1. IntroductionSalmonella is a memb

1. Introduction

Salmonella is a member of the Enterobacteriaceae family, a
large group of Gram-negative, non-spore-forming bacilli and
facultative anaerobes [1]. Salmonella enterica (S. enterica)
causes nearly 99% of Salmonella infections in animals and
humans [2]. The S. enterica includes about 2600 diverse
serotypes which consist of two species, Salmonella bongori
and S. enterica and are divided into six subspecies: salamae,
enterica, diarizonae, arizonae, indica and houtenae [1].
S. enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) is a widely
distributed food-borne pathogen and one of the most popular
causes of bacterial food-borne disease in humans and animals
and deaths globally [3,4]. Salmonellosis is considered one of the
most significant food-borne zoonoses that is viewed in two kinds
of different diseases, enteric fever which can be typhoid or
paratyphoid and gastroenteritis which is non-typhoidal [5,6].
Bacterial pathogen in human causes 21 million cases of
typhoid fever and 200000 deaths per year, mainly in Southern
Asia, Africa and South America [7]. The discovery of a new
vaccine for salmonellosis is a challenge for the scientists.
Several vaccines have undergone clinical tests. The need of an
efficacious vaccine against salmonellosis providing strong
humoral as well as cellular immunity still persists [8].
S. enterica serovars have been classified based on reactivity of
antigen to somatic lipopolysaccharide, flagellar and capsular
antigens. From a clinical aspect, these may be broadly
grouped on the basis of host range and disease representation
[9]. The Salmonella pathogenicity islands (SPIs) 1 and 2 are
two important virulence determinants of S. enterica. They
encode type III secretion systems (T3SS), which carry the
effector proteins and enable the injection of effector proteins
directly into the cytosol of eukaryotic cells. These effectors
finally manipulate the cellular functions of the infected host
and comfort the development of the infection [10]. At present,
21 SPIs have been recognized in Salmonella. Many of the
identified SPI-encoded genes have only putative functions
with no obvious role in Salmonella pathogenesis.

The SPI-1 locus is a 40 kb chromosomal island, which carries
among all the others genes needed for the biosynthesis of a
functional T3SS, a number of some effector and regulatory
proteins and their chaperones [1]. The T3SS allows the secreted
proteins to pass through the bacterial outer and inner membranes
and a translocon creates a pore in the host cell membrane [11].
Location and function of these proteins in this system are
shown below. Inner membrane proteins: InvA, SpaP, Q, R, S;
associated inner membrane proteins: InvA, E; outer membrane
proteins: InvG, PrgK, PrgH; chaperone: SicA; putative
chaperone: InvI; secreted proteins involved in secretion: InvJ,
SpaO; secreted proteins with an effector function (target
proteins): SipA, SipB, Salmonella invasion protein C (SipC),
SipD, SptP [12].

Invasion is initiated by pathogen binding to the host cell
surface [13]. After invasion and entering the lumen of the small
intestine, environmental conditions enable T3SS-1 genes to be
expressed and subsequently the secretion system to be assembled
at the bacterial membrane [14]. Cell entry is determined by
rearrangements of the actin cytoskeleton, which is partly
interceded by SipC, a component of the bacterial translocon, at
the place of bacteria–host-cell contact [1]. SipC includes two
membrane-spanning areas with C- and N-terminal domains
front of the host-cell cytoplasm. This topological assembly of this
effector protein is a reason to the actin nucleation and the translocation
processes. Remarkably, both of these processes are primarily
dependent on the C-terminus of SipC. SipC can localize
actin polymerization at bacterial attachment site and employ actin
directly [15]. Kanamycin is inactivated with the aminophosphotransferases
by transferring the g-phosphate to the OH
group in the 30 position of the pseudosaccharide. The kan gene
was cloned and transformed in Escherichia coli (E. coli) cells [16].

The purpose of this study was to generate a plasmid that
carries kanamycin resistance gene replacement of S. typhimurium
native sipC gene with Up-Kan-Down fragment, using homologous
recombination technique.


2. Materials and methods

2.1. Bacterial complex, plasmids construction and
media

In this study, the protocol and informed consent forms were
approved by the Islamic Azad University, Shahrekord Branch,
Shahrekord, Iran with 17621105 grant number. Virulent S.
Typhimurium (ATCC-13311) collected from Microbiology
Laboratory of Islamic Azad University of Shahrekord Branch
was preserved as frozen glycerol stocks and cultured into Luria-
Bertani (LB) broth until the log growth phase (optical density
600 = 0.9) was reached. The kan gene was isolated from the
pET-28 vector. For cloning, preservation of DNA fragment and
subcloning, pGEM T-easy vector using TA cloning kit (Promega,
U.S) and pET-32 vector with E. coli strain TOP10F0 were
used, respectively. Bacterial cultures were grown at 37 C in LB
broth and LB agar plates.

2.2. Extraction of genomic DNA from S. typhimurium
DNA was isolated from colonies of bacteria using DNA
extraction kit (DNP™ Kit, CinnaGen, Iran) according to the
manufacturer's protocol. The quality of DNA was checked on 1%
agarose gel electrophoresis and quantified by spectrophotometric
mensuration at 260 nm, according to Sambrook and Russell [17].

2.3. Amplification of flanking regions of sipC gene and
kan gene

Oligonucleotide primers were designed for amplification of
flanking regions of sipC gene of S. typhimurium. The sequences
of these primers were up-sipC-F: 50-ATGTCTAGA
CCCTAAATAAAGTGGCG-30 and up-sipC-R: 50 ATTAG
ATCTCTCCCTTTATTTGGCAG-30 (accession number:
CP008928.1) containing Xba I and Bgl II restriction sites and
down-sipC-F: 50-ATTGAGCTCTGACCACTGAAAGCCAC-30
and down-sipC-R: 50-ACACTCGAGTAATACCCAGACTT
TCCG-30 (accession number: CP007360.1) containing Sac I and
Xho I restriction sites. Primers were used for amplification of up
and down region of sipC gene, respectively. Moreover, kan-F:
50-ATAAGATCTATGAGCCATATTCAGCGTG-30 and kan-
R: 50-ATAGAGCTCTTAGAAAAATTCATCCAG-30 primers
containing Bgl II and Sac I restriction sites were designed for
amplification of kan gene and pET-28 vector was used as template.
Underlined sequences indicate restriction sites.

