Cell cultureThe human lung carcinom

Cell culture

The human lung carcinoma (A549) cell was kindly provided by the Chulabhorn Research Institute. The human hepatocellular carcinoma (HepG2) cell (ATCC HB-8065) was obtained from the National Cancer Institute, Bangkok, Thailand. The HepG2, and A549 cells were cultured in RPMI 1640 medium (Hyclone, Logan, UT, USA). Both cell lines were supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum (Hyclone), 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY). All cell lines were maintained at 37°C in a 5% CO2 incubator and the media were changed twice weekly.

In vitro cytotoxicity assay

The sulforhodamine B (SRB) assay was performed to assess growth inhibition using a colorimetric assay, which estimates cell number indirectly by staining total cellular protein with the dye SRB[20].

Briefly, 100 μL/well of cell suspensions (0.5-2.0 × 105 cells/mL) were seeded in 96-well microtiter plates and incubated at 37°C to allow for cell attachment. After 24 h, the cells were treated with the extract by adding 100 μL/well of each concentration in triplicate to obtain a final concentration of 0.8, 4, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, and 1000 μg/well for the extracts; 0.029, 0.058, 0.116, 0.174, and 0.348 μg/mL for the doxorubicin; and, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, and 5.0 μg/mL for the cisplatin.

The plates were incubated for 1 h (d 0) and 72 h (d 3) at 37°C. At the end of each exposure time, the medium was removed. The cells were fixed with 20% (w/v) trichloroacetic acid (TCA, Fluka, Buchs, Switzerland) at 4°C for 1 h, stained for 30 min with 0.4% (w/v) SRB (Sigma, St. Louis, MO, USA) dissolved in 1% acetic acid (Sigma) for 30 min, and washed four times with 1% acetic acid. The protein-bound dye was solubilized with 10 mmol/L Tris base, pH 10 (Sigma).

The absorbance (OD) of each well was read on an ELISA plate reader (Amersham, Buckinghamshire, UK) at 492 nm. Percentage of cell survival was calculated using the formula: Percentage cell survival = [(OD test sample at d 3 - OD d 0)/(OD control at d 3 - OD d 0)] × 100.

