Real-time PCR analysis was performe

Real-time PCR analysis was performed as described by Jain [27]. In brief, the cDNA samples were used as the template and mixed with 200 nM of each primer and SYBR Green PCR Real Master Mix (Tiangen, Beijing, China) for real-time PCR analysis using ABI 7500 Real Time PCR System and Software 7500 v2.0.3 (Applied Biosystems,USA) according to the manufacturer’s instructions. The PCR conditions were as follows: 95 ◦C for 3 min; 40 cycles of 95 ◦C for30 s, 57 ◦C for 30 s, and 68 ◦C for 1 min. The fluorescence signal was obtained during the elongation at 68 ◦C of every cycle. Each pair of primers designed using Primer Express 3.0 software (Applied Biosystems, USA) was checked based on the BLAST program in tomato genomic sequence available in SGN and NCBI databases to ensure that the primers amplify a unique and desired cDNA segment.
The primer sequences are listed in Table 1. The specificity of the reactions was verified by melting curve analysis. The relative mRNA levels for each of the Rubisco genes in RNA isolated from various samples were quantified with respect to the internal standard, actins. RT-qPCR was conducted with three replications.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ที่ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ โดยเจน [27] สังเขป ตัวอย่าง cDNA ถูกใช้เป็นแม่แบบ และผสมกับ 200 nM ของรองพื้นและ SYBR Green PCR จริงหลักผสม (Tiangen ปักกิ่ง จีน) แต่ละสำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้ระบบ ABI 7500 Real Time PCR และซอฟต์แวร์ 7500 v2.0.3 (Biosystems ใช้ สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เงื่อนไข PCR มีดังนี้: 95 ◦C สำหรับ 3 นาที รอบ 40 ของ 95 ◦C for30 s, ◦C 57 สำหรับ 30 s และ ◦C 68 ใน 1 นาที สัญญาณ fluorescence กล่าวระหว่าง elongation ที่ 68 ◦C ทุกวงจร แต่ละคู่ไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยใช้สีรองพื้น Express 3.0 ตรวจสอบซอฟต์แวร์ (Biosystems ใช้ สหรัฐอเมริกา) ตามโปรแกรมระเบิดในมะเขือเทศ genomic ลำดับ SGN และ NCBI ฐานข้อมูลเพื่อให้แน่ใจว่า ไพรเมอร์ที่ขยายเซกเมนต์ cDNA ที่ไม่ซ้ำกัน และต้องมีการลำดับรองพื้นจะแสดงในตารางที่ 1 Specificity ของปฏิกิริยาที่ถูกตรวจสอบ โดยการหลอมวิเคราะห์เส้นโค้ง ระดับ mRNA สัมพันธ์กันสำหรับแต่ละยีน Rubisco ในอาร์เอ็นเอที่แยกต่างหากจากตัวอย่างต่าง ๆ ได้ quantified กับ actins มาตรฐาน ภายใน RT qPCR ถูกดำเนินกับระยะที่สาม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เรียลไทม์วิเคราะห์ PCR ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยเชน [27] ในช่วงสั้น ๆ ตัวอย่าง cDNA ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบและผสมกับ 200 นิวตันเมตรแต่ละสีรองพื้นและสีเขียว SYBR PCR จริงโทผสม (Tiangen, ปักกิ่ง, จีน) สำหรับเรียลไทม์วิเคราะห์ PCR โดยใช้ ABI 7500 จริงระบบ PCR เวลาและซอฟต์แวร์ 7500 v2 .0.3 (Applied Biosystems สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เงื่อนไข PCR มีดังนี้ 95 ◦Cเป็นเวลา 3 นาที; 40 รอบ 95 ◦C for30 วินาที, 57 ◦Cเป็นเวลา 30 วินาที, และ 68 ◦Cเป็นเวลา 1 นาที สัญญาณการเรืองแสงเกิดขึ้นในระหว่างการยืดตัวที่ 68 ◦Cของทุกวงจร คู่ของไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ศึกษาด่วน 3.0 ซอฟแวร์ (Applied Biosystems, USA) แต่ละคนได้รับการตรวจสอบขึ้นอยู่กับโปรแกรมการระเบิดในมะเขือเทศลำดับจีโนมที่มีอยู่ใน SGN และ NCBI ฐานข้อมูลเพื่อให้แน่ใจว่าไพรเมอร์ขยายกลุ่มยีนที่เป็นเอกลักษณ์และต้องการ
ศึกษาเป็นลำดับ ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 ความจำเพาะของปฏิกิริยาที่ได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์เส้นโค้งการละลาย ระดับ mRNA ญาติสำหรับแต่ละยีน Rubisco ในอาร์เอ็นเอที่แยกได้จากตัวอย่างต่าง ๆ วัดที่เกี่ยวกับมาตรฐานภายใน actins RT-qPCR ได้ดำเนินการกับสามซ้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์ PCR เวลาจริงแสดงตามที่อธิบายไว้โดยเชน [ 27 ] ในช่วงสั้น ๆ , วิธีกลุ่มตัวอย่างที่ใช้เป็นแม่แบบ และผสมกับ 200 nm ของแต่ละคู่สีเขียว SYBR ) และหลักที่แท้จริงผสม ( tiangen , ปักกิ่ง , จีน ) สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้ ABI 7500 เวลา PCR จริงและระบบซอฟต์แวร์ 7500 v2.0.3 ( Applied Biosystems , USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตโดยเงื่อนไขดังนี้ 95 ◦ C เป็นเวลา 3 นาที ; 40 รอบ 95 ◦ C 30 , 57 ◦เป็นเวลา 30 วินาที และ 1 นาที 68 ◦ C เรืองแสงสัญญาณได้ในระหว่างเวลาที่ 68 ◦ C ของทุกๆรอบ แต่ละคู่ของไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยใช้ไพรเมอร์ Express 3.0 ซอฟต์แวร์ประยุกต์ Biosystems ( ,สหรัฐอเมริกา ) คือตรวจยึดระเบิดมะเขือเทศจีโนมลำดับโปรแกรมในที่มีอยู่ใน ncbi SGN และฐานข้อมูลเพื่อให้แน่ใจว่า ไพรเมอร์ที่ไม่ซ้ำกันและขยายส่วนยีนที่ต้องการ
รองพื้นลำดับอยู่ในตารางที่ 1 ความจำเพาะของปฏิกิริยาถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้งญาติระดับ mRNA ของยีนในแต่ละ rubisco RNA ที่แยกได้จากตัวอย่างต่างๆ วัด ไหว้พระ มาตรฐาน ภายใน actins . RT qpcr จำนวน 3 ซ้ำ