Protein determination and enzyme as

Protein determination and enzyme assays of midgut samples of
whole midgut, midgut tissue and midgut contents
Protein was determined based on the method described by
Bradford (1976), using ovalbumin as a standard. General proteolytic
activity was determined with two different substrates: 0.5%
(w/v) fluorescein isothiocyanate-labeled (FITC) casein (casein-
FITC) (fluorescent substrate, useful at pH values above 5) or 0.5%
hemoglobin-FITC (fluorescent substrate, useful at pH values below
4.5). The preparation of the substrates and the assays was based on
the method described by Twining (1994) in 50 mMsodium citratephosphate
buffer at pH 5.5 with casein-FITC or in the same buffer at
pH 3.5 with hemoglobin-FITC as substrate.
Unless otherwise specified, other proteinase assays were
carried out in 50 mM sodium citrate-phosphate buffer, pH 5.5,
with the following fluorescent substrates: 10 mM carbobenzoxy-
Phe-Arg-7-amino-4-methyl coumarin (Z-FR-MCA) (substrate for
trypsin); 10 mM succinyl-Ala-Ala-Phe-MCA (S-AAF-MCA) (selective
substrate for chymotrypsin); and 1 mM e-amino-caproylleucyl-(
S-benzyl) cysteinyl-MCA (selective substrate for cysteine
proteinase). With these substrates, proteinase activity was
measured by methylcoumarin fluorescence (excitation 380 nm
and emission 460 nm). Inhibitors/activators were used at the
following final concentrations: trans-epoxysuccinyl-L-leucyl-amido
(4-guanidino butane) (E-64), 10 mM; benzamidine, 0.25 mM;
EDTA, 5 mM; pepstatin A, 1 mM; chymostatin, 25 mM; EDTA/DTT,
3/1.5 mM; and soybean trypsin inhibitor (SBTI), 17 mM. These
substances were pre-incubated with the supernadant of whole
midgut homogenates at room temperature for 15 min before
adding the substrate.
Unless otherwise specified, aminopeptidase, amylase and
maltase were determined as follows: aminopeptidase was assayed
in 50 mM Tris–HCl buffer (pH 7.0) using 1 mM L-leucyl-pnitroanilide
(LpNA), based on the method described by Erlanger
et al. (1961); amylase was measured by determining the
appearance of reducing groups (Noelting and Bernfeld, 1948) in
50 mM sodium citrate-phosphate buffer at pH 6.0 with 0.5% (w/v)
starch as substrate in the presence of 10 mM NaCl; and maltase
was assayed based on the method described by Dahlqvist (1968),
using 7 mM maltose in 50 mM sodium citrate-phosphate buffer at
pH 6.0.
Incubations were carried out at 30 8C in at least four different
time periods and initial hydrolysis rates were calculated. All assays
were performed under conditions in which the product was
proportional to enzyme concentration and incubation time

