4. The expanding frontier of genome

4. The expanding frontier of genome editing methods
4.1. Targeted recombination

As discussed previously, NHEJ facilitates frequent, random integration of exogenous DNA in most non-conventional yeasts. In contrast, most industrial strain engineering efforts require the construction of a metabolic pathway or a desirable strain background using well-controlled integrations, disruptions, and excisions. The canonical approach of sequential integration of cassettes followed by marker recycling has historically been more difficult in non-conventional yeasts. The original tools and cassette designs for facilitating this process use either heterologous site-specific recombinases or native, cellular homologous recombination directed by long flanking homology arms. In some cases, accessory nucleases may be used to induce double-strand breaks (DSBs) that stimulate and direct native HR at the desired locus (Krogh and Symington, 2004), but this step is not always required. When prokaryotic or synthetic nucleases are utilized in yeast, it is essential to validate that the protein is properly localized to the nucleus for cleavage of the genomic DNA. The heterologous nuclear localization signal (NLS) from the Simian Virus 40 T antigen (commonly referred to as the SV40 NLS) has long been used for this purpose in S. cerevisiae ( Benton et al., 1990), and a toolbox of ten endogenous and heterologous NLS sequences was recently curated and characterized for use in P. pastoris ( Weninger et al., 2015).

A variety of heterologous recombinases have been explored across host systems, with one of the more historically popular choices being Cre–lox from P1 bacteriophage ( Sternberg and Hamilton, 1981). The Cre–lox recombination system has been used in all yeast expression systems discussed in this review, including S. cerevisiae ( Sauer, 1987) and the non-conventional yeasts H. polymorpha ( Krappmann et al., 2000), K. lactis ( Steensma and Ter Linde, 2001), P. pastoris ( Marx et al., 2008), and Y. lipolytica ( Fickers et al., 2003), often for selection marker recycling. The general Cre–lox system has been covered extensively elsewhere ( Hoess and Abremski, 1990), so this article will focus only on more recent advances in yeasts, such as self-excising Cre–lox cassettes ( Fig. 2A). Design of a self-excising Cre–lox module in P. pastoris has been achieved using the inducible pAOX1 to drive tightly-regulated Cre expression ( Pan et al., 2011). After introducing a lox71–pAOX1–Cre–ZeoR–lox66 cassette, double crossover HR transformants were selected on Zeocin plates. Addition of methanol subsequently induced Cre expression, causing recombination between the lox71 and lox66 sites. This site-specific recombination event yielded a double mutant lox72 site at the target locus and resulted in the removal of the pAOX1–Cre–ZeoR fragment. Since this mutant lox72 site is minimally recognized by Cre recombinase ( Albert et al., 1995 and Arakawa et al., 2001), retargeting by subsequent rounds of Cre expression is mitigated. However, the successive accumulation of lox72 scar sites across the genome may still occasionally be subject to HR-driven rearrangements and deletions, as even a 33 base pair homology tract can occasionally trigger HR in a P. pastoris cassette ( Yang et al., 2009).