Three collections of PCR programs were performed singly
in high volume for amplification of kan gene and up and
down regions of sipC gene. PCR amplification programs
were carried out in a total volumes of 25 mL in 0.2 mL tubes
containing 1 mL of template DNA, 1 mmol/L of each primer,
2.5 mmol/L of 10× PCR buffer, 2 mmol/L MgCl2, 200 mmol/
L deoxy-ribonucleoside triphosphate and 1 unit of Taq DNA
polymerase (Fermentas, Germany). For the optimal amplification
of flanking regions of sipC gene and kan gene, an
initial denaturation step was performed at 95 C for 5 min,
then amplified for 32 cycles of denaturation at 94 C for
1 min, annealing at 62 C for 1 min and extension at 72 C
for 1 min. Lastly, a final extension phase was programmed
for 5 min at 72 C and amplified samples were held at
10 C.


2.4. Analysis of PCR products
The amplified products (10 mL) were analysed by electrophoresis
in 1% agarose gel in tetrabromoethane [tris-base
10.8 g 89 mmol/L, boric acid 5.5 g 2 mmol/L, ethylene
diamine tetraacetic acid 4 mL of 0.5 mol/L ethylene diamine
tetraacetic acid (pH 8.0) buffer]. Constant voltage of 80 V was
used for products differentiation. The 100 bp DNA ladder
(Fermentas, Germany) was used as a molecular weight marker.
After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide
and images were taken in UVIdoc gel documentation
systems (UK).

2.5. Cloning of sipC gene and plasmid construction
The PCR products were purified using gel extraction kit
(Bioneer, Korea) according to manufacture's protocol. All PCR
products were cloned into pGEM T-easy vector and the recombinant
vectors were transformed by heat shock at 42 C and
calcium chloride method into E. coli TOP10F0 competent cells
in LB culture media (Merck, Germany). Kanamycin resistance
was used for the selection. The presence of flanking regions of
sipC gene and kan gene was confirmed by restriction endonucleases
analysis.

2.6. Subcloning of the sipC and kan genes
The up-sipC fragment was removed from the pGEM Teasy
vector by Xba I-Bgl II double digestion and subcloned in
Xba I-Bgl II linearized pET-32 to get pET-32-sipC up. Then,
kan fragment was released from the pGEM T-easy vector by

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำสายเป็นสมาชิกของครอบครัว Enterobacteriaceae การกลุ่มใหญ่ไม่ใช่สปอร์รูป แบคทีเรียแกรมลบ bacilli และfacultative anaerobes [1] สาย enterica (S. enterica)ทำให้เกือบ 99% ของการติดเชื้อซัลในสัตว์ และมนุษย์ [2] S. enterica มีประมาณ 2600 มีความหลากหลายserotypes ซึ่งประกอบด้วยสองชนิด ซัล bongoriและ S. enterica และจะแบ่งออกเป็นชนิดย่อยที่ 6: salamaeenterica, diarizonae, arizonae, indica และ houtenae [1]S. enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) เป็นแพร่หลายแจกจ่ายอาหารโดยเชื่อว่าการศึกษาหนึ่งนิยมมากที่สุดสาเหตุของโรคเชื่อว่าอาหารแบคทีเรียในมนุษย์และสัตว์และเสียชีวิตทั่วโลก [3, 4] Salmonellosis ถือเป็นหนึ่งในที่สำคัญเชื่อว่าอาหาร zoonoses ที่ดูในสองประเภทโรคต่าง ๆ enteric ไข้ซึ่งอาจเป็นรากสาด หรือparatyphoid และโรคกระเพาะอักเสบที่ไม่ใช่ typhoidal [5,6]การศึกษาแบคทีเรียในมนุษย์ทำให้ 21 ล้านไข้รากสาดน้อยและเสียชีวิต 200000 ต่อปี ส่วนใหญ่ในภาคใต้เอเชีย แอฟริกา และอเมริกาใต้ [7] การค้นพบของใหม่วัคซีนสำหรับ salmonellosis เป็นความท้าทายสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่รู้หลายมีระดับการทดสอบทางคลินิก จำเป็นต้องมีบ็อชวัคซีนต่อต้าน salmonellosis ให้แข็งแกร่งhumoral เป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันยังคงยังคงอยู่ [8]S. enterica serovars ได้ถูกจัดประเภทตามการเกิดปฏิกิริยาของตรวจหาการ somatic lipopolysaccharide, flagellar และ capsularantigens จากลักษณะทางคลินิก เหล่านี้อาจได้อย่างกว้างขวางจัดกลุ่มตามโฮสต์แสดงช่วงและโรค[9] ระดับ pathogenicity เกาะ (SPIs) 1 และ 2ดีเทอร์มิแนนต์ virulence สำคัญสองของ S. enterica พวกเขาเข้ารหัสชนิด III หลั่งระบบ (T3SS), ซึ่งดำเนินการโปรตีน effector และเปิดใช้งานการฉีดโปรตีน effectorเข้าไปในไซโตซอล eukaryotic เซลล์ เบสเหล่านี้สุดท้าย จัดการฟังก์ชันโทรศัพท์มือถือของโฮสต์ติดเชื้อและความสะดวกสบายของการติดเชื้อ [10] ในปัจจุบัน21 SPIs ได้รับในระดับ จำนวนมากยีนที่เข้ารหัส SPI ระบุมีเฉพาะ putative ฟังก์ชันมีบทบาทไม่ชัดเจนในสายพยาธิกำเนิดโลกัสโพล SPI 1 เป็น 40 kb ของโครโมโซมเกาะ ซึ่งดำเนินอื่น ๆ ระหว่าง ยีนที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ของการT3SS ทำงาน จำนวน effector บาง และกำกับดูแลโปรตีนและ chaperones ของพวกเขา [1] T3SS ช่วยให้ที่ secretedโปรตีนผ่านแบคทีเรียภายนอก และภายในสารและ translocon การสร้างความรูในเยื่อหุ้มเซลล์ของโฮสต์ [11]ตำแหน่งและหน้าที่ของโปรตีนเหล่านี้ในระบบนี้แสดงด้านล่างนี้ ภายในเมมเบรนโปรตีน: InvA, SpaP, Q, R, Sเชื่อมโยงภายในเมมเบรนโปรตีน: InvA, E เยื่อหุ้มภายนอกโปรตีน: InvG, PrgK, PrgH chaperone: SicA putativechaperone: InvI secreted เกี่ยวข้องกับการหลั่งโปรตีน: InvJSpaO โปรตีน secreted พร้อมฟังก์ชั่น effector (เป้าหมายโปรตีน): SipA, SipB สายบุกรุกโปรตีนซี (SipC),SipD, SptP [12]การรุกรานเริ่มต้น โดยการศึกษารวมไปถึงเซลล์โฮสต์พื้นผิว [13] หลังจากการบุกรุกและป้อน lumen ของขนาดเล็กลำไส้ T3SS-1 ยีนจะช่วยให้สภาพแวดล้อมแสดง และต่อมาระบบหลั่งเพื่อจะรวบรวมที่เยื่อหุ้มตัวแบคทีเรีย [14] ป้อนข้อมูลในเซลล์จะถูกกำหนดโดยrearrangements ของ cytoskeleton แอกติน ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งinterceded โดย SipC ส่วนประกอบของ translocon แบคทีเรีย ที่เซลล์แบคทีเรีย – โฮสต์ติดต่อ [1] SipC มีสองพื้นที่ที่เมมเบรนซึ่งประกอบไป ด้วย C - และ N-เทอร์มินัลโดเมนหน้าของไซโทพลาซึมเซลล์โฮสต์ แอสเซมบลีนี้ topological ของนี้โปรตีน effector เป็นเหตุผล nucleation แอกตินและการสับเปลี่ยนที่กระบวนการทาง อย่างยิ่ง ทั้งในกระบวนการเหล่านี้เป็นหลักขึ้นอยู่กับ C-นัสของ SipC SipC สามารถแปลแอกติน polymerization ที่แนบแบคทีเรียไซต์ และจ้างแอกตินโดยตรง [15] กานามัยซินถูกยกเลิก ด้วยการ aminophosphotransferasesโดยโอนย้ายฟอสเฟต g ไป OHกลุ่มใน pseudosaccharide ที่ตำแหน่ง 30 ยีนกันโคลน และแปลง Escherichia coli (E. coli) เซลล์ [16]วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือการ สร้าง plasmid ที่ดำเนินการแทนยีนต้านทานกานามัยซิน S. typhimuriumเจ้า sipC ยีน มีส่วนขึ้น-กาฬลง ใช้ homologousrecombination เทคนิค2. วัสดุและวิธีการ2.1. แบคทีเรียซับซ้อน plasmids ก่อสร้าง และสื่อในการศึกษานี้ แบบโพรโทคอลและแจ้งความยินยอมได้ได้รับอนุมัติจากมหาวิทยาลัย Azad อิสลาม Shahrekord สาขาShahrekord อิหร่านมีเงินช่วยเหลือ 17621105 Virulent S.Typhimurium (ATCC-13311) รวบรวมจากจุลชีววิทยาห้องปฏิบัติการมหาวิทยาลัยอิสลามออนไลน์ของ Shahrekord สาขาถูกเก็บรักษาไว้ เป็นกลีเซอรแช่แข็งหุ้น และอ่างเป็น Luria-ซุป Bertani (ปอนด์) จนถึงขั้นตอนการเจริญเติบโตบันทึก (แสงความหนาแน่น600 = 0.9) ถึง ยีนกาฬถูกแยกต่างหากจากการสัตว์เลี้ยง-28 เวกเตอร์ สำหรับการโคลน อนุรักษ์ของดีเอ็นเอแยกส่วน และsubcloning, pGEM เวกเตอร์ T ง่ายใช้ TA โคลนชุด (Promegaอเมริกา) และเวกเตอร์ pET-32 ด้วยต้องใช้ E. coli ถูก TOP10F0ใช้ ตามลำดับ วัฒนธรรมจากแบคทีเรียได้เติบโตที่ 37 C ปอนด์ซุปและแผ่น agar ปอนด์2.2 การสกัดของ genomic DNA จาก S. typhimuriumดีเอ็นเอถูกแยกจากอาณานิคมของแบคทีเรียโดยใช้ดีเอ็นเอชุดสกัด (DNP ™ชุด CinnaGen อิหร่าน) ตามโพรโทคอลของผู้ผลิต มีการตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอบน 1%agarose เจ electrophoresis และ quantified โดย spectrophotometricmensuration ที่ 260 nm ตาม Sambrook และรัสเซลล์ [17]2.3 การขยายของ flanking แคว้น sipC ยีน และยีนกันไพรเมอร์ oligonucleotide ถูกออกแบบสำหรับขยายของflanking แคว้น sipC ยีนของ S. typhimurium ลำดับที่ไพรเมอร์เหล่านี้มีค่า sipC F: 50-ATGTCTAGACCCTAAATAAAGTGGCG-30 และค่า-sipC-R: 50 ATTAGATCTCTCCCTTTATTTGGCAG 30 (เลขทะเบียน:CP008928.1) Xba ที่มีฉันและไซต์จำกัด Bgl II และลง-sipC-F: 50-ATTGAGCTCTGACCACTGAAAGCCAC-30และลง sipC R: 50-ACACTCGAGTAATACCCAGACTTTCCG 30 (เลขทะเบียน: CP007360.1) ประกอบด้วย Sac ฉัน และXho ฉันไซต์จำกัด