ResultsHaloferax volcanii cells dev

Results
Haloferax volcanii cells develop into structured colony
biofilms and static liquid biofilms
Planktonic H. volcanii DS2 cells grown in shaking culture
(Figure 1A) readily formed biofilms in typical rich media
types Hv-YPC and Hv-Ca within several experimental
systems that provided a solid plastic or glass substratum.
Colony biofilms [7] developed on the surface of
polycarbonate filters placed on solid media (Figure 1B)
and were cryo-processed and cross-sectioned, exposing
a surface structure containing crevices bounded by
globular structures (Figure 1B). The greatest level of
structural complexity was observed when biofilms were
grown in static liquid (SL-biofilms; Figure 1C). Cultivating
SL-biofilms within chamber slides and on the
surface of borosilicate glass coupons placed in six-well
plates permitted direct staining and optimized imaging
of delicate biofilm structure that was visible macroscopically
(Figure 1C).
We began by examining the development of wild-type
H. volcanii DS2 biofilms in static liquid using CLSM and
the cellular membrane dyes FM 1-43 and CellMask Orange(CMO; Figure 1D–I, Additional file 1: Table S1). Circular
microcolonies formed within 48 h (Figure 1D), which led to
well-defined clusters/aggregates after 5 days (Figure 1E).
SL-biofilms reached maturation after 7 days of incubation
at 42°C having developed into multi-layer towers with
flake-like morphology (Figure 1F,G,H). Large towers
were surrounded by a dense layer of smaller clusters
or microcolonies and were separated by areas with little
or no cell density (Figure 1E–H). Overall structural
integrity was maintained as large clusters surrounded by
smaller microcolonies for several weeks, although a comparison
of orthogonal views of CMO-stained SL-biofilms
showed that after 2 weeks the height of most structures
was diminished and less of the total surface area was
covered with microcolonies (Figure 1I, 2 weeks). Large
clusters/towers, like the example shown in Figure 1F,G,H,
varied in height and width, with a maximum measured
height of 148 μm.
Microcolonies within biofilms formed by a GFP-expressing
Haloferax volcanii strain bind stains targeting polysaccharide,
DNA and amyloid protein
Several H. volcanii strains were engineered to express
GFP to study ECM composition with the goal of reinforcing
and expanding staining experiments conducted by Fröls and
coworkers [38]. Confirmation of GFP expression was first
accessed within colonies formed by two GFP-expression
strains produced in this study. Colonies formed by the parental
H. volcanii H1206 strain (Figure 2A; left panel) did not
autofluoresce with blue excitation (Figure 2A, center panel),
while those formed by the H. volcanii H1206(pJAM1020)
strain based on the previously developed plasmid pJAM1020
(see Additional file 1: Table S2) [59] showed uniform and
high levels of GFP fluorescence (Figure 2A; right panel).
An additional GFP-expressing strain H. volcanii H1206
(pSC409GFP), containing the same red-shifted gfp geneproduced colonies with GFP signals that differed in both
intensity and spatial distribution, resulting in an assortment
of patterns of GFP signal within developed colonies
(Additional file 1: Figure S1). The H1206(pJAM1020)
strain was therefore selected for biofilm compositional
studies to ensure stable GFP expression throughout the
cellular population.
Cellular clusters visible in GFP-expressing biofilms
were colocalized with the signal from a Texas Red conjugate
of the lectin concanavalin A (ConA; Figure 2B)
and with the DNA binding dye 4′,6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI; Figure 2C,D,E). ConA is known to
bind a-manopyranosyl and a-glucopyranosyl residues
within glyconjugates of haloarchaeal biofilms [38].
DAPI was selected as an extracellular DNA stain for
our CLSM study because it is known to stain eDNA
preferentially in haloarchaeal biofilms [38]. Fröls and
coworkers [38] used three nucleic acid dyes to distinguish
between extracellular and intracellular DNA
in biofilms formed by H. volcanii and additional
haloarchaeal strains, and showed that: (a) only acridine
orange stained individual live cells, appearing similar
our use of the cell permeable nucleic acid dye SYTO 9
(Additional file 1: Figure S2), (b) the signal from DAPI
appeared nebulous and granular and was colocalized
with microcolonies, (c) simultaneous staining with 7-
hydroxy-9H-1-3-dichloro-9,9-dimenthylacridin-2-one
(DDAO), a nucleic acid dye considered completely impermeable
to cells, led to an essentially identical pattern
of fluorescence signals, and (d) very few non-viable cells
are present within H. volcanii biofilms (even after
30 days of incubation), suggesting that the observed DAPI
signal was not from dead cells. Our CLSM analysis also
showed colocalization of DAPI-stained material with
microcolonies and a lack of signal from individual cells.
Further three-dimensional reconstruction of DAPI-stained
GFP-expressing biofilms revealed that DNA was concentrated
in the basal layer of the biofilm and dispersed
as plume-like structures at the top of larger
towers (Figure 2C,D,E; lower panels).
Larger structures observed in mature biofilms with
transmitted light and through GFP fluorescence were
also colocalized with the signal from Congo red (CR)
and thioflavin T (ThT). These stains are routinely used
as characteristic tests for the presence of a wide variety
of amyloid proteins, including for diagnosis and study
as in pJAM1020 but cloned into the plasmid pTA409,of disease-causing plaques formed by amyloidosis [60–63],
and in many investigations of microbial adhesion and biofilm
formation [27,64–71].
