Monitoring Rapamycin-Induced FRB-FK

Monitoring Rapamycin-Induced FRB-FKBP12 Association in Living Cells Using BRET6. The imaging results obtained with the BRET6 fusion system in mice suggest that this system could provide the required sensitivity for reporting drug-mediated PPIs both in cells and living subjects. To validate the potential of BRET6 for imaging PPIs, we constructed a genetically encoded bimolecular FRB/FKBP12 sensor consisting of FRB-RLuc8.6 and FKBP12-TurboFP635 fusion fragments, whose association is under the control of the macrolide rapamycin. The rapamycin-mediated molecular interaction between the 11-kDa FRB domain of the mammalian target of rapamycin (mTOR) and the 12-kDa FKBP12 has been extensively characterized (31) and is a standard proof of principle system for PPIs assays (8, 32, 33). Rapamycin-induced interaction of FRB and FKBP12 juxtaposes the donor RLuc8.6 and acceptor TurboFP635, eliciting efficient energy transfer measurable as BRET signal (Fig. 4A). Our sensor constructs contained both donor and acceptor proteins at the C terminus of the binding unit (FRB-RLuc8.6 and FKBP12-TurboFP635). A schematic representation and mechanism of detection are shown in Fig. 4A. To characterize this BRET6 FRB/FKBP12 sensor in intact cells, we created HT1080 cells constitutively expressing both sensor subunits. The fusion proteins expression of the sensor components was confirmed by Western blot analysis (Fig. S4). Incubation of HT1080 cells expressing the BRET6 sensor with increasing concentrations of rapamycin generated a strong BRET signal, having higher acceptor to donor ratios than cells treated with carrier control. This result shows that the two components of BRET6 sensor, FRB-RLuc8.6 and FKBP12-TurboFP635, are brought together by the assembly of FRB and FKBP12 in the presence of rapamycin, eliciting BRET. The dependence of the BRET signal on rapamycin concentration followed a dose–response curve with an EC50 value of 0.7 ± 0.2 nM and a maximum BRET induction of 1.9-fold for rapamycin concentrations above 5 nM (Fig. 4B). Moreover, we verified the specificity of the BRET6 sensor by inhibiting the effect of rapamycin on the BRET6 sensor by the addition of FK506, an FKBP binding compound known to compete with rapamycin for FKBP12/FRB interactions (34). A/D calculations revealed that FK506 majorly perturbs the rapamycin-induced FRB/FKBP12 associations in BRET6 sensor cells treated with 1 nM rapamycin by 68% and cells treated with 0.5 nM rapamycin by 75% (Fig. 4C). These findings show that the observed BRET signal is caused by a specific molecular interaction between FRB and FKBP12 and indicate that our bimolecular FRB/FKBP12 BRET6 sensor performs well in cultured cells.