Dose-response curves were plotted, and 50% growth inhibitory concentrations of extracts or drugs (IC50) were calculated through computation with the CalcuSyn software program (Biosoft, Cambridge, UK). By comparing the growth inhibitory effect with normal cells, the selectivity of the extract was expressed as the extract shown to be toxic to specific types of cancer cell lines.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพาะเลี้ยงเซลล์เซลล์ปอดมนุษย์ carcinoma (A549) ได้กรุณาจัด โดย สถาบันวิจัยจุฬาภรณ์ มนุษย์ hepatocellular carcinoma (HepG2) เซลล์ (ATCC HB-8065) ได้รับจาก สถาบันมะเร็งแห่งชาติ กรุงเทพ ไทย HepG2 และเซลล์ A549 มีอ่างใน RPMI 1640 (Hyclone โล UT สหรัฐอเมริกา) ทั้งสองบรรทัดของเซลล์ถูกเสริม ด้วยความร้อน 10% ยกเลิกครรภ์วัวเซรั่ม (Hyclone), 100 U/mL ยาเพนนิซิลลิน และ streptomycin μg/mL 100 (Gibco BRL เกาะแกรนด์ NY) รายการเซลล์ทั้งหมดถูกเก็บที่ 37° C ใน incubator 5% CO2 และสื่อมีการเปลี่ยนแปลงทุกสองสัปดาห์Cytotoxicity ในหลอดทดสอบทดสอบบี (SRB) sulforhodamine ที่ดำเนินการจะยับยั้งการเจริญเติบโตที่ใช้การวิเคราะห์เทียบเคียง ซึ่งประเมินจำนวนเซลล์ทางอ้อม โดยการย้อมสีโปรตีนรวมโทรศัพท์มือถือกับย้อม SRB [20]สั้น ๆ 100 μL/ดี ของเซลล์บริการ (0.5-2.0 × 105 เซลล์/มล.) seeded ใน microtiter ดี 96 แผ่น และ incubated ที่ 37° C เพื่อให้เซลล์ที่แนบมา หลังจาก 24 ชม เซลล์ได้รับการรักษา ด้วยการดึงข้อมูล โดยการเพิ่ม μL 100 ดีของแต่ละความเข้มข้นใน triplicate เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 0.8, 4, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 และสารสกัดจาก μg 1000/ดี 0.029, 0.058, 0.116, 0.174 และ μg 0.348 mL สำหรับ doxorubicin , 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5 และ μg 5.0 mL สำหรับ cisplatin ในการแผ่นก็ incubated 1 h (d 0) และ h 72 (d 3) ที่ 37 องศาเซลเซียส สื่อที่ถูกเอาออกเมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการรับแสงแต่ละ เซลล์ได้คง ด้วยกรด trichloroacetic 20% (w/v) (TCA, Fluka, Buchs สวิตเซอร์แลนด์) ที่ 4° C สำหรับ h 1 สีสำหรับ 30 นาทีกับ 0.4% (w/v) SRB (ซิก St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ละลายใน 1% กรดน้ำส้ม (ซิกมา) สำหรับ 30 นาที และล้างสี่เท่ากับ 1% กรดอะซิติก สีย้อมผูกโปรตีนถูก solubilized กับ 10 mmol/L ตรีฐาน pH 10 (ซิกมา)Absorbance (OD) ของแต่ละดีถูกอ่านในการ ELISA แผ่นอ่าน (Amersham บักกิงแฮมเชอร์ อังกฤษ) ที่ 492 nm เปอร์เซ็นต์ของการอยู่รอดของเซลล์มีคำนวณโดยใช้สูตร: เปอร์เซ็นต์เซลล์รอด = [(OD ทดสอบตัวอย่างที่ดี 3 - OD d 0) / (OD ควบคุมที่ d 3 - OD d 0)] × 100ถูกพล็อตเส้นโค้งการตอบสนองยา และมีคำนวณความเข้มข้นลิปกลอสไขเติบโต 50% สารสกัดหรือยาเสพติด (IC50) โดยคำนวณด้วยโปรแกรมซอฟต์แวร์ CalcuSyn (Biosoft เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) โดยการเปรียบเทียบผลลิปกลอสไขเจริญเติบโตของเซลล์ปกติ วิธีของการดึงข้อมูลถูกแสดงเป็นการดึงข้อมูลที่แสดงจะเป็นพิษกับบรรทัดของเซลล์มะเร็งบางชนิด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเพาะเลี้ยงเซลล์มนุษย์มะเร็งปอด (A549) เซลล์ให้ความกรุณาโดยสถาบันวิจัยจุฬาภรณ์ มะเร็งตับ (เซลล์ HepG2) มือถือ (ATCC HB-8065) ​​ที่ได้รับจากสถาบันมะเร็งแห่งชาติ, Bangkok, Thailand HepG2 และเซลล์ A549 ถูกเลี้ยงใน RPMI 1640 กลาง (Hyclone โลแกน, ยูทาห์สหรัฐอเมริกา) ทั้งสองสายพันธุ์เซลล์ถูกเสริมด้วย 10% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ความร้อนการใช้งาน (Hyclone) ยาปฏิชีวนะ 100 U / มิลลิลิตรและ 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร streptomycin (Gibco BRL แกรนด์ไอส์แลนด์นิวยอร์ก) เซลล์ทั้งหมดถูกเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในศูนย์บ่มเพาะ CO2 5% และสื่อมีการเปลี่ยนแปลงสัปดาห์ละสองครั้ง. ในหลอดทดลองทดสอบพิษsulforhodamine B (SRB) ทดสอบได้ดำเนินการในการประเมินการยับยั้งการเจริญเติบโตของการใช้การทดสอบสีซึ่งประมาณการจำนวนเซลล์โดยอ้อม โดยการย้อมสีโปรตีนโทรศัพท์มือถือรวมกับสีย้อม SRB [20]. สั้น ๆ , 100 ไมโครลิตร / ดีของเซลล์แขวนลอย (0.5-2.0 × 105 เซลล์ / มิลลิลิตร) เมล็ดในแผ่นไมโคร 96 หลุมและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเพื่อให้เซลล์ สิ่งที่แนบมา หลังจาก 24 ชั่วโมงเซลล์ได้รับการรักษาด้วยสารสกัดโดยการเพิ่ม 100 ไมโครลิตร / ดีของความเข้มข้นในแต่ละเพิ่มขึ้นสามเท่าเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.8, 4, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 และ 1,000 ไมโครกรัม / ดีสำหรับ สารสกัด; 0.029, 0.058, 0.116, 0.174 และ 0.348 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรสำหรับ doxorubicin นั้น และ, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5 และ 5.0 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรสำหรับ cisplatin. จานถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง (ง 0) และ 72 ชั่วโมง (ง 3) ที่ 37 ° C ในตอนท้ายของแต่ละครั้งที่เปิดรับสื่อจะถูกลบออก เซลล์ได้รับการแก้ไขที่มี 20% (w / v) กรดไตรคลอโร (TCA, Fluka, Buchs วิตเซอร์แลนด์) ที่ 4 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง, สีเป็นเวลา 30 นาทีกับ 0.4% (w / v) SRB (ซิกม่าเซนต์หลุยส์ , MO, USA) ละลายใน 1% กรดอะซิติก (ซิกม่า) เป็นเวลา 30 นาทีและล้างครั้งที่สี่กับ 1% กรดอะซิติก สีย้อมโปรตีนที่ถูกผูกไว้ถูกละลายที่มี 10 มิลลิโมล / ลิตรฐานทริสพีเอช 10 (ซิกม่า). การดูดกลืนแสง (OD) ของดีแต่ละคนถูกอ่านในการอ่านแผ่นวิธี ELISA (Amersham, Buckinghamshire สหราชอาณาจักร) ที่ 492 นาโนเมตร ร้อยละของการอยู่รอดของเซลล์ที่คำนวณโดยใช้สูตร: เซลล์อยู่รอดร้อยละ = [(OD ตัวอย่างการทดสอบที่ง 3 - 0 OD d) / (การควบคุม OD ที่ 3 d - OD d 0)] × 100 เส้นโค้งปริมาณการตอบสนองที่ถูกพล็อต, และ 50% มีความเข้มข้นในการยับยั้งการเจริญเติบโตของสารสกัดหรือยาเสพติด (IC50) จะถูกคำนวณผ่านการคำนวณด้วยโปรแกรมซอฟต์แวร์ CalcuSyn (Biosoft เคมบริดจ์สหราชอาณาจักร) โดยการเปรียบเทียบผลยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ปกติการเลือกของสารสกัดที่ถูกแสดงเป็นสารสกัดที่แสดงความเป็นพิษต่อประเภทเฉพาะของเซลล์มะเร็ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เซลล์โรคมะเร็งปอดของมนุษย์ ( a549 ) ของเซลล์ได้กรุณาให้ โดยสถาบันวิจัยจุฬาภรณ์ โดยโรคมะเร็งตับมนุษย์ ( มะเร็งตับ ) เซลล์ ( ATCC hb-8065 ) ที่ได้รับจากสถาบันมะเร็งแห่งชาติ . ส่วนมะเร็งตับ และ a549 เซลล์เพาะเลี้ยงใน RPMI 1640 ขนาดกลาง ( hyclone โลแกน , ยูทาห์ , สหรัฐอเมริกา )ทั้งเซลล์ที่ถูกเสริมด้วย 10% fetal bovine serum ( inactivated ความร้อน hyclone ) 100 U / ml เพนนิซิลินและ 100 μ g / ml สเตรปโตมัยซิน ( NY gibco BRL , เกาะ , ใหญ่ ) เซลล์ทั้งหมดถูกเก็บรักษาไว้ที่ 37 ° C ใน 5% CO2 Incubator และสื่อมีการเปลี่ยนแปลงสองสัปดาห์