ใช้ไพรเมอร์สำหรับการขยายของค่าและ ลงของยีน sipC ตามลำดับ นอกจากนี้ กาญจน์-F:50-ATAAGATCTATGAGCCATATTCAGCGTG-30 และกาฬ-R: ไพรเมอร์ 50-ATAGAGCTCTTAGAAAAATTCATCCAG-30ประกอบด้วย Bgl II และ Sac ฉันจำกัดเว็บไซต์ถูกออกแบบสำหรับขยายของเวกเตอร์ยีนและสัตว์เลี้ยง-28 กันถูกใช้เป็นแม่แบบขีดเส้นใต้ลำดับระบุไซต์จำกัดดำเนินโปรแกรม PCR สามชุดเดี่ยวในปริมาณสูงสำหรับขยายยีนกาฬ และค่า และลงพื้นที่ของยีน sipC โปรแกรมขยาย PCRได้ดำเนินการไดรฟ์ข้อมูลทั้งหมดของ 25 mL ในหลอด 0.2 mLประกอบด้วย 1 mL ของดีเอ็นเอต้นแบบ 1 mmol/L แต่ละพื้น2.5 mmol/L ของบัฟเฟอร์ PCR × 10, 2 mmol/L MgCl2, 200 mmol /L deoxy ribonucleoside โนซีนไตรฟอสเฟตและ Taq DNA 1 หน่วยพอลิเมอเรส (Fermentas เยอรมนี) สำหรับขยายดีที่สุดของ flanking ภูมิภาค sipC ยีนและยีนกาฬ การขั้นตอน denaturation เริ่มทำที่ C 95 ใน 5 นาทีแล้ว ขยายสำหรับวงจร 32 การ denaturation ที่ 94 C สำหรับ1 นาที การอบเหนียวที่ 62 C 1 นาทีและส่วนขยายที่ 72 Cใน 1 นาที สุดท้าย ระยะสุดท้ายส่วนขยายโปรแกรมใน 5 นาทีที่ 72 C และตัวอย่างเอาต์ได้จัดขึ้นที่ค. 102.4 การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCRผลิตภัณฑ์เอาต์ (10 mL) ถูก analysed โดย electrophoresisใน 1% agarose เจลใน tetrabromoethane [ฐานทริสเรทติ้งเอทิลีน กรด boric 5.5 g 2 mmol/L, 10.8 g 89 mmol/Lกรด tetraacetic diamine 4 mL ของ 0.5 โมล/L เอทิลีน diaminetetraacetic กรด (pH 8.0) บัฟเฟอร์] ถูกแรงคงที่ 80 Vใช้สำหรับการสร้างความแตกต่างของผลิตภัณฑ์ บันได 100 bp ดีเอ็นเอ(Fermentas เยอรมนี) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายของน้ำหนักโมเลกุลหลังจาก electrophoresis เจมีสีกับโบรไมด์ ethidiumและภาพที่ถ่ายในเอกสารเจ UVIdocระบบ (UK)2.5 การโคลนของ sipC ยีนและ plasmidผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์ใช้ชุดแยกเจ(Bioneer เกาหลี) ตาม protocol ของการผลิต PCR ทั้งหมดผลิตภัณฑ์ถูกโคลนเป็นเวกเตอร์ T ง่าย pGEM และวททชเวกเตอร์ถูกแปลง โดยไล่ความร้อนที่ 42 C และวิธีแคลเซียมคลอไรด์ลงในเซลล์มีอำนาจ TOP10F0 E. coliป.วัฒนธรรมสื่อ (เมอร์ค เยอรมนี) ต้านทานกานามัยซินใช้สำหรับการเลือก ของแคว้น flankingsipC ยีนยีนและกาฬได้รับการยืนยัน โดย endonucleases จำกัดวิเคราะห์2.6 การ subcloning ของยีน sipC และกาฬส่วน sipC ขึ้นถูกเอาออกจาก pGEM Teasyเวกเตอร์จาก Xba II-Bgl คู่ย่อยอาหาร และ subcloned ในII-Bgl Xba เป็นเส้นตรง pET-32 จะได้รับ pET-32-sipC ค่า แล้วส่วนกาญออกจากเวกเตอร์ T กลาย pGEM โดย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1. บทนำSalmonella เป็นสมาชิกของครอบครัว Enterobacteriaceae เป็นกลุ่มใหญ่ของแกรมลบที่ไม่สร้างสปอร์แบคทีเรียและanaerobes ตามอำเภอใจ [1] เชื้อ Salmonella enterica (เอส enterica) ทำให้เกิดเกือบ 99% ของการติดเชื้อ Salmonella ในสัตว์และมนุษย์[2] enterica เอสมีประมาณ 2,600 หลากหลายสายพันธุ์ซึ่งประกอบด้วยสองชนิดbongori Salmonella และ S. enterica และมีการแบ่งออกเป็นหกชนิดย่อย: salamae, enterica, diarizonae, arizonae indica และ houtenae [1]. เอส enterica serovar typhimurium (typhimurium เอส) เป็นกันอย่างแพร่หลายเชื้อโรคกระจายที่เกิดจากอาหารและเป็นหนึ่งในความนิยมมากที่สุดสาเหตุของการเกิดโรคที่เกิดจากอาหารของแบคทีเรียในคนและสัตว์และเสียชีวิตทั่วโลก[3,4] Salmonellosis ถือเป็นหนึ่งของzoonoses ที่เกิดจากอาหารที่สำคัญที่สุดที่จะถูกมองในสองชนิดของโรคที่แตกต่างกันมีไข้ลำไส้ซึ่งสามารถไทฟอยด์หรือไข้รากสาดเทียมและกระเพาะอาหารและลำไส้ซึ่งเป็นที่ไม่typhoidal [5,6]. การติดเชื้อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดในมนุษย์ 21 ล้าน กรณีของไข้ไทฟอยด์และ200,000 รายต่อปีส่วนใหญ่อยู่ในภาคใต้ของเอเชียแอฟริกาและอเมริกาใต้[7] การค้นพบของใหม่วัคซีนสำหรับเชื้อ Salmonella เป็นความท้าทายสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่. วัคซีนหลายคนได้ผ่านการทดสอบทางคลินิก ความต้องการของวัคซีนมีประสิทธิภาพต่อเชื้อ Salmonella ให้แข็งแกร่งของร่างกายเช่นเดียวกับการสร้างภูมิคุ้มกันโทรศัพท์มือถือยังคงอยู่[8]. เอส enterica serovars ได้รับการจำแนกอยู่บนพื้นฐานของการเกิดปฏิกิริยาของสารที่จะlipopolysaccharide ร่างกาย, flagellar และ capsular แอนติเจน จากลักษณะทางคลินิกเหล่านี้อาจจะกว้างจัดกลุ่มบนพื้นฐานของช่วงโฮสต์และการเป็นตัวแทนของโรค[9] เกาะเชื้อ Salmonella (Spis) ที่ 1 และ 2 มีสองปัจจัยความรุนแรงที่สำคัญของเอสenterica พวกเขาเข้ารหัสประเภทที่สามระบบการหลั่ง (T3SS) ซึ่งดำเนินการ effector โปรตีนและเปิดใช้งานการฉีดของโปรตีน effector โดยตรงในเซลล์ของเซลล์ eukaryotic เอฟเฟคเหล่านี้ในที่สุดก็จัดการกับฟังก์ชั่นโทรศัพท์มือถือของโฮสต์ที่ติดเชื้อและความสะดวกสบายของการพัฒนาของการติดเชื้อ[10] ในปัจจุบัน21 Spis ได้รับการยอมรับใน Salmonella หลายคนระบุยีน SPI เข้ารหัสมีฟังก์ชั่นสมมุติเท่านั้นไม่มีบทบาทที่ชัดเจนในการเกิดโรคSalmonella. SPI-1 สถานที่คือ 40 กิโลเกาะโครโมโซมซึ่งเป็นพาหนะในทุกยีนอื่นๆ ที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ของT3SS การทำงานเป็นจำนวนมาก ของ effector บางและกฎระเบียบโปรตีนและครูใหญ่ของพวกเขา[1] T3SS ช่วยให้หลั่งโปรตีนผ่านเยื่อหุ้มด้านนอกและด้านแบคทีเรียและtranslocon สร้างรูขุมขนในเยื่อหุ้มเซลล์โฮสต์ [11]. ที่ตั้งและการทำงานของโปรตีนเหล่านี้ในระบบนี้มีการแสดงด้านล่าง โปรตีนภายใน: InvA, SPAP, Q, R, S; โปรตีนภายในที่เกี่ยวข้อง: InvA อี; เยื่อหุ้มชั้นนอกโปรตีน: InvG, PrgK, PrgH; chaperone: SICA; สมมุติพี่เลี้ยง: InvI; โปรตีนที่หลั่งมามีส่วนร่วมในการหลั่ง: InvJ, SPAO; หลั่งโปรตีนที่มีฟังก์ชั่น effector (ที่เป้าหมายโปรตีน): SIPA, SIPB บุก Salmonella โปรตีน C (SIPC). SipD, SptP [12] บุกจะเริ่มโดยเชื้อโรคผูกพันกับเซลล์โฮสต์พื้นผิว [13] หลังการรุกรานและเข้าสู่เซลล์ขนาดเล็กที่ลำไส้ช่วยให้สภาพแวดล้อมยีน T3SS-1 ที่จะแสดงและต่อมาระบบการหลั่งที่จะรวมตัวกันที่เมมเบรนของแบคทีเรีย[14] รายการของเซลล์จะถูกกำหนดโดยrearrangements ของโครงร่างของเซลล์โปรตีนซึ่งเป็นส่วนหนึ่งค้านโดยSIPC