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตรวจสอบความสัมพันธ์เกิด Rapamycin FRB-FKBP12 ในชีวิตเซลล์โดยใช้ BRET6 ผลการถ่ายภาพได้ ด้วยระบบฟิวชั่น BRET6 ในหนูแนะนำว่า ระบบนี้สามารถให้ความไวต้องรายงาน mediated ยา PPIs ทั้งในเซลล์ และอาศัยวิชา เพื่อตรวจสอบศักยภาพของ BRET6 สำหรับภาพ PPIs เราสร้างแปลงพันธุกรรมเข้ารหัส bimolecular FRB/FKBP12 เซนเซอร์ประกอบด้วย FRB RLuc8.6 และ FKBP12 TurboFP635 หลอมชิ้นส่วน สมาคมที่อยู่ภายใต้การควบคุมของ rapamycin แมคโคไรด์ Rapamycin mediated โมเลกุลปฏิสัมพันธ์ระหว่างโดเมน FRB 11-kDa ของเป้าหมาย mammalian ของ rapamycin (mTOR) และ FKBP12 12-kDa ได้อย่างกว้างขวางลักษณะ (31) และเป็นหลักฐานมาตรฐานหลักระบบ PPIs assays (8, 32, 33) เกิด Rapamycin โต้ตอบ FRB และ FKBP12 juxtaposes ผู้บริจาค RLuc8.6 และ acceptor TurboFP635, eliciting ประสิทธิภาพพลังงานโอนย้ายวัดเป็นสัญญาณเบรต (Fig. 4A) โครงสร้างของเซ็นเซอร์ประกอบด้วยทั้งผู้บริจาคและ acceptor โปรตีนที่นัส C หน่วยรวม (FRB RLuc8.6 และ FKBP12-TurboFP635) แผนผังตัวอย่างและกลไกของการตรวจสอบจะแสดงใน Fig. 4A การกำหนดลักษณะนี้เซ็นเซอร์ BRET6 FRB/FKBP12 ในเซลล์เหมือนเดิม เราสร้างเซลล์ HT1080 constitutively แสดง subunits เซ็นเซอร์ทั้งสอง นิพจน์โปรตีนฟิวชั่นประกอบเซ็นเซอร์ได้รับการยืนยัน โดยการวิเคราะห์คืนในตาตะวันตก (ฟิก S4) คณะทันตแพทยศาสตร์ของเซลล์ HT1080 กำลังเซ็นเซอร์ BRET6 ด้วยเพิ่มความเข้มข้นของ rapamycin สร้างสัญญาณเบรตแข็งแรง มี acceptor สูงให้อัตราส่วนผู้บริจาคกว่าเซลล์ที่ถือว่า มีการควบคุมการขนส่ง ผลนี้แสดงว่า ส่วนประกอบที่สองของเซนเซอร์ BRET6, FRB RLuc8.6 และ FKBP12-TurboFP635 นำเข้าด้วยกัน โดย FRB และ FKBP12 ในต่อหน้าของ rapamycin, eliciting เบรต การพึ่งพาของสัญญาณเบรต rapamycin ความเข้มข้นตามปริมาณ – ตอบเส้นโค้ง มีค่า EC50 ของ nM ± 0.2 0.7 และเหนี่ยวนำเบรตที่สูงสุดของ 1.9-fold สำหรับความเข้มข้นของ rapamycin เหนือ 5 nM (Fig. 4B) นอกจากนี้ เราตรวจสอบ specificity ของเซ็นเซอร์ BRET6 โดย inhibiting ผลของ rapamycin เซ็นเซอร์ BRET6 โดยการเพิ่ม FK506 สารประกอบรวม FKBP การจะแข่งขันกับ rapamycin ใน FKBP12/FRB โต้ตอบ (34) การคำนวณ A/D เปิดเผยว่า FK506 majorly perturbs สมาคม FRB/FKBP12 rapamycin เกิดในเซลล์เซ็นเซอร์ BRET6 รับ 1 nM rapamycin โดย 68% และเซลล์รับ 0.5 nM rapamycin โดย 75% (Fig. 4C) ผลการวิจัยเหล่านี้แสดงว่า สัญญาณเบรตสังเกตเกิดจากการโต้ตอบโมเลกุลเฉพาะระหว่าง FRB FKBP12 และระบุว่า เซ็นเซอร์ของเรา BRET6 FRB/FKBP12 bimolecular ทำดีในเซลล์อ่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจสอบ Rapamycin-Induced FRB-FKBP12 