DNA extractionThe nucleic acids wer

DNA extraction
The nucleic acids were extracted by using High Pure PCR
Template preparation Kit (Roche, Mannheim, Germany). Two
μl of each DNA-preparation were checked on 1 % agarose gel
and staining with ethidium bromide in order to evaluate the
template integrity. The DNA concentrations were measured
with Nanodrop photometer (UV/Vis spectrophotometer Implen,
München, Germany).
Polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment
analysis and sequencing
Phytoplasma detection was by nested PCR (nPCR) with
different primer pairs which bound to different regions of
the 16S rDNA of phytoplasma (Fig. 1) (Heinrich et al. 2001;
Srivastava et al. 2005). The phytoplasma strains were differentiated
and classified by RFLP analysis of PCR-amplified
16S rDNA (Lee et al. 1998; Kirkpatrick et al. 1994). Restriction
endonuclease HinfI (MBI Fermentas, Leon-Rot, Germany)
was used. The products were separated by electrophoresis
on 2 % agarose gels and stained with ethidium bromide.
The identification was made according Lee et al. (1998) and
Hanboonsong et al. (2002).
TaqMan real-time PCR was performed in optical 96-well
plates with optical adhesive covers using a Bio-Rad iCycler
thermal cycler (My iQ Optical Module) in a total volume of
50 μl or 20 μl, including 5 μl or 2 μl respectively of DNA
extracts (100 to 200 ng/μl) and TaqMan core reagents (SensiMix
II probe (2X) kit BIOLINE) or SsoFast Probes Supermix kit
(BIO-RAD, München). Primers were used at a final concentration
of 400 nM and probes at 100 nM. All primers and probes
were designed according Christensen et al. (2004) and synthesized
by Eurofins MWG/operon (Ebersberg, Germany). Probes
were labeled at the 5′ end with 6-carboxyfluorescein as reporter
and at 3′ end with 6-tetramethylrhodamine as fluorescent
quencher. Each sample was tested in triplicate and negative
controls containing nuclease-free water in the place ofDNAwere
included in all runs. In additions, phytoplasma–infected periwinkle
and phytoplasma–infected sugarcane were used as positive
controls. The thermal cycling conditions were 10 min at 95 °C
for one cycle as initial activation, followed by 40 cycles each
consisting of 15 s denaturation at 95 °C and 1 min each of
annealing and extension at 60 °C.
The partial sequence of 16S/23S rDNA intergenic spacer
was determined. The PCR products were separated on agarose
gels and extracted using Agarose Gel DNA Extraction
Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Sequence
data were deposited in GenBank (accession number
HQ917068). The obtained nucleotide sequences were compared
with sequences of phytoplasmas and acholeplasmas
from GenBank using the BLASTN program (http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi).
Phylogenetic tree
Multiple alignments of 16S/23S intergenic spacer sequences
were examined using MUSCLE software. Phylogenetic trees
were constructed for the aligned data by maximum likelihood
estimation with Geneious program through the PhyML software
(Guindon and Gascuel 2003), relative to phytoplasma strains.
Bootstrap analysis was performed 1,000 times to evaluate branch