เป็นส่วนประกอบของ translocon แบคทีเรียที่สถานที่ของการติดต่อเชื้อแบคทีเรียที่เป็นเจ้าภาพเซลล์[1] SIPC มีสองพื้นที่ซึ่งประกอบไปด้วยเมมเบรนที่มีC- และ n- ขั้วโดเมนด้านหน้าของพลาสซึมของเซลล์โฮสต์ นี้ประกอบทอพอโลยีนี้โปรตีน effector คือเหตุผลกับนิวเคลียสโปรตีนและโยกย้ายเป็นกระบวนการ อย่างน่าทึ่งทั้งของกระบวนการเหล่านี้ส่วนใหญ่จะมีขึ้นอยู่กับ C-ปลายทางของ SIPC SIPC สามารถ จำกัด วงพอลิเมอโปรตีนที่เว็บไซต์ของสิ่งที่แนบมาของเชื้อแบคทีเรียและใช้โปรตีนโดยตรง[15] กานามัยซินจะใช้งานกับ aminophosphotransferases โดยการโอนกรัมฟอสเฟตกับ OH กลุ่มใน 30 ตำแหน่งของ pseudosaccharide ยีนกาฬถูกโคลนและเปลี่ยนในเชื้อ Escherichia coli (E. coli) เซลล์ [16]. วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้เพื่อสร้างพลาสมิดที่ดำเนินกานามัยซินแทนยีนต้านทานของ typhimurium S. ยีน SIPC พื้นเมืองที่มีส่วน Up-กาญจน์ลง โดยใช้คล้ายคลึงกันเทคนิคการรวมตัวกันอีก. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 ที่ซับซ้อนแบคทีเรีย, พลาสมิดก่อสร้างและสื่อในการศึกษานี้โปรโตคอลและรูปแบบความยินยอมที่ได้รับการอนุมัติจากอิสลามAzad มหาวิทยาลัย Shahrekord สาขาShahrekord อิหร่านกับ 17621105 จำนวนทุน รุนแรง S. Typhimurium (ATCC-13311) เก็บรวบรวมจากวิทยาทางห้องปฏิบัติการของอิสลามAzad มหาวิทยาลัย Shahrekord สาขาได้รับการเก็บรักษาไว้เป็นหุ้นกลีเซอรอลแช่แข็งและการเพาะเลี้ยงเข้าLuria- Bertani (LB) น้ำซุปจนระยะการเจริญเติบโตเข้าสู่ระบบ (ความหนาแน่นออปติคอล600 = 0.9) ก็มาถึง . ยีนกาฬที่แยกได้จากสัตว์เลี้ยง 28 เวกเตอร์ สำหรับการโคลน, การเก็บรักษาของชิ้นดีเอ็นเอและsubcloning, เวกเตอร์ pGEM T-ง่ายโดยใช้ชุดการโคลน TA (Promega, สหรัฐ) และสำหรับผู้รักสัตว์ 32 เวกเตอร์ที่มีอีโคไลสายพันธุ์ TOP10F0 ถูกนำมาใช้ตามลำดับ วัฒนธรรมแบคทีเรียเติบโตที่ 37 องศาเซลเซียสใน LB น้ำซุปและจานอาหารเลี้ยงเชื้อ LB. 2.2 การสกัดดีเอ็นเอจาก typhimurium S. ดีเอ็นเอที่แยกได้จากโคโลนีของเชื้อแบคทีเรียโดยใช้ดีเอ็นเอชุดสกัด (DNP ™ชุด CinnaGen อิหร่าน) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต คุณภาพของดีเอ็นเอที่ได้รับการตรวจสอบเมื่อวันที่ 1% ข่าวคราว agarose และวัดโดยสเปกการวัดที่260 นาโนเมตรตาม Sambrook และรัสเซล [17]. 2.3 การขยายของภูมิภาคขนาบยีน SIPC และยีนกาฬไพรเมอร์Oligonucleotide ได้รับการออกแบบสำหรับการขยายของภูมิภาคขนาบยีนSIPC ของ typhimurium เอส ลำดับของไพรเมอร์เหล่านี้ขึ้น SIPC-F: 50 ATGTCTAGA CCCTAAATAAAGTGGCG-30 และขึ้น SIPC-R: 50 ATTAG ATCTCTCCCTTTATTTGGCAG-30 (หมายเลขภาคยานุวัติ: CP008928.1) ที่มี XBA I และ II BGL เว็บไซต์และข้อ จำกัดลง SIPC -F: 50 ATTGAGCTCTGACCACTGAAAGCCAC-30 และลง SIPC-R: 50 ACACTCGAGTAATACCCAGACTT TCCG-30 (หมายเลขภาคยานุวัติ: CP007360.1) ที่มี Sac ฉันและXho ฉันไซต์ข้อ จำกัด ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยายของขึ้นและลงพื้นที่ของยีน SIPC ตามลำดับ นอกจากนี้ kan-F: 50 ATAAGATCTATGAGCCATATTCAGCGTG-30 และ kan- R: 50 ATAGAGCTCTTAGAAAAATTCATCCAG-30 ไพรเมอร์ที่มีBGL ครั้งที่สองและฉัน Sac เว็บไซต์ข้อ จำกัด ได้รับการออกแบบสำหรับการขยายของยีนกาฬและสัตว์เลี้ยง28 เวกเตอร์ที่ใช้เป็นแม่แบบ. ลำดับแสดงให้เห็นขีดเส้นใต้ เว็บไซต์ข้อ จำกัด . สามคอลเลกชันของโปรแกรม PCR ได้ดำเนินการโดยลำพังในปริมาณสูงสำหรับการขยายของยีนกาฬขึ้นไปและลงภูมิภาคของยีนSIPC PCR โปรแกรมขยายได้ดำเนินการในปริมาณรวมทั้งสิ้น25 มิลลิลิตรใน 0.2 หลอดมิลลิลิตรมี1 มิลลิลิตรของดีเอ็นเอแม่แบบ 1 มิลลิโมล / ลิตรของแต่ละไพรเมอร์, 2.5 มิลลิโมล / ลิตร 10 ×บัฟเฟอร์ PCR 2 มิลลิโมล / ลิตร MgCl2 200 มิลลิโมล / L-Deoxy ribonucleoside triphosphate และ 1 หน่วยดีเอ็นเอ Taq โพลิเมอร์ (Fermentas, เยอรมนี) สำหรับการขยายที่ดีที่สุดของขนาบภูมิภาคของยีน SIPC และยีนกาฬเป็นขั้นตอนdenaturation เริ่มต้นเป็นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, ขยายแล้วสำหรับ 32 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94? C เป็นเวลา1 นาที, การอบที่ 62 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 และการขยายนาทีที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา1 นาที สุดท้ายขั้นตอนสุดท้ายคือการขยายโปรแกรมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสและตัวอย่างขยายถูกจัดขึ้นที่ 10 องศาเซลเซียส. 2.4 การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR ผลิตภัณฑ์ขยาย (10 มิลลิลิตร) ถูกนำมาวิเคราะห์โดยอิเลในเจลagarose 1% ใน Tetrabromoethane [tris ฐาน10.8 กรัม 89 มิลลิโมล / ลิตร, กรดบอริก 5.5 กรัม 2 มิลลิโมล / ลิตร, เอทิลีนdiamine tetraacetic กรด 4 มิลลิลิตร 0.5 โมล / ลิตร diamine เอทิลีนกรดtetraacetic (pH 8.0) บัฟเฟอร์] แรงดันคงที่ 80 V ถูกใช้สำหรับความแตกต่างของผลิตภัณฑ์ บันไดดีเอ็นเอ bp 100 (Fermentas, เยอรมนี) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุล. หลังจากที่อิเลคเจลที่ถูกย้อมด้วย ethidium bromide และภาพที่ถูกถ่ายใน UVIdoc เจลเอกสารระบบ(สหราชอาณาจักร). 2.5 การโคลนยีน SIPC ก่อสร้างพลาสมิดผลิตภัณฑ์PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดการสกัดเจล(Bioneer เกาหลี) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ทั้งหมด PCR ผลิตภัณฑ์ถูกโคลนเข้า pGEM T-ง่ายเวกเตอร์และ recombinant เวกเตอร์ถูกเปลี่ยนโดยช็อตความร้อนที่ 42 องศาเซลเซียสและวิธีแคลเซียมคลอไรด์ลงในเชื้อE. coli TOP10F0 เซลล์ที่มีความสามารถในการเลี้ยงเชื้อLB (เมอร์ค, เยอรมนี) ต้านทานกานามัยซินที่ใช้สำหรับการเลือก การปรากฏตัวของขนาบภูมิภาคของยีน SIPC และยีนกาญจน์ได้รับการยืนยันโดยข้อ จำกัด endonucleases วิเคราะห์. 2.6 Subcloning ของ SIPC และยีนกาฬชิ้นขึ้นSIPC ถูกลบออกจาก pGEM Teasy เวกเตอร์โดย XBA I-II BGL ย่อยอาหารคู่และ subcloned ในXBA I-II BGL เชิงเส้นสำหรับผู้รักสัตว์ 32 ที่จะได้รับสำหรับผู้รักสัตว์ 32 SIPC ขึ้น จากนั้นส่วนกาญจน์ได้รับการปล่อยตัวจาก pGEM เวกเตอร์ T-โดยง่าย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . บทนำ