Congo red fluorescence (CRF) was used as it has been
proposed as the most sensitive and reliable method for
amyloid detection when staining with CR [60] and has
been applied to biofilm compositional studies [72]. CRF
was sharply defined and granular in appearance and was
colocalized with the large biofilm cellular clusters and
towers shown in Figure 2F,G,H. Overlays where single
GFP-producing cells are visible and images of CRF at
600× magnification (Additional file 1: Figure S3) indicated
that CR did not stain individual cells. CR-stained
biofilm aggregates were also orange-red under transmitted
light and were visible macroscopically (Figure 2I–L).
Further, green fluorescence signal was detected within
ThT-stained mature biofilms formed by a non-GFP strain
with blue excitation (Figure 2M; no signal detected in control
without ThT staining).
Haloferax volcanii undergoes morphological differentiation
during biofilm growth
The implementation of GFP for biofilm visualization led
to the unexpected observation of increased variability in
length of cellular structures within biofilms compared to
planktonic cells (Figure 3). H. volcanii DS2 cells are
known to be pleomorphic, appearing spherical, disk-like
or as short rods 1 to 3 × 2 to 3 μm in size in liquid culture
[39] (Figures 1A and 3A). However, during examination
of GFP-expressing H. volcanii H1206(pJAM1020) biofilm
cells, we observed large cellular structures composed
of long rods in chains sometimes approaching 30 μm
in length (Figure 3B,C,D). These structures were attached
to the surface and were found within developing
H1206(pJAM1020) biofilms at all observed time points
(Figure 3B,C,D; Additional file 2: Movie 1), in several
independently transformed H1206(pJAM1020) strains,
as well as in biofilms formed by H. volcanii strains that do
not have the GFP expression plasmid (H53 and H98; see
Additional file 1: Figure S2).
Further experimentation verified the relationship between
the chained long rod morphotype and biofilm formation in
the H1206(pJAM1020) strain. A culture of planktonic cells
with an average length of 1.6 μm underwent a morphological
shift during the first 12 h of biofilm formation in
replicate chamber slide wells (Figure 3E). The difference
in length between populations of 2,000 planktonic and
2,000 biofilm cells was statistically significant (P < 0.0001 in
unpaired t test). Cellular structures within biofilms were on
average greater than twice as long, were more variable in
size (with a standard deviation in length of 3.1 μm) and
reached a maximum length ten times greater than that
measured within the planktonic culture from which the
biofilm was derived (Figure 3E).
Haloferax volcanii exhibits social motility following
disruption of static liquid biofilms
An investigation of biofilm dynamics in static liquid began
by disrupting mature 7-day biofilms through mechanical
homogenization followed by time-lapse photography over a
reformation period. To our surprise, this led to the discovery
of rapid cellular re-aggregation and sustained coordinated
social motility (Figure 4; see Additional files 3, 4, 5, 6 and 7:
Movies 2–6). Structured cellular aggregates were visible 3 h
following homogenization, after which cell density was
incrementally concentrated within a central developing
SL-biofilm, with the surrounding medium becoming visibly
transparent after 48 h (Figure 4A). Samples were collected
from the homogenized biofilm at time zero, and from
the central biofilm and surrounding medium at 48 h.
