(NH4+-N and NO3_-N) analysis, dupli

(NH4+-N and NO3_-N) analysis, duplicate samples were shaken with 100 mL of 2 M KCl for 1 h on a rotational shaker (Keeney and Nelson, 1982), then the soil slurries were filtered and NH4+-N and NO3_-N measured colorimetrically with a SKLAR continuous-flow analyzer. Soil pH was measured using a 1:1 soil to water suspension with a glass electrode. Soil organic carbon (SOC) was determined by acid dichromate wet oxidation as described by Nelson and Sommers (1996). Total N was determined by the micro- Kjeldahl method (Bremner, 1996). Total P in soils was determined by the rapid perchloric acid digestion procedure (Sommers and Nelson, 1972), and total K as described by Jackson (1967). Clay concentration was determined by the standard pipette method (Gee and Bauder, 1986).
2.3. DNA extraction and quantitative PCR assay
At incubation days 0, 14 and 28, four replicate bottles of each treatment were randomly selected to extract DNA and to quantitate amoA genes using quantitative PCR (qPCR). The DNA was extracted for three sub-samples from 0.50 g of soil with the FastDNA Spin Kit for soil (MP Biomedicals, United States), according to the protocol of the manufacturer. The quality and quantity of the DNA extracts were assessed using a spectropho- tometer (Nanodrop, PeqLab Germany), and were pooled and stored at _20 _C until use. Quantitative PCR of amoA genes was performed to estimate the abundance of the ammonia-oxidizing bacteria and archaea communities, respectively. The primers amoA-1F (50- GGGGTTTCTACTGGTGGT-30) and amoA-2R(50- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-30) were used for ammonia-oxidizing bacteria generating a 491 bp fragment; Arch-amoA F (50- STAATGGTCTGG-CTTAGACG-30) and Arch-amoA R (50-GCGGCCATC- CATCTGTATGT-30) were used for ammonia-oxidizing archaea generating a 635 bp fragment (Francis et al., 2005). Quantification was based on the fluorescence intensity of the SYBR green dye and reactions for each sample were carried out in a Bio-Rad CFX- 96 thermal cycler. The quantification of amoA genes was performed in a total volume of 25 ml reaction mixtures by using 12.5 ml of SYBR Premix Ex TaqTM as described by the suppliers (Takara Bio Otsu, Shiga, Japan), 0.25 ml of each primer (50 mm), 1 ml of soil DNA template, with a final content of 1–10 ng in each reaction mixture, and 11 ml ddH2O. The fragments for the AOB and AOA were both amplified using an initial denaturation step at 95 _C for 3 min, followed by 35 cycles of 30 s at 95 _C, 30 s at 55 _C, 30 s at 72 _C for AOB, and 45 s at 72 _C for AOA for the collection of fluorescence data. All reactions were finished with a melting curve starting at 65 _C with an increase of 0.5 _C up to 95 _C to verify amplicon specificity. Standard curves for the AOB and AOA were obtained using serial dilutions of

