดับ) พลาสม่า osmolality ของปลาฉลาม
ใน 25 ‰การรักษาก็ยังต่ำกว่าผู้ที่มาจาก
34 ‰กลุ่ม (P = 6.5e-10) ฉลามบำรุงรักษา osmolalities พลาสม่าที่
มีทั้ง isosmotic กับสภาพแวดล้อม (34 ‰) หรือสูงกว่า
สภาพแวดล้อม (25 ‰และ 40 ‰) (รูปที่ 1). ความเค็ม acclimation อย่างมีนัยสำคัญ
ได้รับผลกระทบความเข้มข้นของ Na +, Cl- และยูเรียในพลาสม่า (ANOVA,
นา + F2,12 = 18.91, P = 1.95 E-4; Cl-: F2,12 = 8.5, P = 0.005; ยูเรีย:
F2 12 = 37.3, P = 7.08e-6 ตารางที่ 2) ในทุกกรณีไอออนและยูเรียมีความเข้มข้น
สูงที่สุดใน 40 ‰รักษาและต่ำสุดในรอบ 25 ‰
รักษา ผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญของความเค็มต่อความเข้มข้นของ K + ไอออนภายใน
พลาสม่าก็ไม่เห็น (ANOVA F2, 12 = 0.94, P = 0.42; ตารางที่ 2).
4.2 branchial และต่อกิจกรรม NKA ทวารหนัก
ไม่มีผลกระทบต่อความเค็มกับมวลของต่อมทวารหนักหลังจาก
การแก้ไขผลกระทบที่เกิดจากมวลกาย (ANCOVA, F (2, 11) = 0.1322,
p = 0.8775) ไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญของความเค็มสิ่งแวดล้อม
กับกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงของเอนไซม์ NKA ทั้งในต่อมทวารหนัก
(ANOVA F2, 12 = 0.223, P = 0.80. รูปที่ 2A) หรือเนื้อเยื่อ branchial (ANOVA
F2, 12 = 1.57, P = 0.248 , รูป. 2B) ในการรักษาทั้งหมดกิจกรรม NKA เป็น
เกือบสิบเท่าสูงในต่อมทวารหนักเมื่อเทียบกับเหงือก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง เฉยๆของรวม homogenates ประกอบด้วย
ทั้งหมด 6 μกรัมของโปรตีน branchial เพิ่ม 1 × nupage
โบถส์บัฟเฟอร์ ( ตัวอย่างเทคโนโลยีชีวิตออสเตรเลีย Mulgrave , ออสเตรเลียวิกตอเรีย ,
) แล้วใช้ที่ 70 องศา C เป็นเวลา 10 นาทีก่อนที่จะโหลด
ทั้งสามใบเป็น 4 – 12 % และเจล ( บริษัท บิส novex
ชีวิตเทคโนโลยีออสเตรเลีย ) และ electrophoresed ที่ 200 V 45 นาที ( xcell surelock ®
มินิ , ชีวิตเทคโนโลยี ออสเตรเลีย ) จำนวนโอนจาก
เจลไฟฟ้าμ M invitrolon PVDF membranes ที่ 35 V 90 นาทีในการ xcell
2 ™ลบโมดูล ( ชีวิตเทคโนโลยี ออสเตรเลีย ) เยื่อ
ถูกบล็อกด้วย 5 % นมไขมันต่ำใน tbst แล้วบ่มในแอนติบอดีประถมศึกษา
( α Rb1 11 tbst ) 60 นาที ที่อุณหภูมิห้อง เป็นแพะ กระต่าย ระดับแอนติบอดีต่อต้าน
ไล ( 1:2000 แอนติบอดี
ออสเตรเลีย ) จากนั้นใช้ membranes นาน 60 นาที ที่อุณหภูมิห้อง

เป็น streptavidin ( ช ) 000 ใน tbst ; เวกเตอร์
ห้องปฏิบัติการ , USA ) คือการเพิ่ม themembranes สำหรับ 30 นาทีตาม
โดยโครมาเจน 3 , 3 ’ - diaminobenzidine ( ป้าย ) เยื่อแผ่นแบบ
ล้างและอบแห้ง และ digitised โดยใช้แคนนอนสแกนเนอร์ .
การวิเคราะห์ densitometric ของวงจำนวนปริมาณหนึ่ง
ซอฟต์แวร์ ( ไบโอ ราดเกลดส์วิลล์ , NSW , ออสเตรเลีย )
3 สถิติ
ข้อมูลทั้งหมดจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ±ความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย
( SE ) พลาสมาค่าออสโมลาลิตี้ ปริมาณตัวถูกละลายและกิจกรรม nka
tissue-specific วิเคราะห์ข้อมูลโดยวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว และ Post Hoc
คู่แบบ( เกาะที่ปรับระดับต้น ) ต่อมทวารหนักข้ามการใช้มวลเปรียบเทียบ
ตามด้วยร่างกายมวลเป็น Co variate .
ภายในค่าออสโมลาลิตี้รักษาความเค็ม , พลาสมาและใช้ตัวอย่างสิ่งแวดล้อม
เปรียบเทียบแบบ . ทั้งหมดถูกเรียกใช้ /
r ( ทีมหลัก ) r )
4 ผลลัพธ์
4.1 . ฮีมาโตคริตและพลาสมาอุณหภูมิความเข้มข้น