supports in a sound statistical framework.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สกัดดีเอ็นเอกรดนิวคลีอิกถูกสกัด โดยใช้ PCR บริสุทธิ์สูงแม่เตรียมชุด (โร มา เยอรมนี) สองΜl เตรียมดีเอ็นเอแต่ละถูกตรวจสอบในเจ 1% agaroseและย้อมสี ด้วยโบรไมด์ ethidium เพื่อประเมินการความสมบูรณ์แบบ มีวัดความเข้มข้นดีเอ็นเอมีเครื่องวัดความสว่าง Nanodrop (UV/Vis เครื่องทดสอบกรดด่าง Implenโฮเต็ลมันเช็น เยอรมนี)ปฏิกิริยาพอลิเมอเรสลูกโซ่ (PCR), ส่วนจำกัดวิเคราะห์และจัดลำดับตรวจ Phytoplasma ถูก โดย PCR ซ้อน (nPCR) ด้วยคู่รองพื้นต่าง ๆ ที่ผูกไว้กับภูมิภาคต่าง ๆ ของrDNA 16S ของ phytoplasma (Fig. 1) (ไฮน์ริช et al. 2001Srivastava et al. 2005) สายพันธุ์ phytoplasma ได้แตกต่างกันและลับ โดยการวิเคราะห์ RFLP ของ PCR ขยาย16S rDNA (Lee et al. 1998 Kirkpatrick et al. 1994) ข้อจำกัดendonuclease HinfI (MBI Fermentas ลีออน-Rot เยอรมนี)ใช้ ผลิตภัณฑ์ถูกคั่น ด้วย electrophoresisใน 2% agarose เจ กสีกับโบรไมด์ ethidiumรหัสทำตามลี et al. (1998) และHanboonsong et al. (2002)TaqMan ทำ PCR แบบเรียลไทม์ใน 96 แสงดีแผ่นด้วยแสงครอบคลุมใช้ iCycler Bio Radความร้อน cycler (iQ ของฉันโมแสง) ในปริมาณรวมของ50 μl หรือ μl 20, 5 μl หรือ μl 2 ตามลำดับของดีเอ็นเอสารสกัด (ng 100 ถึง 200 μl) และ reagents หลักของ TaqMan (SensiMixสองโพรบ (2 X) ชุดนำ) หรือชุด Supermix คลิปปากตะเข้ SsoFast(ไบโอ-RAD โฮเต็ลมันเช็น) ใช้ไพรเมอร์ที่เข้มข้นสุดท้าย400 nM และคลิปปากตะเข้ 100 nM ไพรเมอร์และคลิปปากตะเข้ทั้งหมดถูกออกแบบมาตามคริสเตนเซ่นและ al. (2004) และสังเคราะห์โดย Eurofins MWG/operon (Ebersberg เยอรมนี) คลิปปากตะเข้ป้ายท้าย 5′ กับ 6 carboxyfluorescein เป็นโปรแกรมรายงานและที่ 3′ กับ tetramethylrhodamine 6 เป็นเรืองแสงquencher แต่ละตัวอย่างที่ทดสอบใน triplicate และลบประกอบด้วยน้ำฟรี nuclease ใน ofDNAwere ควบคุมรวมในการทำงานทั้งหมด ในส่วนเพิ่มเติม periwinkle phytoplasma – การติดเชื้อและอ้อย phytoplasma – ติดถูกใช้เป็นค่าบวกควบคุม เงื่อนไขความร้อนขี่ได้ 10 นาทีที่ 95 ° Cสำหรับวงจรหนึ่งเป็นเปิดใช้งานเริ่มต้น ตาม ด้วย 40 รอบประกอบด้วย 15 s denaturation ที่ 95 ° C และ 1 นาทีแต่ละของการอบเหนียวและ 60 องศาเซลเซียสลำดับบางส่วนของ 16S/23S rDNA intergenic เป็นตัวเว้นวรรคที่ถูกกำหนด ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกจากกันใน agaroseเจ และสกัดโดยใช้การสกัดดีเอ็นเอเจล Agaroseชุด (โรชวินิจฉัย มา เยอรมนี) ลำดับข้อมูลนำมาฝากใน GenBank (เลขทะเบียนHQ917068) มีการเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้รับมีลำดับของ phytoplasmas และ acholeplasmasจาก GenBank ที่ใช้โปรแกรม BLASTN (http://blastncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi)ทรี phylogeneticจัดแนวหลายลำดับเป็นตัวเว้นวรรค intergenic 16S/23Sได้ตรวจสอบการใช้ซอฟต์แวร์ของกล้ามเนื้อ ต้นไม้ phylogeneticสร้างข้อมูลการจัดตำแหน่งตามความเป็นไปได้สูงสุดการประเมิน ด้วยโปรแกรม Geneious โดยใช้ซอฟต์แวร์ PhyML(Guindon และ Gascuel 2003), สัมพันธ์กับสายพันธุ์ phytoplasmaเริ่มต้นระบบวิเคราะห์ทำ 1000 ครั้งการประเมินสาขาสนับสนุนในกรอบงานสถิติเสียง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอสกัด
กรดนิวคลีอิกถูกสกัดโดยใช้วิธี PCR บริสุทธิ์สูง
เตรียมแม่แบบ Kit (โรชไฮม์, เยอรมนี) สอง
ไมโครลิตรของแต่ละดีเอ็นเอเตรียมถูกตรวจสอบเมื่อวันที่ 1% agarose เจล
และการย้อมสีด้วย ethidium bromide เพื่อประเมิน
ความสมบูรณ์ของแม่แบบ ความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูกวัด
ด้วยมาตรวัด Nanodrop (UV / Vis spectrophotometer Implen,