สมาคมในเซลล์ที่มีชีวิตใช้ BRET6 ผลที่ได้รับการถ่ายภาพด้วยระบบฟิวชั่น BRET6 ในหนูแสดงให้เห็นว่าระบบนี้สามารถให้ความไวที่จำเป็นสำหรับการรายงาน PPIs พึ่งยาเสพติดทั้งในเซลล์และวิชาที่อยู่อาศัย ในการตรวจสอบศักยภาพของ BRET6 PPIs สำหรับการถ่ายภาพที่เราสร้างเข้ารหัสพันธุกรรม bimolecular FRB / เซ็นเซอร์ FKBP12 ประกอบด้วย FRB-RLuc8.6 และ FKBP12-TurboFP635 เศษฟิวชั่นที่มีการเชื่อมโยงที่อยู่ภายใต้การควบคุมของ rapamycin macrolide การทำงานร่วมกันของโมเลกุล rapamycin พึ่งระหว่างโดเมน FRB 11 กิโลดาลตันของเป้าหมายของการเลี้ยงลูกด้วยนม rapamycin (mTOR) และ 12 กิโลดาลตัน FKBP12 มีลักษณะอย่างกว้างขวาง (31) และเป็นข้อพิสูจน์มาตรฐานของระบบหลักการสำหรับการตรวจ PPIs (8, 32 , 33) rapamycin ปฏิสัมพันธ์ที่เกิดขึ้นของ FRB และ FKBP12 juxtaposes RLuc8.6 ผู้บริจาคและใบเสร็จ TurboFP635 ทึ่งการถ่ายโอนพลังงานที่มีประสิทธิภาพที่วัดได้เป็นสัญญาณ BRET (รูป. 4A) สร้างเซ็นเซอร์ของเรามีทั้งผู้บริจาคและโปรตีนตัวรับที่สถานี C ของหน่วยที่มีผลผูกพัน (FRB-RLuc8.6 และ FKBP12-TurboFP635) แผนผังแสดงและกลไกของการตรวจสอบจะมีการแสดงในรูป 4A ลักษณะเซ็นเซอร์นี้ BRET6 FRB / FKBP12 ในเซลล์เหมือนเดิมเราได้สร้างเซลล์ HT1080 constitutively แสดงทั้งสองหน่วยย่อยเซ็นเซอร์ ฟิวชั่นการแสดงออกของโปรตีนของส่วนประกอบเซ็นเซอร์ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ดวงตะวัน (รูป. S4) การฟักตัวของเซลล์ HT1080 แสดง BRET6 เซ็นเซอร์ที่มีความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ rapamycin สร้างสัญญาณ BRET แข็งแกร่งมีใบเสร็จสูงกว่าอัตราส่วนของผู้บริจาคกว่าเซลล์ได้รับการรักษาด้วยการควบคุมการให้บริการ ผลที่ได้นี้แสดงให้เห็นว่าทั้งสองส่วนของเซ็นเซอร์ BRET6, FRB-RLuc8.6 และ FKBP12-TurboFP635 จะถูกนำมารวมกันโดยการชุมนุมของ FRB และ FKBP12 ในการปรากฏตัวของ rapamycin ทึ่ง BRET การพึ่งพาอาศัยกันของสัญญาณ BRET กับความเข้มข้น rapamycin ตามเส้นโค้งปริมาณการตอบสนองที่มีค่า EC50 0.7 ± 0.2 นาโนเมตรและเหนี่ยวนำสูงสุด BRET 1.9 เท่าสำหรับ rapamycin ความเข้มข้นสูงกว่า 5 นาโนเมตร (รูป. 4B) นอกจากนี้เรายังมีการยืนยันความจำเพาะของเซ็นเซอร์ BRET6 โดยการยับยั้งผลกระทบของ rapamycin บนเซ็นเซอร์ BRET6 โดยนอกเหนือจาก FK506, สารประกอบที่มีผลผูกพัน FKBP ที่รู้จักกันที่จะแข่งขันกับ rapamycin สำหรับ FKBP12 / FRB ปฏิสัมพันธ์ (34) A / D คำนวณเปิดเผยว่า FK506 majorly perturbs FRB rapamycin ที่เกิด / สมาคม FKBP12 ใน BRET6 เซลล์เซ็นเซอร์รับการรักษาด้วย rapamycin 1 นาโนเมตรโดย 68% และรับการรักษาด้วยเซลล์ rapamycin 0.5 นาโนเมตรโดย 75% (รูปที่. 