3

เซลล์ในหลอดทดลองพวกซัลฟอร์โฮดามีนบี ( SRB ) โดยทำการประเมินการยับยั้งการเจริญเติบโตโดยใช้วิธี Colorimetric ซึ่งประมาณการจำนวนเซลล์โดยการย้อมเซลล์โปรตีนรวมทางอ้อมกับย้อมไป [ 20 ] .

สั้น 100 μ L / ดีเซลล์แขวนลอย ( 0.5-2.0 × 105 เซลล์ / มิลลิลิตร ) มีเมล็ดใน 96 ดีไมโครเพลท และ บ่มที่ 37 ° C เพื่อให้เซลล์ที่แนบมา หลังจาก 24 ชั่วโมงเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วยสารสกัดโดยการเพิ่ม 100 μลิตรของแต่ละความเข้มข้นทั้งสามใบเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 0.8 , 4 , 0 , 25 , 50 , 100 , 200 , 400 และ 1000 μกรัม / ดีสารสกัด ; 0.029 , 0.056 , 0.116 , 0.174 และ 0.348 μกรัมต่อลิตร มิลลิลิตร สำหรับดอกโซรูบิซิน ; และ , 0.1 , 0.2 , 0.5 , 1.0 , 2.5 และ 5.0 μ g / ml สำหรับเคมีบำบัด .

จานถูกบ่ม 1 H ( D 0 H ( D ) และ 72 ( 3 ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา ในตอนท้ายของแต่ละเวลากลางถูกลบออก เซลล์ที่ถูกตรึงด้วย 20 % ( w / v ) trichloroacetic acid ( TCA fluka buchs , , , สวิตเซอร์แลนด์ ) ที่ 4 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง 30 นาที , การย้อมสี 0.4 % ( w / v ) ไป ( Sigma , St . Louis , MO , USA ) ละลายใน 1 % กรดน้ำส้ม ( Sigma ) 30 นาที และล้างสี่ครั้งด้วย 1% กรดอะซิติก .มัดย้อมโปรตีนถูกสร้างด้วย 10 mmol / L หรือฐาน pH 10 ( Sigma ) .

น ( OD ) ของแต่ละคนได้เป็นอย่างดี อ่านบนเครื่องอ่านจาน ( ชาม ) บัคคิงแฮมเชอร์ , UK ) ที่ 492 นาโนเมตร รอดตายเซลล์ที่ถูกคำนวณโดยใช้สูตร : [ การอยู่รอด = เซลล์เปอร์เซ็นต์ ( จากตัวอย่างทดสอบที่ 3 - D . D / 0 ) ( จากการควบคุมที่ D 3 - D ( 0 ) ] × 100

( โค้งเป็นพล็อตการตอบสนอง ,และ 50% ของปริมาณอาหาร หรือ ยา ( สารสกัดจาก ic50 ) ได้ผ่านการคำนวณด้วยโปรแกรม calcusyn ซอฟต์แวร์ ( ไบโอซอฟท์ , เคมบริดจ์ , UK ) โดยการเปรียบเทียบผลการยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ปกติ การเลือกสารสกัดที่ถูกแสดงเป็นแยกเป็นประเภทเฉพาะของที่เป็นพิษต่อเซลล์มะเร็ง