เชื้อซัลโมเนลลาที่เป็นสมาชิกของครอบครัว
ผิดเพี้ยน , กลุ่มใหญ่ของแบคทีเรียแกรมลบที่ไม่สร้างสปอร์ และเชื้อแอนแอโรบส์
อย [ 1 ] ซัลโมเนลลา enterica ( S . enterica )
สาเหตุเกือบ 99% ของเชื้อซัลโมเนลลาในสัตว์และมนุษย์
[ 2 ] การ enterica s . รวมถึงประมาณ 2600 ( หลากหลาย
ซึ่งประกอบด้วยสองสายพันธุ์ Salmonella bongori
และ senterica และจะแบ่งออกเป็นหกชนิดย่อย : salamae
enterica diarizonae arizonae , , , , และจาก houtenae [ 1 ] .
S . typhimurium enterica ซีโรวาร์ ( S . typhimurium ) เป็นพาหะเชื้อโรคกระจายอย่างกว้างขวาง
อาหารและเป็นหนึ่งในสาเหตุที่เป็นที่นิยมมากที่สุดของอาหารแบคทีเรีย borne โรค

ในมนุษย์และสัตว์ตายทั่วโลก [ 3 , 4 และ ] ซาลโมเนลโลซีสถือเป็นหนึ่งของ
อาหารสำคัญที่ผู้รับผิดชอบแดดดี้ แยงกี้ที่ดูในสองชนิด
ของโรคแตกต่างกัน โรคไข้รากสาดน้อยไทฟอยด์ พาราไทฟอยด์ ซึ่ง สามารถ หรือโรคกระเพาะ
และซึ่งไม่ typhoidal [ 5 , 6 ] .
แบคทีเรียเชื้อโรคในมนุษย์สาเหตุ 21 ล้านรายของ
ไข้ไทฟอยด์และ 200000 คนต่อปี ส่วนใหญ่อยู่ในภาคใต้
เอเชีย แอฟริกา และอเมริกาใต้ [ 7 ] การค้นพบใหม่
วัคซีนสำหรับซาลโมเนลโลซีสคือความท้าทายสำหรับนักวิทยาศาสตร์
วัคซีนหลายได้รับการทดสอบทางคลินิก ความต้องการของประสิทธิภาพวัคซีนต่อต้านซัลโมเนลล่าให้แข็งแรง