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โปรตีนเอนไซม์และการ assays midgut ตัวอย่างของทั้ง midgut เนื้อเยื่อของ midgut และเนื้อหา midgutโปรตีนได้กำหนดตามวิธีที่อธิบายโดยแบรดฟอร์ด (1976), ใช้ ovalbumin เป็นมาตรฐาน Proteolytic ทั่วไปกิจกรรมถูกกำหนด ด้วยพื้นผิวที่แตกต่างกันสอง: 0.5%(w/v) fluorescein isothiocyanate ป้าย (FITC) เคซีน (เคซีน-FITC) (เรืองแสงพื้นผิว ประโยชน์ที่ค่า pH สูงกว่า 5) หรือ 0.5%ฮีโมโกลบิน-FITC (เรืองแสงพื้นผิว ประโยชน์ที่ค่า pH ค่าด้านล่าง4.5) การเตรียมพื้นผิวที่น่า assays เป็นไปตามวิธีการอธิบาย โดย Twining (1994) ใน 50 mMsodium citratephosphateบัฟเฟอร์ที่ pH 5.5 FITC เคซีน หรือ ในบัฟเฟอร์ที่เดียวกันpH 3.5 กับฮีโมโกลบิน FITC เป็นพื้นผิวยกเว้นระบุเป็นอย่างอื่น assays proteinase อื่น ๆ ได้ดำเนินการใน 50 มม.ซิเตรตโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 5.5กับพื้นผิวเรืองแสงต่อไปนี้: carbobenzoxy 10 มม. -Coumarin Phe-Arg-7-amino-4-methyl (Z-FR-MCA) (พื้นผิวสำหรับทริปซิน); 10 มม. succinyl-อลาอลาเพ-MCA (S AAF MCA) (เลือกพื้นผิวสำหรับ chymotrypsin); และอีมม. 1-อะมิโน-caproylleucyl-(S-benzyl) cysteinyl-MCA (เลือกพื้นผิวสำหรับ cysteineproteinase) กับพื้นผิวเหล่านี้ กิจกรรม proteinase ไม่วัด โดย methylcoumarin fluorescence (ในการกระตุ้น 380 nmกมลพิษ 460 nm) Inhibitors/คริปต์ ถูกใช้ในการต่อความเข้มข้นสุดท้าย: ทรานส์-epoxysuccinyl-L-leucyl-amido(นำ 4-guanidino) (E-64), 10 มม. benzamidine, 0.25 mMEDTA, 5 มม. pepstatin A, 1 mM chymostatin, 25 มม. EDTA/DTT3/1.5 มม. และสารยับยั้งทริปซินถั่วเหลือง (SBTI), 17 มม. เหล่านี้สารได้ก่อนที่ incubated กับ supernadant ของทั้งหมดhomogenates midgut อุณหภูมิห้องสำหรับ 15 นาทีก่อนเพิ่มพื้นผิว, Aminopeptidase, amylase และmaltase ถูกกำหนดเป็นดังนี้: aminopeptidase ถูก assayedใน 50 มม.ตรี – HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.0) ใช้ 1 มม. L-leucyl-pnitroanilide(LpNA), ตามวิธีที่อธิบายไว้ โดย Erlangeral. ร้อยเอ็ด (1961); amylase ถูกวัดด้วยการลักษณะของกลุ่ม (Noelting และ Bernfeld, 1948) ที่ลดลงใน50 มม.ซิเตรตโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่ pH 6.0 0.5% (w/v)แป้งเป็นพื้นผิวในต่อหน้าของ NaCl; 10 มม. และ maltaseถูก assayed ตามวิธีที่อธิบายไว้ โดย Dahlqvist (1968),ใช้ 7 มม maltose ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตโซเดียมซิเตรต 50 มม.ที่pH 6.0Incubations ได้ดำเนินการใน 30 8C ในน้อยสี่แตกต่างกันมีคำนวณรอบระยะเวลาและราคาเริ่มต้นไฮโตรไลซ์ Assays ทั้งหมดได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่ผลิตภัณฑ์ถูกสัดส่วนกับเวลาความเข้มข้นและคณะทันตแพทยศาสตร์ของเอนไซม์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ความมุ่งมั่นและการวิเคราะห์โปรตีนเอนไซม์ตัวอย่างกระเพาะของ
ทั้งกระเพาะเนื้อเยื่อกระเพาะและเนื้อหากระเพาะ
โปรตีนถูกกำหนดขึ้นอยู่กับวิธีการที่อธิบายโดย
แบรดฟอ (1976) โดยใช้ ovalbumin เป็นมาตรฐาน โปรตีนทั่วไป
กิจกรรมที่ถูกกำหนดด้วยพื้นผิวที่แตกต่างกันสอง: 0.5%
(w / v) fluorescein isothiocyanate ติดฉลาก (FITC) เคซีน (casein-
FITC) (พื้นผิวเรืองแสงที่มีประโยชน์ที่ค่าพีเอชสูงกว่า 5) หรือ 0.5%
ฮีโมโกล-FITC (พื้นผิวเรืองแสง ประโยชน์ที่ค่าพีเอชด้านล่าง
4.5) การเตรียมความพร้อมของพื้นผิวและการตรวจก็ขึ้นอยู่กับ
วิธีการที่อธิบายโดย Twining (1994) 50 mMsodium citratephosphate
บัฟเฟอร์ที่ pH 5.5 ที่มีเคซีน FITC หรือในบัฟเฟอร์เดียวกันที่
ค่า pH 3.5 ที่มีฮีโมโกล-FITC เป็นสารตั้งต้น.