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(NH4 + -N และ NO3_ N) การวิเคราะห์ตัวอย่างซ้ำถูกเขย่า ด้วย 100 mL ของ 2 M KCl สำหรับ h 1 ในเชคเกอร์ในการหมุน (Keeney และเนลสัน 1982), แล้ว slurries ดินถูกกรอง และ NH4 + -N และ NO3_ N วัด colorimetrically ด้วยการวิเคราะห์อย่างต่อเนื่องไหล SKLAR ค่า pH ดินถูกวัดโดยใช้ดิน 1:1 น้ำระงับกับอิเล็กโทรดแก้วคำ ดินอินทรีย์คาร์บอน (SOC) ที่ถูกกำหนด โดยการออกซิเดชันกรด dichromate เปียกตามที่อธิบายไว้ โดยเนลสันและ Sommers (1996) N ทั้งหมดที่ถูกกำหนด โดยวิธี Kjeldahl ไมโคร (Bremner, 1996) รวม P ในดินเนื้อปูนได้กำหนดกระบวนการย่อยอาหารอย่างรวดเร็ว perchloric กรด (Sommers และเนลสัน 1972), และ K ทั้งหมดตามที่อธิบายไว้ โดย Jackson (1967) ความเข้มข้นของดินที่ถูกกำหนด โดยวิธีมาตรฐานเปตต์ (Gee และ Bauder, 1986)2.3 สกัด DNA และเชิงปริมาณ PCR assay ที่คณะทันตแพทยศาสตร์ วันที่ 0, 14 และ 28 จำลองสี่ขวดของแต่ละทรีทเม้นต์ถูกสุ่มเลือกสกัดดีเอ็นเอ และยีน amoA ใช้ PCR เชิงปริมาณ (qPCR) quantitate ดีเอ็นเอถูกสกัดตัวอย่างย่อยสามจาก 0.50 g ของดิน ด้วยการ FastDNA หมุนชุดดิน (MP Biomedicals สหรัฐอเมริกา), ตามโพรโทคอลผู้ผลิต คุณภาพและปริมาณของสารสกัดดีเอ็นเอถูกประเมินโดยใช้การ spectropho-tometer (Nanodrop, PeqLab เยอรมนี), และทางถูกพู และเก็บไว้ที่ _20 _C จนใช้ PCR เชิงปริมาณของยีน amoA ที่ดำเนินการเพื่อประเมินความอุดมสมบูรณ์ของการรับอิเล็กตรอนแอมโมเนียแบคทีเรียและอาร์เคียชุมชน ตามลำดับ ใช้สำหรับรับอิเล็กตรอนแอมโมเนียแบคทีเรียสร้างส่วน bp 491 ไพรเมอร์ amoA-1F (50-GGGGTTTCTACTGGTGGT-30) และ amoA-2R(50-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-30) ประตู-amoA F (50-STAATGGTCTGG-CTTAGACG-30) และอาร์ค amoA R (50-GCGGCCATC-CATCTGTATGT-30) ที่ใช้สำหรับรับอิเล็กตรอนแอมโมเนียอาร์เคียสร้างส่วน bp 635 (Francis et al., 2005) นับเป็นไปตามความเข้มของสีเขียว SYBR fluorescence การ และปฏิกิริยาในแต่ละตัวอย่างได้ดำเนินการเป็น cycler ความร้อนชีวภาพ Rad CFX - 96 นับของยีน amoA ทำในปริมาตรรวมของน้ำยาผสมปฏิกิริยา 25 ml โดย 12.5 ml ของ Premix SYBR Ex TaqTM ดังที่เออร์ (Takara ไบโอสึ ชิงะ ญี่ปุ่น), 0.25 ml แต่ละพื้น (50 mm), 1 ml ของดินดีเอ็นเอต้นแบบ กับเนื้อหาสุดท้ายของ ng 1 – 10 ในแต่ละปฏิกิริยาผสม และ ddH2O 11 ml ชิ้นส่วนสำหรับ AOB และ AOA ได้ทั้งขยายใช้มีขั้นตอน denaturation เริ่มต้นที่ 95 _C 3 นาที ตามรอบ 35 30 s ที่ 95 _C, 30 s ที่ 55 _C, 30 s ที่ _C 72 สำหรับ AOB และ 45 s ที่ _C 72 สำหรับ AOA สำหรับคอลเลกชันข้อมูล fluorescence ปฏิกิริยาทั้งหมดได้เสร็จโค้งละลายราคาเริ่มต้นที่ 65 _C กับการเพิ่มขึ้นของ _C 0.5 ถึง _C 95 ตรวจสอบ amplicon specificity เส้นโค้งมาตรฐาน AOB และ AOA ได้รับใช้ dilutions ประจำของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

(NH4 + -N และ NO3_-N) การวิเคราะห์ตัวอย่างที่ซ้ำกันถูกเขย่าด้วย 100 มิลลิลิตร 2 M KCl เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในการหมุนปั่น (Keeney และเนลสัน, 1982) แล้ว slurries ดินกรองและ NH4 + -N และ NO3_- ยังไม่มีวัด colorimetrically กับการวิเคราะห์ Sklar ไหลอย่างต่อเนื่อง pH ของดินได้รับการวัดโดยใช้ 1: 1 ดินการระงับน้ำที่มีอิเล็กโทรดแก้ว ดินอินทรีย์คาร์บอน (SOC) ถูกกำหนดโดย dichromate กรดออกซิเดชั่เปียกตามที่อธิบายไว้โดยเนลสันและซอมเมอร์ (1996) ปริมาณไนโตรเจนทั้งหมดถูกกำหนดโดยวิธี Kjeldahl ไมโคร (Bremner, 1996) P รวมในดินถูกกำหนดโดยกรดเปอร์คลอริกอย่างรวดเร็วขั้นตอนการย่อยอาหาร (ซอมเมอร์และเนลสัน, 1972) และรวม K ตามที่อธิบายไว้โดยแจ็คสัน (1967) ความเข้มข้นของดินถูกกำหนดโดยวิธีการปิเปตมาตรฐาน (Gee และ Bauder, 1986).