มิวนิค, เยอรมนี).
โพลีเมอปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) ส่วนข้อ จำกัด
การวิเคราะห์และการจัดลำดับ
การตรวจสอบ Phytoplasma โดยวิธี PCR ที่ซ้อนกัน (nPCR) กับ
คู่ไพรเมอร์ที่แตกต่างกันซึ่งผูกไว้กับภูมิภาคที่แตกต่างกัน ของ
16S rDNA ของ phytoplasma (รูปที่ 1.) (เฮ็น et al, 2001;.
. Srivastava et al, 2005) สายพันธุ์ที่แตกต่าง phytoplasma ถูก
แบ่งโดยการวิเคราะห์ RFLP ของ PCR-ขยาย
16S rDNA (Lee et al, 1998;.. เคิร์กแพ et al, 1994) ข้อ จำกัด
endonuclease HinfI (MBI Fermentas, Leon-Rot, เยอรมนี)
ถูกนำมาใช้ ผลิตภัณฑ์ที่ถูกแยกออกจากอิเล็ก
เมื่อวันที่ 2% agarose เจลและย้อมด้วย ethidium bromide.
บัตรประจำตัวที่ถูกสร้างขึ้นตาม Lee et al, (1998) และ
Hanboonsong et al, (2002).
TaqMan PCR เรียลไทม์ได้ดำเนินการในออปติคอล 96 หลุม
ด้วยกาวแผ่นแสงครอบคลุมการใช้ Bio-Rad iCycler
Cycler ร้อน (Optical iQ ของฉัน Module) ในปริมาณรวมของ
50 ไมโครลิตรหรือ 20 ไมโครลิตรรวมทั้ง 5 ไมโครลิตรหรือ 2 ไมโครลิตรตามลำดับของดีเอ็นเอของ
สารสกัด (100-200 นาโนกรัม / ไมโครลิตร) และ TaqMan น้ำยาหลัก (SensiMix
สอบสวน II (2X) BIOLINE ชุด) หรือ SsoFast Probes Supermix ชุด
(BIO-RAD, มิวนิค) ไพรเมอร์ถูกนำมาใช้ในความเข้มข้นสุดท้าย
400 นาโนเมตรและโพรบที่ 100 นาโนเมตร ไพรเมอร์และยานสำรวจ
ได้รับการออกแบบตามคริสและอัล (2004) และสังเคราะห์
โดย Eurofins MWG / operon (Ebersberg, เยอรมนี) พร็อบ
มีป้ายที่ 5 'จบลงด้วย 6 carboxyfluorescein เป็นนักข่าว
และที่ 3 'จบลงด้วย 6 tetramethylrhodamine เป็นเรือง
ดับ ตัวอย่างแต่ละคนได้รับการทดสอบในเพิ่มขึ้นสามเท่าและลบ
ที่มีการควบคุมน้ำนิฟรีในสถานที่ ofDNAwere
รวมในการทำงานทั้งหมด ในการเพิ่มการ phytoplasma หอยขมที่ติดเชื้อ
และอ้อย phytoplasma ที่ติดเชื้อถูกนำมาใช้เป็นบวก
ควบคุม เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนเป็นเวลา 10 นาทีที่ 95 องศาเซลเซียส
สำหรับหนึ่งรอบเป็นยืนยันการใช้งานครั้งแรกตามด้วย 40 รอบแต่ละ
ประกอบด้วย denaturation 15 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและ 1 นาทีของแต่ละ
หลอมและการขยายที่ 60 ° C.
ตามลำดับส่วน 16S / 23S rDNA intergenic spacer
ถูกกำหนด ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกบน agarose
เจลและสารสกัดใช้ Agarose เจลสกัดดีเอ็นเอ
Kit (วินิจฉัยโรชไฮม์, เยอรมนี) ลำดับ
ข้อมูลที่ได้มาฝากใน GenBank (เข้าจำนวน
HQ917068) ลำดับเบสที่ได้ถูกนำมาเปรียบเทียบ
กับลำดับของไฟโตพลาสมาและ acholeplasmas
จาก GenBank โดยใช้โปรแกรม BLASTN (http: //. ระเบิด
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi).
Phylogenetic ต้นไม้
การจัดแนวหลาย 16S / 23S intergenic ลำดับ spacer
อยู่ การตรวจสอบการใช้ซอฟต์แวร์ของกล้ามเนื้อ ต้นไม้ที่
ถูกสร้างขึ้นสำหรับข้อมูลชิดโดยโอกาสสูงสุด
ประมาณค่าด้วยโปรแกรม Geneious ผ่านซอฟต์แวร์ PhyML
(Guindon และ Gascuel 2003) เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ phytoplasma.
วิเคราะห์เงินทุนที่ได้ดำเนินการ 1,000 ครั้งเพื่อประเมินสาขา
สนับสนุนในกรอบทางสถิติเสียง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดดีเอ็นเอกรดนิวคลีอิก
ถูกสกัดโดยใช้เทคนิคการเตรียมแม่แบบชุดสูงเพียว
( โรช Mannheim , เยอรมัน ) 2
μ L แต่ละดีเอ็นเอเตรียมถูก 1 % เจล
แล้วย้อมด้วยทิเดียมโบรไมด์ เพื่อที่จะประเมิน
แม่แบบสมบูรณ์ ดีเอ็นเอปริมาณวัด
กับ nanodrop โฟโตมิเตอร์ ( UV / VIS Spectrophotometer implen
, M ü nchen
, เยอรมัน )ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) , ข้อ จำกัด การวิเคราะห์และการตรวจหาลำดับเบส