The homogenized biofilm was composed of single
cells and cellular aggregates; after 48 h, the surrounding
medium contained few planktonic cells and the
SL-biofilm contained a high density of cells in large
aggregates. Images collected during reformation at intervals
of 3 h (Figure 4A), 10 min (Figure 4B) and
1 min (see Additional files 3 and 4: Movies 2 and 3)
captured the coordination of large filaments of cells
into dynamic web-like branches. Rippling or wave-like
streaming was observed during extension and retraction
of these structures, particularly evident at low
frame rates (e.g., see Additional file 4: Movie 3).
Social motility was also triggered by physical agitation or
partial disruption of previously undisturbed developing SLbiofilms
(see Additional files 5, 6 and 7: Movies 4, 5 and 6).
Ring-shaped SL-biofilms, whic

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลลัพธ์Haloferax volcanii เซลล์ที่พัฒนาเป็นโครงสร้างอาณานิคมbiofilms และ biofilms คงเหลวเซลล์ volcanii DS2 H. planktonic ปลูกสั่นวัฒนธรรม(รูปที่ 1A) พร้อมรูป biofilms ในสื่อทั่วไปชนิด Hv YPC และ Hv-Ca ภายในต่าง ๆ ทดลองระบบที่มีฐานพลาสติกหรือแก้วแข็งอาณานิคม biofilms [7] พัฒนาบนพื้นผิวของโพลีคาร์บอเนตกรองวางบนสื่อที่เป็นของแข็ง (รูปที่ 1B)และได้ ดำเนินการ cryo และ cross-sectioned เปิดเผยโครงสร้างผิวประกอบด้วย crevices ที่ล้อมรอบด้วยglobular โครงสร้าง (รูปที่ 1B) ระดับมากที่สุดความซับซ้อนของโครงสร้างถูกตรวจสอบเมื่อถูก biofilmsเติบโตขึ้นในของเหลวคงที่ (SL-biofilms รูปที่ 1 C) เพาะปลูกSL-biofilms ภาย ในหอภาพนิ่ง และคงพื้นผิวของแก้ว borosilicate คูปองไว้ในหกดีแผ่นสามารถย้อมสีโดยตรง และปรับภาพให้เหมาะสมโครงสร้าง biofilm อ่อนที่เห็น macroscopically(รูปที่ 1C)เราเริ่ม ด้วยการตรวจสอบการพัฒนาชนิดของป่าH. volcanii biofilms DS2 ในของเหลวคงที่โดยใช้ CLSM และมือถือเมมเบรนสี FM 1-43 และ CellMask Orange(CMO; รูปที่ 1D – ฉัน ไฟล์เพิ่มเติม 1: S1 ตาราง) แบบวงกลมmicrocolonies ที่เกิดขึ้นภายใน h 48 (รูป 1D), ซึ่งนำไปสู่โดยคลัสเตอร์/ผลหลังจาก 5 วัน (รูปที่ 1E)ถึงพ่อแม่หลังจาก 7 วันบ่ม biofilms SLที่ 42° C มีพัฒนาเป็นอาคารหลายชั้นด้วยสัณฐานวิทยาคล้ายเกล็ด (รูป 1F, G, H) อาคารขนาดใหญ่ถูกล้อมรอบ ด้วยชั้นของคลัสเตอร์มีขนาดเล็กหนาแน่นหรือ microcolonies และถูกคั่น ด้วยพื้นที่น้อยด้วยหรือความหนาแน่นไม่เซลล์ (รูปที่ 1E-H) โครงสร้างโดยรวมมีรักษาความเป็นคลัสเตอร์ขนาดใหญ่ที่ล้อมรอบด้วยmicrocolonies เล็กหลายสัปดาห์ แม้ว่าการเปรียบเทียบมุมมอง orthogonal ของ CMO สี SL-biofilmsพบว่าหลังจาก 2 สัปดาห์ความสูงของโครงสร้างส่วนใหญ่ลดลงและน้อยของพื้นที่ผิวทั้งหมดปกคลุม ด้วย microcolonies (1I รูป 2 สัปดาห์) ขนาดใหญ่คลัสเตอร์/อาคาร เช่นตัวอย่างที่แสดงในรูปที่ 1F, G, Hแตกต่างกันในความสูงและความกว้าง มีวัดได้สูงสุดความสูงของ 148 μmMicrocolonies ภายใน biofilms ก่อตั้งขึ้น โดยมี GFP-แสดงHaloferax volcanii ต้องใช้ผูกคราบ polysaccharide การกำหนดเป้าหมายโปรตีนดีเอ็นเอและแอมีลอยด์สายพันธุ์หลาย H. volcanii ได้ออกแบบทางวิศวกรรมด่วนGFP ศึกษา ECM ประกอบกับเป้าหมายของภาคเอกชนและขยายการทดลองย้อมสี โดย Fröls และเพื่อนร่วมงาน [38] ยืนยัน GFP นิพจน์เป็นครั้งแรกเข้าถึงภายในอาณานิคมที่ก่อตั้ง โดยสองนิพจน์ GFPสายพันธุ์ที่ผลิตในการศึกษานี้ เกิดขึ้น โดยที่ผู้ปกครองอาณานิคมไม่มี volcanii H. H1206 ต้องใช้ (รูปที่ 2A แผงด้านซ้าย)autofluoresce กับในการกระตุ้นสีน้ำเงิน (รูปที่ 2A แผงกลาง),ในขณะที่ก่อตั้งขึ้น โดย H. volcanii H1206(pJAM1020)ต้องใช้ตาม pJAM1020 plasmid พัฒนาก่อนหน้านี้(ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 1: S2 ตาราง) [59] แสดงเครื่องแบบ และระดับสูงของ fluorescence GFP (รูปที่ 2A แผงด้านขวา)การเพิ่มเติมกำลัง GFP ต้องใช้ H. volcanii H1206(pSC409GFP), ประกอบด้วยอาณานิคม geneproduced gfp เปลี่ยนสีแดงเดียวกับ GFP