4C) การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่าข้อสังเกตสัญญาณ BRET เกิดจากการปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลที่เฉพาะเจาะจงและ FRB FKBP12 และแสดงให้เห็นว่าเรา bimolecular FRB / FKBP12 เซ็นเซอร์ BRET6 มีประสิทธิภาพดีในเซลล์เพาะเลี้ยง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การตรวจสอบการ frb-fkbp12 ราปาไมซินสมาคม ในเซลล์มีชีวิต ใช้ bret6 . ภาพผลลัพธ์ที่ได้กับ bret6 ฟิวชั่นในระบบ หนูแนะนำว่า ระบบนี้สามารถให้ความไวต่อยา ppis ต้องรายงานทั้งในระดับเซลล์และสิ่งมีชีวิต . การตรวจสอบศักยภาพของ bret6 ppis สำหรับการถ่ายภาพ ,เราสร้างพันธุกรรมเข้ารหัสสารชีวโมเลกุล frb / fkbp12 เซนเซอร์ประกอบด้วย frb-rluc8.6 fkbp12-turbofp635 ฟิวชั่นและชิ้นส่วน ซึ่งสมาคมอยู่ภายใต้การควบคุมของยาฆ่าเชื้อแมคโครไลด์ราปามัยซิน .การปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลราปาไมซิน ( 11 ) frb โดเมนของเป้าหมายของราปาไมซิน ( ) mtor ) และ 12 กิโล fkbp12 ได้รับอย่างกว้างขวางลักษณะ ( 31 ) และมีการพิสูจน์มาตรฐานของหลักการระบบ ppis ) ( 8 , 32 , 33 ) การปฏิสัมพันธ์ของ frb ราปามัยซิน และ fkbp12 juxtaposes ผู้บริจาคและ turbofp635 rluc8.6 พระนาสิก ,eliciting มีประสิทธิภาพการถ่ายโอนพลังงานที่วัดได้เป็นเบร็ทสัญญาณ ( รูปที่ 4 ) เซ็นเซอร์ของเราโครงสร้างที่มีอยู่ทั้งผู้บริจาคและโปรตีนพระนาสิกที่ C ปลายทางของหน่วยมัด ( frb-rluc8.6 และ fkbp12-turbofp635 ) การแสดงแผนผังและกลไกการตรวจสอบที่แสดงในรูปที่ 4 . ในลักษณะนี้ bret6 frb / fkbp12 เซ็นเซอร์เหมือนเดิมเซลล์เราสร้าง ht1080 เซลล์ constitutively แสดงทั้งเซนเซอร์ย่อย . การแสดงออกของโปรตีนรวมของเซ็นเซอร์ส่วนประกอบได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ Western blot ( ภาพ S4 ) ht1080 บ่มเซลล์แสดงเซ็นเซอร์ bret6 เพิ่มความเข้มข้นของราปาไมซินสร้างแข็งแรง Bret สัญญาณ มีพระนาสิกสูงอัตราส่วนผู้บริจาคกว่าเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วยการควบคุมพาหะผลที่ได้นี้แสดงให้เห็นว่าสององค์ประกอบของ bret6 เซ็นเซอร์ และ frb-rluc8.6 fkbp12-turbofp635 อยู่มาด้วยกัน โดยประกอบ frb และ fkbp12 ต่อหน้าราปาไมซิน eliciting , เบร็ท . การพึ่งพาอาศัยกันของสัญญาณเบร็ทในความเข้มข้นตามปริมาณการราปามัยซิน–โค้งด้วย ec50 มูลค่า 0.7 ± 0.2 nm และสูงสุด Bret แม่เหล็กไฟฟ้า 19-fold สำหรับความเข้มข้นราปาไมซินข้างบน 5 nm ( ภาพ 4B ) นอกจากนี้ เราตรวจสอบความจำเพาะของเซ็นเซอร์ bret6 โดยยับยั้งผลของราปามัยซินในเซ็นเซอร์ bret6 โดยนอกเหนือจาก fk506 , fkbp ผูกสารที่รู้จักกันเพื่อแข่งขันกับราปาไมซินสำหรับ fkbp12 / frb ปฏิสัมพันธ์ ( 34 )/ D การคำนวณ พบว่า fk506 majorly โดยการเหนี่ยวนำการสูญเสียราปาไมซิน frb / fkbp12 สมาคมใน bret6 เซ็นเซอร์เซลล์รักษาด้วย 1 nm ราปามัยซินโดย 68 % และเซลล์ที่ได้รับ 0.5 nm ราปามัยซิน โดย 75% ( ภาพที่ 4C )ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่า สังเกตที่ Bret สัญญาณเกิดจากปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลที่เฉพาะเจาะจงและ frb fkbp12 สารชีวโมเลกุล และระบุว่า ของเรา frb / fkbp12 bret6 เซ็นเซอร์มีประสิทธิภาพดีในการเพาะเลี้ยงเซลล์