Diagram of synthetic marker excision approaches using tightly regulated ...
Fig. 2.
Diagram of synthetic marker excision approaches using tightly regulated inducible promoters. (A) After HR-mediated integration of a Cre-containing disruption cassette and dominant selection using Zeocin, the addition of methanol induces Cre expression from pAOX1. Cre promotes site-specific recombination between lox71 and lox66, excising the Cre and ZeoR cassettes and leaving an inactive lox72 scar at the disruption locus. (B) After HR-mediated integration of a MazF-containing disruption cassette and dominant selection using Zeocin, the addition of methanol induces MazF expression from pMOX. Cells that have undergone HR between the 5′ US repeats have excised the MazF cassette and survive, while high level MazF expression is lethal to cells that still contain the disruption cassette. Note that the initial double-crossover integration of the disruption cassette may be accomplished using a 2-fragment/split marker approach (not shown in diagram).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

4. ชายแดนขยายของพันธุแก้ไขวิธี4.1 เป้าหมาย recombinationตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ NHEJ อำนวยความสะดวกรวมบ่อย สุ่มของดีเอ็นเอภายนอกใน yeasts สุดไม่ธรรมดา คมชัด อุตสาหกรรมสายพันธุ์วิศวกรรมความต้องการก่อสร้างทางเดินเผาผลาญหรือพื้นหลังความเครียดที่ต้อง ใช้การรวมมีการควบคุม การหยุดชะงัก excisions วิธีการมาตรฐานของเทปตาม ด้วยเครื่องหมายรีไซเคิลตามลำดับรวมประวัติได้ยากใน yeasts ไม่ธรรมดา เครื่องมือเดิมและแบบเทปสำหรับอำนวยความสะดวกในกระบวนการนี้ใช้เฉพาะ recombinases heterologous หรือดั้งเดิม เซลลูลาร์เซทจะมีโครโมโซม recombination โดยโล่งยาวแขน homology ในบางกรณี nucleases อุปกรณ์อาจถูกใช้เพื่อก่อให้เกิดการแบ่งสาระคู่ (DSBs) ที่ช่วยกระตุ้น และโดยตรงเจ้า HR ที่โลกัสโพลที่ต้องการ (Krogh และ Symington, 2004), แต่ขั้นตอนนี้ไม่จำเป็น เมื่อ nucleases prokaryotic หรือสังเคราะห์ใช้ในยีสต์ มันเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อตรวจสอบว่า โปรตีนอย่างถูกต้องมีแปลให้นิวเคลียสสำหรับความแตกแยกของดีเอ็นเอในจีโนมของ สัญญาณภาษานิวเคลียร์ heterologous (NLS) จาก antigen T 40 ไวรัสสิมิลัน (เรียกทั่วไปว่า SV40 NLS) ยาวใช้สำหรับวัตถุประสงค์นี้ใน S. cerevisiae (เบนตัน et al. 1990), และเครื่องมือสิบภายนอก และ heterologous NLS ลำดับที่เพิ่งรวบรวม และลักษณะสำหรับใช้ใน P. pastoris (Weninger et al. 2015)หลากหลาย heterologous recombinases ได้รับการสำรวจผ่านระบบโฮสต์ กับหนึ่งในตัวเลือกที่นิยมมากในอดีตการ Cre-ล็อกซ์จากแบคที P1 (Sternberg และแฮมิลตัน 1981) มีการใช้ระบบ recombination Cre-ล็อกซ์ในระบบนิพจน์ยีสต์ทั้งหมดที่กล่าวถึงในรีวิว S. cerevisiae (Sauer, 1987) และไม่ธรรมดา yeasts H. polymorpha (Krappmann et al. 2000), คุณ lactis (Steensma และเธอ Linde, 2001), P. pastoris (Marx et al. 2008), และประกันศูนย์ปี lipolytica (Fickers et al. 2003), การเลือกเครื่องหมายรีไซเคิล ระบบ Cre-ล็อกซ์ทั่วไปได้รับการครอบคลุมอย่างกว้างขวางอื่น ๆ (Hoess และ Abremski, 1990), ดังนั้นบทความนี้จะเน้นเฉพาะความก้าวหน้าล่าสุดใน yeasts เช่น excising เทป Cre-ล็อกซ์ (รูป 2A) ด้วยตนเอง ได้รับความสำเร็จการออกแบบของโมดู Cre-ล็อกซ์ excising เองใน P. pastoris ใช้ inducible pAOX1 ขับแน่นควบคุม Cre นิพจน์ (แพน et al. 2011) หลังจากแนะนำเทป lox71 – pAOX1 – Cre – ZeoR – lox66, transformants HR คู่ไขว้ได้เลือกบนแผ่น Zeocin นอกจากนี้เมทานอลมาเกิดนิพจน์ Cre เกิด recombination ระหว่าง lox71 และ lox66 ไซต์ เหตุการณ์นี้ recombination เฉพาะผลไซต์กลายพันธุ์ lox72 คู่ที่โลกัสโพลเป้าหมาย และผลในการกำจัดส่วน pAOX1 – Cre-ZeoR เนื่องจากเว็บไซต์ lox72 ที่กลายพันธุ์นี้เป็นที่ยอมรับ minimally โดย Cre recombinase (อัลเบิร์ต et al. 1995 และอะระกะวะ et al. 2001), อย่าง โดยรอบต่อมาของ Cre นิพจน์จะถูกลดลง อย่างไรก็ตาม การสะสมต่อเนื่องของแผลเป็น lox72 ทั่วจีโนอาจยังคงจะต้องเรียบเรียงใหม่แบบ HR และการลบ ทาง homology เดินคู่ฐาน 33 แม้ในบางครั้งสามารถเรียก HR ในเทป P. pastoris (Yang et al. 2009)ไดอะแกรมของจี้สังเคราะห์หมายถึงใช้ควบคุมอย่างใกล้ชิด...รูป 2 ไดอะแกรมของวิธีการผ่าตัดเล็กหมายสังเคราะห์ใช้แน่นควบคุม inducible ก่อ (A) หลังจากมี HR รวม Cre-ประกอบด้วยเทปหยุดชะงักและหลักการเลือกใช้ Zeocin การเพิ่มของเมทานอลก่อให้เกิดนิพจน์ Cre จาก pAOX1 Cre ส่งเสริมเฉพาะ recombination ระหว่าง lox71 และ lox66, excising เทป Cre และ ZeoR และออกจากแผล lox72 งานที่โลกัสโพลทรัพย (ข) หลังจากมี HR รวมเทปทรัพยที่ประกอบด้วย MazF และหลักการเลือกใช้ Zeocin การเพิ่มของเมทานอลก่อให้เกิดการแสดงออก MazF จาก pMOX เซลล์ที่มีระดับ HR ระหว่าง 5′ สหรัฐอเมริกาซ้ำมี excised เทป MazF และเอาตัว รอด สูง MazF แสดงเป็นยุทธภัณฑ์ไปยังเซลล์ที่ยังคง ประกอบด้วยเทปทรัพย หมายเหตุว่า การรวมแบบไขว้คู่แรกเทปหยุดชะงักอาจทำได้โดยใช้วิธีการเครื่องหมาย 2 ส่วน/แยก (ไม่แสดงในแผนภาพ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

4. การขยายพรมแดนของวิธีการแก้ไขจีโนม
4.1 การรวมตัวกันที่กำหนดเป้าหมายตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ NHEJ อำนวยความสะดวกบ่อยบูรณาการสุ่มของดีเอ็นเอจากภายนอกในยีสต์ที่ไม่ธรรมดาที่สุด ในทางตรงกันข้ามความพยายามมากที่สุดสายพันธุ์วิศวกรรมอุตสาหกรรมจำเป็นต้องมีการก่อสร้างทางเดินการเผาผลาญหรือพื้นหลังความเครียดที่พึงประสงค์โดยใช้มีการควบคุมการผสานรวมการหยุดชะงักและ excisions วิธีการที่ยอมรับของการรวมกลุ่มตามลำดับของเทปตามด้วยเครื่องหมายรีไซเคิลได้รับในอดีตที่ยากลำบากมากขึ้นในการยีสต์ที่ไม่ธรรมดา เครื่องมือที่ใช้ในการออกแบบเดิมและเทปเพื่ออำนวยความสะดวกในขั้นตอนนี้ใช้ทั้ง recombinases เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงหรือ heterologous พื้นเมือง recombination คล้ายคลึงโทรศัพท์มือถือที่กำกับโดยยาวขนาบข้างแขนที่คล้ายคลึงกัน ในบางกรณี nucleases เสริมอาจจะถูกใช้เพื่อก่อให้เกิดการแบ่งแบบ double-Strand (DSBs) ที่กระตุ้นและทรัพยากรบุคคลพื้นเมืองโดยตรงที่สถานทีที่ต้องการ (Krogh และ Symington, 2004) แต่ขั้นตอนนี้ไม่จำเป็นเสมอไป เมื่อ nucleases นิวเคลียสหรือสังเคราะห์ที่ใช้ในยีสต์มันเป็นสิ่งสำคัญในการตรวจสอบว่าโปรตีนเป็นภาษาท้องถิ่นอย่างถูกต้องเพื่อนิวเคลียสสำหรับความแตกแยกของดีเอ็นเอ heterologous แปลสัญญาณนิวเคลียร์ (NLS) จากลิงไวรัส 40 T แอนติเจน (ปกติจะเรียกว่า SV40 NLS) ได้รับการใช้เพื่อการนี้ใน S. cerevisiae (เบนตัน et al., 1990) และกล่องเครื่องมือสิบภายนอก และ heterologous ลำดับ NLS ถูก curated เร็ว ๆ นี้และที่โดดเด่นสำหรับการใช้งานใน P. pastoris (Weninger et al., 2015). ความหลากหลายของ recombinases heterologous ได้รับการสำรวจในระบบโฮสต์กับหนึ่งในตัวเลือกที่นิยมมากขึ้นในอดีตเป็น Cre-LOX จาก P1 bacteriophage (สเติร์นและแฮมิลตัน, 1981) ระบบ Cre-LOX รวมตัวกันอีกมีการใช้ในทุกระบบการแสดงออกของยีสต์ที่กล่าวไว้ในการตรวจสอบนี้รวมทั้งเอส cerevisiae (ซาวเออร์ 1987) และที่ไม่ธรรมดายีสต์ H. polymorpha (Krappmann et al., 2000), เค lactis ( Steensma และ Ter Linde, 2001), P. pastoris (มาร์กซ์ et al., 2008) และวาย lipolytica (Fickers et al., 2003) มักจะเลือกรีไซเคิลเครื่องหมาย ทั่วไประบบ Cre-LOX ได้รับการคุ้มครองอย่างกว้างขวางอื่น ๆ (Hoess และ Abremski, 1990) ดังนั้นบทความนี้จะมุ่งเน้นเฉพาะในความก้าวหน้ามากขึ้นล่าสุดในยีสต์เช่นตนเอง excising เทป Cre-LOX (รูป. 2A) การออกแบบของตัวเอง excising โมดูล Cre-LOX ใน P. pastoris ได้รับความสำเร็จโดยใช้ pAOX1 inducible ที่จะขับรถแน่นควบคุมการแสดงออก Cre (แพน et al. 2011) หลังจากที่แนะนำเทป lox71-pAOX1-Cre-ZeoR-lox66 ครอสโอเวอร์คู่ transformants ทรัพยากรบุคคลได้รับการคัดเลือกบนจาน Zeocin นอกเหนือจากเมทานอลต่อมาเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออก Cre ก่อให้เกิดการรวมตัวกันระหว่าง lox71 และ lox66 เว็บไซต์ เหตุการณ์รวมตัวกันอีกเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงนี้ให้ผลคู่เว็บไซต์ lox72 กลายพันธุ์ที่สถานทีเป้าหมายและผลในการกำจัดของส่วน pAOX1-Cre-ZeoR เนื่องจากเว็บไซต์ lox72 นี้กลายพันธุ์ได้รับการยอมรับน้อยที่สุดโดย Cre recombinase (อัลเบิร์ et al., 1995 และ Arakawa et al., 2001) การกำหนดเป้าหมายใหม่โดยรอบที่ตามมาของการแสดงออก Cre ทุเลาลง อย่างไรก็ตามการสะสมต่อเนื่องของเว็บไซต์แผลเป็น lox72 ทั่วจีโนมอาจบางครั้งยังต้องได้รับการเรียบเรียงใหม่ HR-ขับเคลื่อนและลบเป็นแม้แต่ทางเดินคู่ที่คล้ายคลึงกัน 33 ฐานบางครั้งอาจก่อให้เกิดการบริหารทรัพยากรบุคคลใน pastoris เทปพี (Yang et al., 2009 ). แผนผังของตัดตอนเครื่องหมายสังเคราะห์ใช้วิธีการควบคุมอย่างแน่นหนา ... รูป 2. แผนผังของตัดตอนเครื่องหมายสังเคราะห์ใช้วิธีการควบคุมอย่างแน่นหนาก่อการ inducible (A) หลังจากที่บูรณาการทรัพยากรบุคคลพึ่งของ Cre ที่มีเทปการหยุดชะงักและการเลือกที่โดดเด่นโดยใช้ Zeocin นอกเหนือจากเมทานอลก่อให้เกิดการแสดงออก Cre จาก pAOX1 Cre ส่งเสริมการรวมตัวกันอีกเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงและระหว่าง lox71 lox66, excising Cre และ ZeoR เทปและออกจากแผลเป็น lox72 ไม่ได้ใช้งานในสถานทีหยุดชะงัก (B) หลังจากที่บูรณาการทรัพยากรบุคคลพึ่งของ MazF ที่มีเทปการหยุดชะงักและการเลือกที่โดดเด่นโดยใช้ Zeocin นอกเหนือจากเมทานอลก่อให้เกิดการแสดงออก MazF จาก pMOX เซลล์ที่ได้รับการบริหารทรัพยากรบุคคลระหว่าง 5 'ซ้ำสหรัฐได้ตัดเทป MazF และอยู่รอดในขณะที่ระดับสูงแสดงออก MazF คือตายไปยังเซลล์ที่ยังมีเทปการหยุดชะงัก โปรดทราบว่าการรวมสองครั้งแรกของครอสโอเวอร์เทปการหยุดชะงักอาจจะทำได้โดยใช้ 2 ชิ้นส่วน / แยกวิธีเครื่องหมาย (ไม่ปรากฏในแผนภาพ)