สัญญาณที่แตกต่างทั้งในความเข้มและการกระจาย ในการจัดประเภทของรูปแบบของสัญญาณ GFP ภายในพัฒนาอาณานิคม(เพิ่มเติมไฟล์ที่ 1: รูป S1) H1206(pJAM1020)ดังนั้นเลือกต้องใช้สำหรับ compositional biofilmศึกษาให้มั่นคง GFP นิพจน์ตลอดการประชากรโทรศัพท์มือถือเห็นในแสดง GFP biofilms คลัสเตอร์โทรศัพท์มือถือมี colocalized กับสัญญาณจากค่าสังยุคเป็นเท็กซัสแดงของ concanavalin ศึกษา (ConA รูปที่ 2B)ด้วยการรวมดีเอ็นเอย้อม 4′, 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI รูปที่ 2 C, D, E) เป็นที่รู้จัก ConAผูกเป็น manopyranosyl และเป็น glucopyranosyl ตกภายใน glyconjugates ของ haloarchaeal biofilms [38]เลือก DAPI ตามดีเอ็นเอ extracellular ติดสำหรับศึกษาเนื่องจากจะติดเรื่อง CLSM ของเราโน้ตใน biofilms haloarchaeal [38] Fröls และเพื่อนร่วมงาน [38] ใช้สีกรดนิวคลีอิกสามแยกระหว่างดีเอ็นเอ intracellular และ extracellularใน biofilms ก่อตั้งขึ้น โดย H. volcanii และเพิ่มเติมสายพันธุ์ haloarchaeal และชี้ให้เห็นว่า: acridine (a) เท่านั้นแต่ละเซลล์สด ปรากฏคล้ายสีส้มของเราใช้สีย้อมกรดนิวคลีอิก permeable เซลล์ SYTO 9(เพิ่มเติมไฟล์ที่ 1: รูป S2), (b)สัญญาณจาก DAPIปรากฏ nebulous และ granular และถูก colocalizedมี microcolonies, (c) พร้อมย้อมสีและ 7hydroxy-9H-1-3-dichloro-9,9-dimenthylacridin-2-one(DDAO), กรดนิวคลีอิกย้อมถือว่าผ่านทั้งหมดของเซลล์ นำไปสู่รูปแบบเป็นเหมือนfluorescence สัญญาณ และเซลล์ไม่ทำงานได้น้อยมาก (d)อยู่ภายใน H. volcanii biofilms (แม้หลังจาก30 วันของคณะทันตแพทยศาสตร์), แนะนำที่ DAPI พบสัญญาณไม่จากเซลล์ตาย การวิเคราะห์ CLSM ของเรายังพบ colocalization สี DAPI วัสดุด้วยmicrocolonies และไม่มีสัญญาณจากเซลล์แต่ละเซลล์เพิ่มเติมสามมิติฟื้นฟูของสี DAPIแสดง GFP biofilms เปิดเผยว่า ดีเอ็นเอเข้มข้นในชั้นของ biofilm โรค และกระจายเป็นโครงสร้างคล้ายเบิ้ลพลูมที่มีขนาดใหญ่อาคาร (รูปที่ 2C, D, E แผงล่าง)โครงสร้างใหญ่ใน biofilms ผู้ใหญ่ด้วยส่งแสง และ GFP fluorescence ขึ้นcolocalized ยัง มีสัญญาณจากคองโกแดง (CR)และ thioflavin T (ThT) คราบเหล่านี้ใช้เป็นประจำเป็นการทดสอบลักษณะการแสดงที่หลากหลายของแอมีลอยด์โปรตีน รวมถึงการวินิจฉัยและการศึกษาใน pJAM1020 แต่โคลนเป็น pTA409 plasmid ก่อให้เกิดโรค plaques ที่ก่อตั้งขึ้น โดย amyloidosis [60 – 63],และในการตรวจสอบจุลินทรีย์ยึดเกาะและ biofilmผู้แต่ง [27,64-71]คองโกเรด fluorescence (CRF) ถูกใช้เป็นแล้วเป็นส่วนใหญ่มีความสำคัญ และเชื่อถือได้วิธีในการนำเสนอตรวจสอบแอมีลอยด์เมื่อย้อมสี ด้วย CR [60] และมีการนำไปใช้กับ biofilm compositional ศึกษา [72] CRFgranular ในลักษณะที่ปรากฏ และกำหนดอย่างรวดเร็ว และถูกcolocalized กับกลุ่มโทรศัพท์มือถือใหญ่ biofilm และอาคารที่แสดงในรูปที่ 2F, G, H. ซ้อนทับเดียวGFP ผลิตเซลล์มองเห็น และภาพของ CRF ที่600 ×ขยาย (เพิ่มเติมไฟล์ 1: รูป S3) ระบุCR ที่ได้ติดเซลล์แต่ละเซลล์ สี CRbiofilm ผลยังมีสีส้มแดงส่งต่ำกว่าแสง และได้เห็น macroscopically (รูปที่ 2I – L)ตรวจพบสัญญาณเพิ่มเติม เขียว fluorescence ภายในสี ThT ผู้ใหญ่ biofilms เกิดขึ้น โดยต้องใช้มี GFPมีในการกระตุ้นสีน้ำเงิน (รูปที่ 2 M ไม่มีสัญญาณที่ตรวจพบในการควบคุมไม่ ThT ย้อมสี)Haloferax volcanii ทนี้สร้างความแตกต่างของในระหว่างการเจริญเติบโตของ biofilmนำการใช้งานของ GFP biofilm แสดงภาพประกอบเพลงการสังเกตการณ์ที่ไม่คาดคิดความแปรผันเพิ่มขึ้นในความยาวของโครงสร้างโทรศัพท์มือถือภายใน biofilms เมื่อเทียบกับplanktonic เซลล์ (รูปที่ 3) H. volcanii DS2 เซลล์อยู่รู้จักเป็น pleomorphic ปรากฏทรงกลม ดิสก์เช่นหรือก้านสั้น 1 กับ 3 × 2 เพื่อ μm 3 ขนาดในวัฒนธรรมของเหลว[39] (ตัวเลข 1A และ 3A) อย่างไรก็ตาม ในระหว่างการตรวจสอบของ biofilm แสดง GFP H. volcanii H1206(pJAM1020)เซลล์ เราสังเกตโครงสร้างขนาดใหญ่ที่ประกอบด้วยโทรศัพท์มือถือของก้านยาวในบางครั้งกำลัง 30 μm โซ่ความยาว (รูปที่ 3B, C, D) โครงสร้างเหล่านี้ได้แนบพื้นผิว และพบภายในการพัฒนาH1206(pJAM1020) biofilms สังเกตเวลาสถานที่(รูปที่ 3B, C, D แฟ้มเพิ่มเติม 2:1 ภาพยนตร์), ในหลายสายพันธุ์ H1206(pJAM1020) แปรรูปอย่างอิสระเป็นใน biofilms ก่อตั้งขึ้น โดย H. สายพันธุ์ volcanii ที่ทำไม่มี plasmid นิพจน์ GFP (H53 และ H98 ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1: S2 รูป)การทดลองตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างก่อการ morphotype และ biofilm ของเหล็กลูกโซ่ยาวสายพันธุ์ H1206(pJAM1020) วัฒนธรรมของเซลล์ planktonicมีความยาวเฉลี่ยของ 1.6 μm เปลี่ยนเป็นสัณฐานเลื่อนระหว่าง h 12 แรกของผู้แต่ง biofilm ในจำลองบ่อหอภาพนิ่ง (รูปที่ 3E) ความแตกต่างความยาวระหว่างประชากรของ planktonic 2000 และ2000 biofilm เซลล์ได้อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.0001 ในunpaired t ทดสอบ) โครงสร้างโทรศัพท์มือถือภายใน biofilms มาเฉลี่ยมากกว่าสองครั้งเป็นเวลานาน มีตัวแปรเพิ่มเติมในขนาด (มีค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานความยาวของ 3.1 μm) และถึงความยาวสูงสุด 10 ครั้งมากกว่าที่วัดภายในวัฒนธรรม planktonic ซึ่งการbiofilm ได้รับ (รูปที่ 3E)Haloferax volcanii จัดแสดงต่อไปนี้สังคม motilityทรัพย biofilms คงเหลวเริ่มต้นการสอบสวนของ dynamics biofilm ในของเหลวคงที่โดยควบ biofilms 7 วันผู้ใหญ่ผ่านเครื่องกลhomogenization ตาม ด้วยการหน่วงเวลาถ่ายภาพผ่านการระยะเวลาของการปฏิรูปการ จะแปลกใจของเรา ซึ่งนำไปสู่การค้นพบของการรวมกลุ่มใหม่โทรศัพท์มือถืออย่างรวดเร็ว และ sustained ประสานสังคม motility (รูปที่ 4 ดูแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ 7:ภาพยนต์ 2 – 6) เพิ่มโครงสร้างเซลลูลาร์ได้เห็น 3 hต่อ homogenization หลังจากที่เซลล์ ความหนาแน่นได้เข้มข้นแบบเพิ่มหน่วยภายในเซ็นทรัลพัฒนาSL-biofilm กับสื่อรอบข้างเป็นระยะโปร่งใสหลัง 48 h (รูปที่ 4A) ตัวอย่างถูกเก็บรวบรวมจาก biofilm homogenized เป็นกลุ่มเวลาศูนย์ และจากเซ็นทรัล biofilm และสื่อรอบที่ 48 hBiofilm homogenized เป็นกลุ่มมีส่วนประกอบเดียวเซลล์และรวมข้อมูลโทรศัพท์มือถือ หลังจาก h 48 รายล้อมด้วยกลางประกอบด้วยเซลล์น้อย planktonic และSL biofilm ประกอบด้วยความหนาแน่นสูงของเซลล์ขนาดใหญ่รวม รูปภาพที่เก็บรวบรวมระหว่างการปฏิรูปศาสนาในช่วงเวลาที่3 h (รูปที่ 4A), 10 นาที (รูปที่ 4B) และ1 นาที (ดูแฟ้ม 3 และ 4: ภาพยนตร์ 2 และ 3)จับประสานงานของ filaments ใหญ่ของเซลล์เป็นสาขาเช่นเว็บแบบไดนามิก Rippling หรือ เหมือนคลื่นการส่งกระแสข้อมูลถูกตรวจสอบระหว่างนามสกุลและ retractionโครงสร้างเหล่านี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งชัดที่ต่ำเฟรมราคาพิเศษ (เช่น ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 4:3 ภาพยนตร์)Motility สังคมถูกทริกเกอร์ยัง ด้วยอาการกังวลต่อจริง หรือทรัพยบางส่วนของ SLbiofilms ที่พัฒนาอย่างมากก่อนหน้านี้(ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 5, 6 และ 7: ภาพยนตร์ 4, 5 และ 6)แหวนรูป SL-biofilms ซึ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผลการ
Haloferax เซลล์ volcanii พัฒนาเป็นอาณานิคมโครงสร้าง
ไบโอฟิล์มและไบโอฟิล์มของเหลวคง
planktonic H. volcanii เซลล์ DS2 เติบโตในวัฒนธรรมสั่น
(รูปที่ 1A) ที่เกิดขึ้นได้อย่างง่ายดายไบโอฟิล์มในสื่อที่อุดมไปด้วยโดยทั่วไป
ประเภท HV-YPC และ HV-Ca ภายในทดลองหลาย
ระบบที่ให้มั่นคง พลาสติกหรือแก้วชั้นล่าง.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม [7] การพัฒนาบนพื้นผิวของ
ฟิลเตอร์โพลีคาร์บอเนตที่วางอยู่บนสื่อที่เป็นของแข็ง (รูปที่ 1B)
และมี Cryo-การประมวลผลและตัดข้ามที่เผยให้เห็น
โครงสร้างของพื้นผิวที่มีรอยแยกล้อมรอบด้วย
โครงสร้างทรงกลม (รูปที่ 1B) ระดับที่ยิ่งใหญ่ที่สุดของ
โครงสร้างที่ซับซ้อนก็สังเกตเห็นเมื่อไบโอฟิล์มได้รับการ
ปลูกในของเหลวคงที่ (SL-ไบโอฟิล์มรูปที่ 1C) ปลูก
SL-ไบโอฟิล์มสไลด์ภายในห้องและบน
พื้นผิวของคูปองแก้ว borosilicate วางไว้ในหกดี
แผ่นได้รับอนุญาตการย้อมสีโดยตรงและเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายภาพ
ของโครงสร้างไบโอฟิล์มที่ละเอียดอ่อนที่มองเห็น macroscopically
(รูปที่ 1C).