2.3 สกัดดีเอ็นเอและทดสอบ PCR เชิงปริมาณ
ในวันที่บ่ม 0, 14 และ 28 สี่ขวดซ้ำของการรักษาแต่ละถูกสุ่มเลือกในการสกัดดีเอ็นเอและยีน quantitate AMOA วิธี PCR เชิงปริมาณ (qPCR) ดีเอ็นเอที่ถูกสกัดสามตัวอย่างย่อยจาก 0.50 กรัมของดินที่มีชุดปั่น FastDNA ดิน (MP Biomedicals สหรัฐอเมริกา) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต คุณภาพและปริมาณของสารสกัดดีเอ็นเอได้รับการประเมินโดยใช้ tometer spectropho- (Nanodrop, PeqLab เยอรมนี) และได้รับการรวบรวมและเก็บไว้ที่ _20 _C จนกว่าจะใช้ ปริมาณ PCR ของยีน AMOA ได้ดำเนินการในการประเมินความอุดมสมบูรณ์ของแบคทีเรียแอมโมเนียออกซิไดซ์และชุมชนเคีตามลำดับ ไพรพิพิธภัณฑ์ศิลปะ 1F (50 GGGGTTTCTACTGGTGGT-30) และพิพิธภัณฑ์ศิลปะ 2R (50 CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-30) ถูกนำมาใช้สำหรับแบคทีเรียแอมโมเนียออกซิไดซ์สร้างส่วน 491 bp; Arch-AMOA F (50 STAATGGTCTGG-CTTAGACG-30) และ Arch-AMOA R (50 GCGGCCATC- CATCTGTATGT-30) ถูกนำมาใช้สำหรับเคียแอมโมเนียออกซิไดซ์สร้างส่วน 635 bp (ฟรานซิส et al., 2005) ปริมาณขึ้นอยู่กับการเรืองแสงความเข้มของสีย้อม SYBR สีเขียวและปฏิกิริยาสำหรับแต่ละตัวอย่างได้ดำเนินการใน Bio-Rad CFX- 96 Cycler ความร้อน ปริมาณของยีนที่พิพิธภัณฑ์ศิลปะที่ได้รับการดำเนินการในปริมาณรวมของ 25 มิลลิลิตรผสมปฏิกิริยาโดยใช้ 12.5 มิลลิลิตร SYBR พรีมิกซ์ Ex TaqTM ตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต (Takara ไบโอโอตสึชิ, ญี่ปุ่น), 0.25 มล. ของแต่ละไพรเมอร์ (50 มิลลิเมตร) 1 มิลลิลิตรของแม่ดีเอ็นเอดินที่มีเนื้อหาสุดท้ายของการศึกษาใน 1-10 ผสมปฏิกิริยาในแต่ละครั้งและ 11 มล ddH2O ชิ้นส่วนสำหรับ AOB และ AOA ทั้งสองขยายโดยใช้ขั้นตอนที่สูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่ 95 _C เป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบ 30 วินาทีที่ 95 _C, 30 วินาทีที่ 55 _C, 30 วินาทีที่ 72 _C สำหรับ AOB และ 45 S ที่ 72 _C สำหรับ AOA สำหรับการเก็บรวบรวมข้อมูลการเรืองแสง ปฏิกิริยาทั้งหมดถูกจบด้วยเส้นโค้งละลายเริ่มต้นที่ 65 _C กับการเพิ่มขึ้น 0.5 _C ถึง 95 _C เพื่อตรวจสอบความจำเพาะ amplicon เส้นโค้งมาตรฐานสำหรับ AOB และ AOA ได้รับใช้เจือจางอนุกรมของ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( NH4 ) และ no3_ - N ) การวิเคราะห์ตัวอย่างซ้ำถูกเขย่าด้วย 100 มิลลิลิตร 2 m . 