humoral ตลอดจนภูมิคุ้มกันชนิดเซลล์ยังคงอยู่ [ 8 ] .
. enterica โนได้ถูกแบ่งตามปฏิกิริยาของแอนติเจนกับโซมาติกสีดำเข้ม

flagellar ชีวสมมูลย์ , และแอนติเจนจากลักษณะทางคลินิกเหล่านี้อาจเป็นวงกว้าง
จัดกลุ่มบนพื้นฐานของพืชอาศัยและโรคแทน
[ 9 ] การฉีดเชื้อเกาะ ( spis ) 1 และ 2
2 S . enterica ปัจจัยสําคัญของโรค . พวกเขา
เข้ารหัสประเภทที่ 3 ระบบ ( การ t3ss ) ซึ่งพก
( โปรตีนและช่วยให้การฉีดโปรตีน (
โดยตรงในไซโตซอลของยูคาริโอติกเซลล์อีกครั้งหนึ่งเหล่านี้
ในที่สุดจัดการหน้าที่ของเซลล์ของโฮสต์ที่ติดเชื้อและความสะดวกสบาย
การพัฒนาการติดเชื้อ [ 10 ] ปัจจุบัน
21 spis ได้รับการยอมรับในเชื้อแบคทีเรีย . หลายของยีนมีเพียงที่ระบุ SPI

ไม่มีฟังก์ชั่นการแสดงออกชัดเจนบทบาทในการตรวจหาเชื้อ Salmonella .

spi-1 ตนเป็น 40 KB ของเกาะซึ่งประกอบ
ท่ามกลางคนอื่น ๆที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์เป็น
t3ss หน้าที่ , หมายเลขของโต้ง และโปรตีนและผู้ดูแลกฎระเบียบ
[ 1 ] การ t3ss ช่วยให้หลั่ง
โปรตีนผ่านทางเยื่อหุ้มชั้นนอกและชั้นใน
และ translocon สร้างรูขุมขนในเยื่อเซลล์โฮสต์ [ 11 ] .
สถานที่และการทำงานของโปรตีนเหล่านี้ในระบบนี้คือ
ที่แสดงด้านล่างเมมเบรนโปรตีนภายใน : inva spap , Q , R , S ;
เมมเบรนโปรตีนภายในที่เกี่ยวข้อง : inva , e ;
: invg โปรตีนเยื่อหุ้มชั้นนอก prgk prgh ; , , พี่เลี้ยง : สิก้า ; นอกจากนี้
พี่เลี้ยง : หัวข้อย่อย ; หลั่งโปรตีนที่เกี่ยวข้องในการหลั่ง : invj
, spao ; หลั่งโปรตีนกับโปรตีน ( ( ฟังก์ชัน เป้าหมาย
) : SIPA , sipb Salmonella บุกโปรตีนซี ( SIPC ) sipd
,
sptp [ 12 ]การริเริ่มโดยเชื้อโรคการจับกับเซลล์ผิวหน้า
โฮสต์ [ 13 ] หลังจากการบุกรุกเข้ามาภายในของลำไส้เล็ก
, สภาวะแวดล้อม ช่วยให้ t3ss-1 ยีนจะแสดงออกโดยการหลั่ง

ที่ระบบจะประกอบด้วยแบคทีเรีย [ 14 ] เซลล์รายการจะถูกกำหนดโดย
rearrangements ของ actin ไซโทสเกเลตอนซึ่งเป็นส่วนหนึ่ง interceded โดย SIPC
,ส่วนประกอบของ translocon แบคทีเรียที่
สถานที่ของแบคทีเรียและเซลล์โฮสต์ติดต่อ [ 1 ] ครอบคลุมพื้นที่เยื่อ SIPC รวมถึงสอง
c -
หน้าถูกโดเมนและโฮสต์เซลล์ cytoplasm การชุมนุมนี้รูปแบบนี้
( โปรตีนคือเหตุผลกับ actin nucleation และโยกย้าย
กระบวนการ อย่างน่าทึ่ง ทั้งกระบวนการเหล่านี้เป็นหลัก
ขึ้นอยู่กับ c-terminus ของ SIPC . SIPC สามารถจำกัด
เกิด actin ที่แบคทีเรียแนบเว็บไซต์และจ้าง actin
โดยตรง [ 15 ] นเป็น inactivated กับ aminophosphotransferases
โดยการโอน g-phosphate กับโอ้
กลุ่มใน 30 ตำแหน่งของ pseudosaccharide . ญี่ปุ่นจีน
ถูกโคลนและเปลี่ยนในเชื้อ Escherichia coli ( E . coli ) เซลล์ [ 16 ] .

การวิจัยครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างสายพันธุ์ที่ต้านทานยีน kanamycin
มีการแทนที่ของ S . typhimurium
พื้นเมือง SIPC ยีนกับคันลงเบสโดยใช้เทคนิคการเปรียบเทียบ



2 วัสดุและวิธีการ

2.1 . แบคทีเรียที่สร้างสื่อและพลาสมิด

ในการศึกษานี้ โปรโตคอล และยินยอมให้รูปแบบ
รับรองโดยมหาวิทยาลัยอิสลาม Azad ,shahrekord สาขา
shahrekord อิหร่านกับ 17621105 แกรนท์ เบอร์ S .
ชนิดรุนแรง ( atcc-13311 ) รวบรวมจากห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา มหาวิทยาลัยอิสลาม Azad