เราเริ่มต้นด้วยการตรวจสอบการพัฒนาของป่าชนิด
เอช volcanii ไบโอฟิล์ม DS2 ในของเหลวคงใช้ CLSM และ
สีย้อมเมมเบรนของเซลล์ FM 1-43 และ CellMask สีส้ม (CMO รูปที่ 1D-I, แฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S1) Circular
microcolonies เกิดขึ้นภายใน 48 ชั่วโมง (รูปที่ 1D) ซึ่งนำไปสู่การ
ที่ดีที่กำหนดกลุ่ม / มวลรวมหลังวันที่ 5 (รูปที่ 1E).
SL-ไบโอฟิล์มถึงการเจริญเติบโตหลังจากวันที่ 7 ของการบ่ม
ที่อุณหภูมิ 42 ° C มีการพัฒนาเป็นอาคารหลายชั้นที่มี
สัณฐานเหมือนเกล็ด (รูป 1F, G, H) อาคารขนาดใหญ่ที่
ถูกล้อมรอบด้วยชั้นความหนาแน่นของกลุ่มที่มีขนาดเล็ก
หรือ microcolonies และถูกแยกออกจากพื้นที่ที่มีเล็ก ๆ น้อย ๆ
ความหนาแน่นของเซลล์หรือไม่ (รูป 1E-H) โครงสร้างโดยรวม
สมบูรณ์ก็ยังคงเป็นกลุ่มที่มีขนาดใหญ่ล้อมรอบด้วย
microcolonies ขนาดเล็กสำหรับหลายสัปดาห์ถึงแม้ว่าการเปรียบเทียบ
มุมมองมุมฉากของ CMO เปื้อน SL-ไบโอฟิล์ม
แสดงให้เห็นว่าหลังจาก 2 สัปดาห์ความสูงของโครงสร้างส่วนใหญ่
ได้รับการลดลงและน้อยของพื้นที่ผิวทั้งหมดถูก
ปกคลุม กับ microcolonies (รูปที่ 1I, 2 สัปดาห์) ขนาดใหญ่
กลุ่ม / อาคารเช่นตัวอย่างที่แสดงในรูปที่ 1F, G, H,
แตกต่างกันในความสูงและความกว้างสูงสุดกับวัด
ความสูงของ 148 ไมโครเมตร.
Microcolonies ภายในไบโอฟิล์มที่เกิดขึ้นจาก GFP-แสดง
Haloferax volcanii คราบผูกสายพันธุ์การกำหนดเป้าหมาย polysaccharide,
ดีเอ็นเอ และโปรตีน amyloid
หลายสายพันธุ์เอช volcanii ถูกออกแบบมาเพื่อแสดงความ
GFP เพื่อศึกษาองค์ประกอบของ ECM มีเป้าหมายในการเสริม
และขยายการทดลองดำเนินการโดยการย้อมสีFrölsและ
เพื่อนร่วมงาน [38] ยืนยันในการแสดงออก GFP เป็นครั้งแรกที่
เข้าถึงได้ภายในอาณานิคมที่เกิดขึ้นจากสอง GFP แสดงออก
สายพันธุ์ที่เกิดขึ้นในการศึกษาครั้งนี้ อาณานิคมที่เกิดขึ้นจากผู้ปกครอง
เอช ความเครียด volcanii H1206 (รูปที่ 2A; แผงด้านซ้าย) ไม่
autofluoresce กับการกระตุ้นสีฟ้า (รูปที่ 2A, แผงกลาง)
ในขณะที่ผู้ที่สร้างขึ้นโดยเอช volcanii H1206 (pJAM1020)
สายพันธุ์ที่อยู่บนพื้นฐานของการพัฒนาก่อนหน้านี้พลาสมิด pJAM1020
(ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตารางที่ S2) [59] แสดงให้เห็นสม่ำเสมอและ
ระดับสูงของการเรืองแสง GFP (รูปที่ 2A. แผงขวา)
เพิ่มเติม GFP-แสดงสายพันธุ์เอช volcanii H1206
(pSC409GFP) ที่มีสีแดงขยับเดียวกันอาณานิคม geneproduced GFP กับสัญญาณ GFP ที่แตกต่างกัน ทั้ง
ความรุนแรงและกระจายผลในการแบ่งประเภท
ของรูปแบบของสัญญาณ GFP ภายในอาณานิคมพัฒนา
(แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S1) H1206 (pJAM1020)
สายพันธุ์ที่ได้รับการคัดเลือกดังนั้นสำหรับ compositional ไบโอฟิล์ม
การศึกษาเพื่อให้แน่ใจว่าการแสดงออก GFP ตลอด
ประชากรโทรศัพท์มือถือ.
กลุ่ม Cellular มองเห็นได้ในไบโอฟิล์ม GFP-แสดงความ
ถูก colocalized กับสัญญาณจากเท็กซัสคอนจูเกตสีแดง
ของเลคติน concanavalin (Cona; เต็มตัว 2B)
และมีผลผูกพันกับดีเอ็นเอย้อม 4 '6 diamidino-2-phenylindole
(DAPI; รูป 2C, D, E) Cona เป็นที่รู้จักกัน
ผูก-manopyranosyl และสารตกค้าง-glucopyranosyl
ภายใน glyconjugates ของไบโอฟิล์ม haloarchaeal [38].