1 H บนเครื่องปั่นหมุน ( ตีนีย์เนลสัน , 1982 ) แล้วดิน slurries ถูกกรองและ NH4 - N และ no3_ - วัด colorimetrically กับ Sklar ต่อเนื่องวิเคราะห์ การวัด pH ของดินเป็นดินน้ำ 1 : 1 ช่วงล่างกับขั้วไฟฟ้าแก้วดินอินทรีย์คาร์บอน ( ส ) ถูกกำหนดโดยการใช้กรดเปียกตามที่อธิบายไว้โดย เนลสัน และ ซอมเมอร์ ( 1996 ) ไนโตรเจนทั้งหมดถูกกำหนดโดยไมโคร - วิธีเจลดาห์ล ( เบรมเนอร์ , 1996 ) ปริมาณฟอสฟอรัสในดินที่ถูกกำหนดโดยขั้นตอนการย่อยอาหารอย่างรวดเร็วเปอร์คลอริกแอซิด ( ซอมเมอร์เนลสัน , 1972 ) และ K ตามที่อธิบายไว้โดยรวม แจ็คสัน ( 1967 )ความเข้มข้นของดินถูกหาโดยวิธีปิเปตมาตรฐาน ( Gee และ เบาเดอร์ , 1986 )
2.3 การสกัดดีเอ็นเอและใช้ปริมาณใน 1 วัน )
0 , 14 และ 28 , 4 เลียนแบบขวดของการรักษาแต่ละสุ่มเพื่อสกัดดีเอ็นเอและยีนโดยใช้เทคนิคเชิงปริมาณกับ amoa ( qpcr ) ดีเอ็นเอที่สกัด 3 ย่อย ตัวอย่าง จาก 050 กรัมของดินชุดปั่น fastdna ดิน ( MP biomedicals , สหรัฐอเมริกา ) ตามขั้นตอนของผู้ผลิต คุณภาพและปริมาณของดีเอ็นเอที่สกัดได้ถูกประเมินโดยใช้ spectropho - tometer ( nanodrop peqlab , เยอรมนี และ pooled และเก็บไว้ที่ _20 _c จนใช้เทคนิคเชิงปริมาณของ amoa ยีนทำการประเมินความอุดมสมบูรณ์ของแบคทีเรียอาร์เคียออกซิไดซ์แอมโมเนียและชุมชน ตามลำดับ ไพรเมอร์ amoa-1f ( 50 - ggggtttctactggtggt-30 ) และ amoa-2r ( 50 - cccctckgsaaagccttcttc-30 ) ใช้แอมโมเนีย แบคทีเรียสร้างขนาด 491 BP ออกซิไดซ์ ;โค้ง amoa F ( 50 - staatggtctgg-cttagacg-30 ) และโค้ง amoa R ( 50-gcggccatc - catctgtatgt-30 ) ใช้แอมโมเนียออกซิไดซ์อาร์เคียสร้าง 635 ส่วน BP ( ฟรานซิส et al . , 2005 ) ปริมาณขึ้นอยู่กับความรุนแรงของ SYBR กรีนเรืองแสงสีย้อมและปฏิกิริยาของแต่ละตัวอย่างทดลองในไบโอ ราด cfx - 96 Thermal cycler .ส่วนปริมาณของ amoa ยีนแสดงในปริมาณ 25 มิลลิลิตรปฏิกิริยาผสมโดยใช้ 12.5 มิลลิลิตรของ SYBR รวมอดีต taqtm ตามที่อธิบายไว้โดยผู้ขาย ( ทาคาระไบโอทสุ ชิงะ , ญี่ปุ่น ) , 0.25 ml ของแต่ละคู่ ( 50 มม. ) 1 ml ของแม่แบบดีเอ็นเอ ดิน ที่มีเนื้อหาสุดท้าย 1 – 10 กรัมในแต่ละปฏิกิริยาผสม และ ddh2o 11 ml .ชิ้นส่วนสำหรับ aob AOA ทั้งคู่และใช้ขั้นตอนเหล่านี้ ( เริ่มต้นที่ 95 _c นาน 3 นาที แล้วตามด้วย 35 รอบ 30 s 95 _c 30 S 55 _c 30 s 72 _c สำหรับ aob และ 45 S ที่ 72 _c สำหรับ AOA สำหรับการเก็บรวบรวมข้อมูลการเกิดฟลูออเรสเซนซ์ เกิดปฏิกิริยาได้เสร็จกับละลายโค้งเริ่มต้นที่ 65 _c เพิ่มขึ้น 0.5 _c ถึง 95 _c เพื่อตรวจสอบและ specificityเส้นโค้งมาตรฐานสำหรับบัณฑิตวิทยาลัยได้โดยใช้อนุกรมและวิธีการ AOA