ถูกเก็บรักษาไว้เป็น shahrekord สาขาเพาะเลี้ยงเป็นกลีเซอรอลและแช่แข็งหุ้นลุเรีย -
แบร์ตานิ ( LB ) น้ำซุปจนเข้าสู่ระยะการเจริญเติบโต ( ความหนาแน่นของแสง
600 = 0.9 ) ครบ ยีนที่ถูกแยกจากญี่ปุ่น
pet-28 เวกเตอร์สำหรับการรักษาของชิ้นส่วนดีเอ็นเอของยีนและ pgem
, t-easy เวกเตอร์ใช้ทาโคลน Kit ( promega
, อเมริกัน ) และเวกเตอร์ pet-32 กับเชื้ออีโคไลสายพันธุ์ คือ top10f0
ใช้ตามลำดับ วัฒนธรรมแบคทีเรียเติบโตที่ 37  C ในซุปและอาหารจานปอนด์ปอนด์


. . การสกัดดีเอ็นเอจาก S . typhimurium
ดีเอ็นเอที่แยกได้จากโคโลนีของแบคทีเรียใช้ชุดสกัดดีเอ็นเอ
( DNP ™ cinnagen Kit ,อิหร่าน ) ตามพิธีสาร
ของผู้ผลิต คุณภาพของดีเอ็นเอตรวจสอบที่ 1 %
เจลอิเลคโตรโฟรีซีสและ quantified โดย i
การวัดที่ 260 นาโนเมตร ตาม sambrook และ Russell [ 17 ] .

2.3 แบบ flanking ภูมิภาค SIPC ยีนและยีน


คัน ซึ่งถูกออกแบบมาสำหรับไพรเมอร์แบบ
flanking ภูมิภาค SIPC ยีน S . typhimurium .ลำดับของดีเอ็นเอเหล่านี้ up-sipc-f :

และ 50-atgtctaga ccctaaataaagtggcg-30 up-sipc-r : 50 attag
atctctccctttatttggcag-30 ( เลขที่ : ภาคยานุวัติ
cp008928.1 ) ประกอบด้วย xba ฉันและ BGL II และข้อ จำกัด เว็บไซต์ : 50-attgagctctgaccactgaaagccac-30

down-sipc-f และ down-sipc-r : 50-acactcgagtaatacccagactt
tccg-30 ( หนังสือเลขที่ : cp007360.1 ) บรรจุถุงและ
xho ผมจำกัดเว็บไซต์ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับเพิ่มปริมาณขึ้น
และลงเขตของยีน , SIPC ตามลำดับ นอกจากนี้ kan-f :
50-ataagatctatgagccatattcagcgtg-30 และกาญจน์ -
R :
50-atagagctcttagaaaaattcatccag-30 ไพรเมอร์ที่มี BGL II SAC ผมจำกัดเว็บไซต์ที่ถูกออกแบบมาเพื่อเพิ่มจำนวนของยีนคัน
pet-28 เวกเตอร์และใช้เป็นแม่แบบ
ขีดเส้นใต้ลำดับระบุเว็บไซต์ข้อ จำกัด .

สามคอลเลกชันของโปรแกรมสามารถแสดงเดี่ยว
ในระดับเสียงสูงเพื่อเพิ่มปริมาณยีนคันและขึ้น
ลงภูมิภาคของยีน SIPC . เทคนิคขยายโปรแกรม
ทดลองในรวมเล่ม 25 มล. 0.2 มล. ในหลอด
1 มิลลิลิตร ประกอบด้วยดีเอ็นเอแม่แบบ 1 มิลลิโมล / ลิตรของแต่ละไพรเมอร์
2.5 มิลลิโมล / ลิตร 10 บัฟเฟอร์ PCR × 2 mmol / L ชุด 200 mmol /
L ดีอ ซี ribonucleoside ไตรฟอสเฟตและ 1 หน่วย
ดีเอ็นเอ ทัคการ ( fermentas , เยอรมัน ) เพื่อที่ดีที่สุดของภูมิภาค (
จของยีน SIPC และยีนคัน ,
( เริ่มต้นการปฏิบัติในขั้นตอน  95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที
แล้วขยาย 32 รอบ ( ที่ 94  C
1 นาทีที่ 62  อ่อนเป็นเวลา 1 นาทีและส่วนขยายที่ 72  C
1 นาที สุดท้าย ขั้นตอนสุดท้ายคือการขยายโปรแกรม
สำหรับ 5 นาทีที่ 72  C และขยายจำนวนขึ้นที่ 10 C .



 2.4 . การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR
ขยายผลิตภัณฑ์ ( 10 ml ) วิเคราะห์โดยวิธี
1 % เจลใน tetrabromoethane [ บริษัทฐาน
10.8 กรัม 89 mmol / L , กรดบอริก 5.5 กรัม 2 mmol / L ,
4 มล. กรดเอทิลีน Diamine tetraacetic 0.5 mol / L ลีนไดเอมีน
tetraacetic กรด ( pH 8.0 ) บัฟเฟอร์ ] แรงดันคงที่ 80 V คือ
สำหรับการใช้ผลิตภัณฑ์ 100 คู่เบสดีเอ็นเอบันได
( fermentas , เยอรมนี ) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายโมเลกุล .
หลังจากอิเล็กเจลเปื้อน
โบรไมด์คู่และภาพถ่ายในระบบเอกสาร
เจล uvidoc ( UK ) .

2.5 การโคลนยีนและ SIPC พลาสมิดก่อสร้าง
ที่เพิ่มปริมาณเจลสกัดบริสุทธิ์ใช้ Kit ( bioneer
,เกาหลี ) ตามการผลิตเป็นขั้นตอน ผลิตภัณฑ์ PCR
ทั้งหมดถูกโคลนเข้า t-easy pgem เวกเตอร์และเวกเตอร์แนนท์
ถูกเปลี่ยนโดยช็อกความร้อนที่ 42  C
แคลเซียมคลอไรด์วิธีใน E . coli top10f0 เชี่ยวชาญเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB
( Merck , เยอรมัน )
ความต้านทานทั้งสองถูกใช้สำหรับการเลือก การปรากฏตัวของภูมิภาค
จยีนยีนและ SIPC คันยืนยันโดยการวิเคราะห์ Restriction สงบเงียบ
.

2.6 ยีนของยีนและ SIPC คัน
ขึ้น SIPC ชิ้นส่วนจะถูกลบออกจาก pgem teasy
เวกเตอร์โดย xba i-bgl 2 คู่ของการย่อยอาหารใน
xba i-bgl 2 ช่วง pet-32 ได้รับ pet-32-sipc ตั้งขึ้น งั้น
คัน fragment ที่ถูกปล่อยออกมาจาก pgem
t-easy เวกเตอร์โดย