DAPI ได้รับเลือกเป็นคราบดีเอ็นเอ extracellular สำหรับ
การศึกษา CLSM ของเราเพราะมันเป็นที่รู้จักกันเปื้อน EDNA
ตัวในไบโอฟิล์ม haloarchaeal [38] Frölsและ
เพื่อนร่วมงาน [38] ใช้สามสีย้อมกรดนิวคลีอิกที่จะแยกแยะความแตกต่าง
ระหว่างดีเอ็นเอในเซลล์และนอกเซลล์
ในไบโอฟิล์มที่เกิดขึ้นโดยเอช volcanii และเพิ่มเติม
สายพันธุ์ haloarchaeal และแสดงให้เห็นว่า (ก) เพียง acridine
ส้มย้อมเซลล์สดบุคคลที่ปรากฏคล้าย
การใช้งานของเรา กรดนิวคลีอิกเซลล์ดูดซึมสีย้อม Syto 9
(แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S2) (ข) สัญญาณจาก DAPI
ปรากฏชัดเจนและเม็ดและถูก colocalized
กับ microcolonies (ค) การย้อมสีพร้อมกันกับ 7-
hydroxy-9H-1-3- dichloro-9,9-dimenthylacridin-2-หนึ่ง
(DDAO), สีย้อมกรดนิวคลีอิกถือว่าผ่านไม่สมบูรณ์
ไปยังเซลล์นำไปสู่รูปแบบที่เหมือนกันเป็นหลัก
ของการส่งสัญญาณการเรืองแสงและ (ง) น้อยมากเซลล์ที่ไม่ทำงาน
ที่มีอยู่ภายในเอช volcanii ไบโอฟิล์ม (แม้หลังจาก
30 วันของการบ่ม) บอกว่าสังเกต DAPI
สัญญาณไม่ได้มาจากเซลล์ที่ตายแล้ว การวิเคราะห์ CLSM ของเรายัง
แสดงให้เห็น colocalization ของวัสดุ DAPI เปื้อนกับ
microcolonies และขาดสัญญาณจากแต่ละเซลล์.
เพิ่มเติมฟื้นฟูสามมิติของ DAPI เปื้อน
ไบโอฟิล์ม GFP-แสดงเปิดเผยว่าดีเอ็นเอเข้มข้น
ในชั้นฐานของไบโอฟิล์มและแยกย้ายกันไป
เป็น โครงสร้างเหมือนขนนกที่ด้านบนของขนาดใหญ่
อาคาร (รูปที่ 2C, D, E; แผงล่าง).
โครงสร้างขนาดใหญ่ตั้งข้อสังเกตในไบโอฟิล์มเป็นผู้ใหญ่ที่มี
แสงที่ส่งและผ่านการเรืองแสง GFP ถูก
colocalized ยังมีสัญญาณจากคองโกสีแดง (CR)
และ thioflavin T (THT) คราบเหล่านี้จะถูกใช้เป็นประจำ
เช่นการทดสอบลักษณะการปรากฏตัวของความหลากหลาย
ของโปรตีน amyloid รวมทั้งการวินิจฉัยและการศึกษา
เช่นเดียวกับใน pJAM1020 แต่โคลนเข้าสู่พลาสมิด pTA409 ของโล่ก่อให้เกิดโรคที่เกิดขึ้นจาก amyloidosis [60-63],
และใน การตรวจสอบหลายยึดเกาะจุลินทรีย์และไบโอฟิล์ม
ก่อ [27,64-71].
คองโกเรืองแสงสีแดง (CRF) ถูกนำมาใช้ตามที่ได้รับ
การเสนอให้เป็นวิธีการที่มีความสำคัญมากที่สุดและเชื่อถือได้สำหรับ
การตรวจหา amyloid เมื่อย้อมสีด้วย CR [60] และได้
ถูกนำมาใช้ เพื่อ biofilm ศึกษา compositional [72] CRF
ถูกกำหนดอย่างรวดเร็วและเม็ดในลักษณะที่ปรากฏและถูก
colocalized กับกลุ่มของเซลล์ไบโอฟิล์มขนาดใหญ่และ
อาคารแสดงในรูปที่ 2F, G, H ซ้อนทับที่เดียว
เซลล์ GFP ผลิตจะมองเห็นได้และภาพของ CRF ที่
600 ×ขยาย (แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S3) ชี้ให้เห็น
ว่า CR ไม่เปื้อนแต่ละเซลล์ CR-เปื้อน
มวลไบโอฟิล์มยังเป็นสีส้มแดงภายใต้การส่ง
แสงและมองเห็นได้ macroscopically (รูปที่ 2I-L).
นอกจากนี้สัญญาณการเรืองแสงสีเขียวที่ตรวจพบภายใน
tht เปื้อนไบโอฟิล์มผู้ใหญ่ที่เกิดขึ้นจากสายพันธุ์ที่ไม่ GFP
กับการกระตุ้นสีฟ้า (รูปที่ 2M ; ไม่มีสัญญาณการตรวจพบในการควบคุม
. โดยไม่ต้องย้อมสี THT)
Haloferax volcanii ผ่านความแตกต่างทางสัณฐานวิทยา
ระหว่างการเจริญเติบโตไบโอฟิล์ม
การดำเนินการของ GFP สำหรับการแสดงนำไบโอฟิล์ม
ที่จะสังเกตไม่คาดคิดของความแปรปรวนที่เพิ่มขึ้นใน
ความยาวของโครงสร้างของเซลล์ภายในไบโอฟิล์มเมื่อเทียบกับ
เซลล์ planktonic (รูปที่ 3) H. volcanii เซลล์ DS2 จะ
รู้จักกันเป็น pleomorphic ปรากฏทรงกลมดิสก์เหมือน
หรือเป็นแท่งสั้น 1-3 × 2-3 ไมโครเมตรขนาดในวัฒนธรรมของเหลว
[39] (รูปที่ 1A และ 3A) อย่างไรก็ตามในระหว่างการตรวจสอบ
ของ GFP-แสดง H. volcanii H1206 (pJAM1020) ไบโอฟิล์ม
เซลล์เราสังเกตโครงสร้างของเซลล์ที่มีขนาดใหญ่ประกอบด้วย
แท่งยาวในห่วงโซ่บางครั้งใกล้ 30 ไมโครเมตร
ยาว (รูปที่ 3B, C, D) โครงสร้างเหล่านี้ติดอยู่
กับพื้นผิวและถูกพบในการพัฒนา
H1206 (pJAM1020) ไบโอฟิล์มสังเกตในทุกจุดเวลา
(รูปที่ 3B, C, D; แฟ้มเพิ่มเติมที่ 2: ภาพยนตร์ 1) ในหลาย
เปลี่ยนอิสระ H1206 (pJAM1020) สายพันธุ์
ได้เป็นอย่างดี ในขณะที่ไบโอฟิล์มที่เกิดขึ้นจากสายพันธุ์เอช volcanii ที่ไม่
ได้มีพลาสมิดแสดงออก GFP (H53 และ H98 ดู
แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S2).