เว้นแต่จะระบุเป็นอย่างอื่น ตรวจโปรอื่น ๆ ที่ถูก
ดำเนินการใน 50 มิลลิโซเดียมซิเตรทบัฟเฟอร์ฟอสเฟตค่า pH 5.5
ที่มีพื้นผิวเรืองแสงดังต่อไปนี้: 10 มิลลิ carbobenzoxy-
เพ-Arg-7-อะมิโน-4-methyl coumarin (Z-FR-เอ็ม) (สารตั้งต้นสำหรับ
trypsin); 10 มิลลิเป็น Succinyl Ala-Ala-เพเอ็ม (S-เพื่อนเอ็ม) (เลือก
พื้นผิวสำหรับ chymotrypsin); 1 มิลลิ E-อะมิโน caproylleucyl- (
S-benzyl) cysteinyl เอ็ม (สารตั้งต้นเลือกสำหรับ cysteine
​​โปร) ด้วยพื้นผิวเหล่านี้กิจกรรมโปรถูก
วัดจากการเรืองแสง methylcoumarin (380 นาโนเมตรการกระตุ้น
และการปล่อย 460 นาโนเมตร) ยับยั้ง / activators ถูกนำมาใช้ใน
ความเข้มข้นสุดท้ายต่อไปนี้: ทรานส์ epoxysuccinyl-L-leucyl-amido
(4 guanidino บิวเทน) (E-64), 10 มิลลิ; benzamidine, 0.25 มิลลิ;
EDTA 5 มิลลิ; pepstatin 1 มิลลิ; chymostatin 25 มิลลิ; EDTA / DTT,
3 / 1.5 มิลลิ; และยับยั้ง trypsin ถั่วเหลือง (SBTI) 17 มิลลิ เหล่านี้
สารที่ได้รับก่อนการบ่มกับ supernadant ทั้ง
homogenates กระเพาะที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาทีก่อนที่จะ
. เพิ่มพื้นผิว
ได้ระบุไว้ aminopeptidase อะไมเลสและ
maltase ได้รับการพิจารณาดังนี้ aminopeptidase ได้รับการวิเคราะห์
ใน 50 มิลลิบัฟเฟอร์ Tris-HCl (pH 7.0) โดยใช้ 1 มิลลิ L-leucyl-pnitroanilide
(LpNA) ขึ้นอยู่กับวิธีการที่อธิบายโดยเลน
et al, (1961); อะไมเลสได้รับการวัดโดยการกำหนด
ลักษณะของการลดกลุ่ม (Noelting และ Bernfeld, 1948) ใน
โซเดียมซิเตรทบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 50 mM ที่ pH 6.0 กับ 0.5% (w / v)
แป้งเป็นสารตั้งต้นในการปรากฏตัวของ 10 มิลลิโซเดียมคลอไรด์; และ maltase
ได้รับการวิเคราะห์ตามวิธีการอธิบายโดย Dahlqvist (1968)
โดยใช้มอลโตสมิลลิ 7 ใน 50 มิลลิโซเดียมซิเตรทบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่
พีเอช 6.0.
ฟักตัวของเชื้อที่ได้ดำเนินการวันที่ 30 8C ในอย่างน้อยสี่ที่แตกต่างกัน
ระยะเวลาและอัตราการย่อยสลายเป็นครั้งแรก คำนวณ ตรวจทั้งหมด
ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่สินค้าเป็น
สัดส่วนกับความเข้มข้นของเอนไซม์และเวลาการบ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ปริมาณของโปรตีนและเอนไซม์ทดสอบประสิทธิภาพและเหมาะสม ตัวอย่างของประสิทธิภาพและเหมาะสมทั้งประสิทธิภาพและเหมาะสม
, เนื้อเยื่อและประสิทธิภาพและเหมาะสม เนื้อหา
โปรตีนถูกกำหนดตามวิธีที่อธิบายไว้โดย
แบรดฟอร์ด ( 1976 ) , ใช้โอวัลบูมินเป็นมาตรฐาน กิจกรรมระ
ทั่วไปตั้งใจกับสองพื้นผิวที่แตกต่างกัน : 0.5 %
( w / v ) ไอโซไทโอไซยาเนต ( fitc ี่ติดป้าย เคซีน ( casein ) -
fitc ) ( fluorescent ตั้งต้นประโยชน์ที่ค่า pH สูงกว่า 5 ) หรือ 0.5 %
( ฮีโมโกลบิน fitc เรืองแสงหลากหลาย ประโยชน์ที่ค่า pH ต่ำกว่า
4.5 ) การเตรียมพื้นผิว และสามารถใช้วิธีการบรรยายโดย
ทไวนิง ( 1994 ) ใน 50 mmsodium citratephosphate
บัฟเฟอร์ที่ pH ประมาณ 5.5 กับเคซีน fitc หรือในบัฟเฟอร์พีเอช 3.5 กับฮีโมโกลบินเหมือนกัน

fitc เป็นสับสเตรท เว้นแต่จะระบุเป็นอย่างอื่นหรือโปรตีนอื่น
ออกมา 50 มิลลิโมลาร์โซเดียมซิเตรตฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 5.5 ,
กับพื้นผิวเรืองแสงต่อไปนี้ : 10 มม. carbobenzoxy -
phe-arg-7-amino-4-methyl คูมาริน ( z-fr-mca ) ( พื้นผิวสำหรับ
ทริป ) ; 10 มม. ซัคซินิลเอ๋เอ๋เพเอ็ม ( s-aaf-mca ) ( ( selective
สำหรับเอนไซม์ไคโมทริปซิน และ e-amino-caproylleucyl 1 มม. - (
s-benzyl ) cysteinyl เอ็ม ( 8-12
เลือกพื้นผิวโปรตีน ) กับพื้นผิวเหล่านี้กิจกรรมโปรได้
วัดโดย methylcoumarin เรืองแสง ( กระตุ้น 380 nm
และการปล่อย 460 nm ) สารยับยั้ง / ใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้าย : trans-epoxysuccinyl-l-leucyl-amido

ต่อไปนี้ ( 4-guanidino บิวเทน ) ( e-64 ) , 10 mm ; benzamidine 0.25 มม. ;
EDTA 5 มม. ; pepstatin , 1 มม. ; chymostatin 25 มม. ; EDTA / DTT ,
3 / 1.5 มม. ;