เชื้อไฟโตพลาสมา โดยซ้อน PCR ( npcr ) ด้วยไพรเมอร์คู่ซึ่งแตกต่างกัน

ผูกกับภูมิภาคต่างๆของ 16S rDNA ของเชื้อไฟโตพลาสมา ( รูปที่ 1 ) ( Heinrich et al . 2001 ;
ศรีวัสทวา et al . 2005 ) สายพันธุ์ที่แตกต่างกันจากเชื้อไฟโตพลาสมา และจัดโดยการวิเคราะห์ RFLP

สามารถขยาย 16S rDNA ( ลี et al . 1998 ;Kirkpatrick et al . 1994 ) hinfi
เอนโดนิวคลีเอสจำกัด ( 2 fermentas ลีออนเน่า , เยอรมนี )
ถูกใช้ ผลิตภัณฑ์ที่แยกได้จากตัวอย่าง
2 % ( เจลและเปื้อนทิเดียมโบรไมด์ .
ตัวขึ้นตามลี et al . ( 1998 ) และ
หาญบุญทรง et al . ( 2545 ) .
taqman เรียลไทม์ซึ่งเป็นการแสงดี
96แผ่นด้วยกาวแสงครอบคลุมโดยใช้ไบโอ ราด icycler
Thermal cycler ( ไอคิวของฉันโมดูลแสง ) ในปริมาตรรวมของ
50 μ L หรือ L 20 μรวมทั้ง 5 μ L หรือ 2 ลิตร ตามลำดับของดีเอ็นเอที่สกัดμ
( 100 - 200 นาโนกรัม / μ L ) และ สารเคมีหลัก taqman ( sensimix
2 โพรบ ( 4 ) ชุด bioline ) หรือ ssofast probes supermix Kit
( Bio-rad M ü nchen ) ไพรเมอร์ที่ใช้ใน
ความเข้มข้นสุดท้าย 400 nm และ probes ที่ 100 นาโนเมตรทั้งหมดชนิดฟิวส์
ถูกออกแบบตาม คริสเตนเซ่น et al . ( 2004 ) และสังเคราะห์
โดย eurofins mwg / โอเปอรอน ( ebersberg , เยอรมัน ) เป็นป้ายที่ 5 ฟิวส์
นั้นจบลงด้วยการเป็นนักข่าว และ 6-carboxyfluorescein
3 นั้นจบลงด้วย 6-tetramethylrhodamine เป็นเรืองแสง
เร . แต่ละตัวอย่างถูกทดสอบทั้งสามใบ และลบ
การควบคุมที่มีนิวเคลียสน้ำฟรีในสถานที่ ofdnawere
รวมอยู่ในวิ่ง ส่วนไฟโตพลาสมาและหอยขม
ติดเชื้อและติดเชื้ออ้อยที่ใช้เป็นเชื้อไฟโตพลาสมาและการควบคุมที่ดี

เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนเป็น 10 นาทีที่ 95 องศา C
สำหรับหนึ่งรอบเป็นครั้งแรกด้วย ตามด้วย 40 รอบแต่ละ
ประกอบด้วย 15 s ( ที่ 95 องศา C และ 1 นาทีแต่ละ
annealing และส่วนขยายที่ 60 ° C .
ลำดับบางส่วนของ 16S rDNA spacer
/ 23s ส่าตั้งใจ . ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกแยกออกจากกันในโรส
เจลและสกัดโดยใช้เจลสกัดดีเอ็นเอ
Kit ( โรชวินิจฉัย Mannheim , เยอรมัน ) ลำดับข้อมูล
ฝากเงินบริเวณ ( หมายเลขภาคยานุวัติ
hq917068 ) การวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์เปรียบเทียบกับลำดับของ phytoplasmas acholeplasmas

และจากขนาดการใช้โปรแกรม blastn ( http : / / ระเบิด
ncbi . nlm . NIH . gov / ระเบิด CGI )

phylogenetic ต้นไม้หลายแนวร่วมของ 16S / 23s ส่า spacer ลําดับ
ถูกตรวจสอบการใช้ซอฟต์แวร์ของกล้ามเนื้อ
ต้นไม้ซึ่งถูกสร้างให้สอดคล้องข้อมูลความเป็นไปได้สูงสุดประมาณ geneious ผ่านโปรแกรม

( กินเดิ้น และ phyml ซอฟต์แวร์ gascuel 2003 ) , เมื่อเทียบกับเชื้อไฟโตพลาสมา
สายพันธุ์การวิเคราะห์การบู 1000 ครั้งเพื่อประเมินสาขา
รองรับเสียงทางสถิติ ดังนี้