นอกจากนี้การทดลองตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่าง
แท่งยาวที่ถูกล่ามโซ่ morphotype และไบโอฟิล์มในการก่อ
H1206 (pJAM1020 ) สายพันธุ์ วัฒนธรรมของเซลล์ planktonic
ที่มีความยาวเฉลี่ย 1.6 ไมโครเมตรเปลี่ยนก้าน
กะในช่วงแรก 12 ชั่วโมงของการสร้างไบโอฟิล์มใน
บ่อซ้ำสไลด์ห้อง (3E รูป) ความแตกต่าง
ในความยาวระหว่างประชากร 2,000 planktonic และ
2,000 เซลล์ไบโอฟิล์มนัยสำคัญทางสถิติ (p <0.0001 ใน
การทดสอบค่าที unpaired) โครงสร้างของเซลล์ภายในไบโอฟิล์มอยู่บน
เฉลี่ยมากกว่าสองเท่าเป็นตัวแปรมากขึ้นใน
ขนาด (มีค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานความยาว 3.1 ไมครอน) และ
ถึงความยาวสูงสุดสิบครั้งยิ่งใหญ่กว่าที่
วัดภายในวัฒนธรรม planktonic จากการที่
ไบโอฟิล์มได้มา (3E รูป).
Haloferax volcanii จัดแสดงนิทรรศการเคลื่อนที่ทางสังคมต่อไปนี้
การหยุดชะงักของของเหลวคงไบโอฟิล์ม
สอบสวนพลวัตของไบโอฟิล์มในของเหลวคงที่เริ่ม
โดยรบกวนไบโอฟิล์ม 7 วันผ่านผู้ใหญ่กล
ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันตามมาด้วยการถ่ายภาพตามเวลาในช่วง
ระยะเวลาการปฏิรูป ที่แปลกใจของเรานี้จะนำไปสู่การค้นพบ
ของใหม่การรวมตัวของเซลล์อย่างรวดเร็วและยั่งยืนการประสานงาน
การเคลื่อนไหวทางสังคม (รูปที่ 4 ดูแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ 7:
ภาพยนตร์ 2-6) มวลรวมโทรศัพท์มือถือที่มีโครงสร้างถูกมองเห็น 3 ชั่วโมง
ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันดังต่อไปนี้หลังจากที่ความหนาแน่นของเซลล์
ความเข้มข้นเพิ่มขึ้นภายในการพัฒนากลาง
SL-ไบโอฟิล์มที่มีขนาดกลางอย่างเห็นได้ชัดโดยรอบกลายเป็น
โปร่งใสหลังจาก 48 ชั่วโมง (รูปที่ 4A) โดยเก็บตัวอย่าง
จากไบโอฟิล์มหดหายในเวลาที่ศูนย์และจาก
ไบโอฟิล์มกลางและกลางรอบที่ 48 ชม.
ไบโอฟิล์มหดหายประกอบด้วยเดียว
เซลล์และมวลรวมโทรศัพท์มือถือ; หลังจาก 48 ชั่วโมง, รอบ
กลางมีเซลล์ planktonic น้อยและ
SL-ไบโอฟิล์มที่มีความหนาแน่นสูงของเซลล์ในขนาดใหญ่
มวลรวม รูปภาพที่เก็บรวบรวมได้ในช่วงการปฏิรูปในช่วงเวลา
3 ชั่วโมง (รูปที่ 4A) 10 นาที (รูปที่ 4B) และ
1 นาที (ดูแฟ้มเพิ่มเติมที่ 3 และ 4: ภาพยนตร์ 2 และ 3)
จับการประสานงานของเส้นใยที่มีขนาดใหญ่ของเซลล์
เป็นสาขาเว็บเหมือนแบบไดนามิก . rippling หรือคลื่นเหมือน
สตรีมมิ่งได้รับการสังเกตในระหว่างการขยายและหดตัว
ของโครงสร้างเหล่านี้เห็นได้ชัดโดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ต่ำ
อัตราเฟรม (เช่นดูแฟ้มเพิ่มเติม 4: ภาพยนตร์ 3).
การเคลื่อนไหวของสังคมถูกเรียกโดยความปั่นป่วนทางร่างกายหรือ
การหยุดชะงักบางส่วนที่ไม่ถูกรบกวนก่อนหน้านี้การพัฒนา SLbiofilms
(ดูแฟ้มเพิ่มเติม 5, 6 และ 7: ภาพยนตร์ 4, 5 และ 6).
แหวนรูป SL-ไบโอฟิล์ม, ซึ่งการทด