2.4.5. RNA extraction and real-time

2.4.5. RNA extraction and real-time RT-PCR of fish tissue
RNA was extracted from the heart tissues using Trizol reagent (Invitrogen) as described by Devold et al. (2000). The exogenous control SAV (sterile filtered supernatant) was added to tissue samples at a volume of 7.0 µL per sample. The ISAV7 and nsP1 assays were used for real-time RT-PCR analysis.
2.4.6. Normalisation of data
Prior to real-time RT-PCR analysis the ISAV7 assay was optimized with regard to concentrations of primers and probe. An efficiency test was performed to test the ISAV7 assay. The optimization and efficiency test for nsP1 assay was done as described by Andersen et al. (2010). This test was performed by using a fivefold dilution series for ISA virus. Template used in the efficiency test was cultured ISA virus, as described above. The mean Ct-value for each triplicate was calculated and a standard curve was made by plotting Ct-values in triplicates against the serial logarithmic dilutions. The amplification efficiency (E) for the ISAV7 and nsP1 assays was calculated using the formula: (dilution factor (-1/-slope)) -1. The ISAV7 and nsP1 assays had a slope of -2.4172 and -3.6652, respectively. The regression values (R2) of the different assays were 0.9989 for ISAV7 and 0.9975 for nsP1. The efficiency (E) of the ISAV7 and nsP1 assays was E = 0.9461 and E = 0.8743, respectively. Relative quantification (normalisation) of viral RNA from ISA virus in the water samples was performed using the Microsoft-excel based computer software Q-Gene (Muller et al., 2002). Ct-values from the ISAV7 assay were normalized against the Ct-values from the nsP1 assay (exogenous control). The results of normalised expression (NE) values were transformed into fold increases by defining the lowest NE-value obtained during the experiment of all the water samples as 1.The data were then Log2 transformed and imported into the GraphPad Prism 6.02 Windows software (GraphPad Software, Inc.).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4.5 การสกัดอาร์เอ็นเอและเรียลไทม์ RT-PCR ของปลาเนื้อเยื่อ
RNA ถูกสกัดจากเนื้อเยื่อหัวใจด้วยการใช้สาร trizol (Invitrogen) ตามที่อธิบาย devold ตอัล (2000) sav การควบคุมจากภายนอก (ใสกรองหมัน) ถูกบันทึกอยู่ในตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ปริมาณ 7.0 ไมโครลิตรต่อตัวอย่าง isav7 และ nsp1 การตรวจที่ใช้สำหรับเรียลไทม์วิเคราะห์ RT-PCR
2.4.6 ฟื้นฟูข้อมูล
ก่อนที่จะเรียลไทม์วิเคราะห์ RT-PCR ทดสอบ isav7 ถูกปรับให้เหมาะสมโดยคำนึงถึงความเข้มข้นของไพรเมอร์และสอบสวนด้วย การทดสอบที่มีประสิทธิภาพได้รับการดำเนินการในการทดสอบทดสอบ isav7 การทดสอบการเพิ่มประสิทธิภาพและประสิทธิผลในการทดสอบ nsp1 ทำตามที่อธิบายเซนตอัล (2010) การทดสอบนี้ได้รับการดำเนินการโดยใช้ชุดการเจือจางห้าเท่าไวรัส ISAแม่แบบที่ใช้ในการทดสอบที่มีประสิทธิภาพได้รับการเพาะเลี้ยงไวรัส ISA ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น กะรัตมูลค่าเฉลี่ยสำหรับแต่ละเพิ่มขึ้นสามเท่าที่คำนวณได้และกราฟมาตรฐานที่ถูกสร้างขึ้นโดยการวางแผนค่ากะรัตใน triplicates กับเจือจางอนุกรมลอการิทึม ขยายประสิทธิภาพ (จ) สำหรับ isav7 และ nsp1 ตรวจที่คำนวณโดยใช้สูตร (ปัจจัยการเจือจาง (-1/-slope)) -1isav7 และ nsp1 การตรวจมีความลาดเอียงของ -2.4172 และ -3.6652 ตามลำดับ ค่าการถดถอย (r2) ของการตรวจที่แตกต่างกันได้กับ 0.9989 และ 0.9975 isav7 เพื่อ nsp1 ประสิทธิภาพ (จ) ของ isav7 และ nsp1 ตรวจเป็นอี = 0.9461 และ e = 0.8743 ตามลำดับปริมาณญาติ (ฟื้นฟู) ของอาร์เอ็นเอไวรัสจากไวรัส ISA ในตัวอย่างน้ำได้รับการดำเนินการโดยใช้ไมโครซอฟท์เอ็กเซลซอฟแวร์คอมพิวเตอร์ q-ยีน (มุลเลอร์และคณะ. 2002) กะรัตค่าจากการวิเคราะห์ isav7 ได้ปกติกับกะรัตค่าจากการวิเคราะห์ nsp1 (การควบคุมจากภายนอก)ผลที่ได้จากการแสดงออกปกติ (ne) ค่าถูกเปลี่ยนเป็นเพิ่มขึ้นเท่าตัวด้วยการกำหนดต่ำสุด ne มูลค่าได้รับในระหว่างการทดลองของทุกตัวอย่างน้ำเป็นดังนี้ 1 ข้อมูลถูกแล้ว log2 เปลี่ยนและนำเข้ามาใน GraphPad ปริซึม 6.02 หน้าต่างซอฟต์แวร์ (GraphPad ซอฟแวร์, inc.).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4.5. อาร์เอ็นเอสกัดและ RT-PCR แบบเรียลไทม์ของเนื้อเยื่อปลา
อาร์เอ็นเอที่สกัดจากเนื้อเยื่อหัวใจใช้ Trizol รีเอเจนต์ (Invitrogen) ตามที่อธิบายไว้โดย Devold et al. (2000) ควบคุมบ่อย SAV (supernatant กรองฆ่าเชื้อ) ถูกเพิ่มเข้าไปตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ปริมาตรของ µL 7.0 ต่อตัวอย่าง Assays ISAV7 และ nsP1 ใช้สำหรับวิเคราะห์ RT-PCR แบบเรียลไทม์
2.4.6 Normalisation ข้อมูล
ก่อนเวลาจริง RT-PCR วิเคราะห์การวิเคราะห์ ISAV7 ถูกทำให้เหมาะกับความเข้มข้นของไพรเมอร์และโพรบ ทำการทดสอบประสิทธิภาพเพื่อทดสอบวิเคราะห์ ISAV7 NsP1 วิเคราะห์ทดสอบเพิ่มประสิทธิภาพและประสิทธิผลได้กระทำตามที่อธิบายไว้โดยแอนเดอร์ et al. (2010) การทดสอบนี้ทำ โดยใช้ชุดการเจือจาง fivefold ไวรัส ISA แม่แบบที่ใช้ในการทดสอบประสิทธิภาพเป็นอ่าง ISA ไวรัส ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น คำนวณค่าเฉลี่ยค่า Ct สำหรับ triplicate แต่ละ และทำเส้นโค้งมาตรฐาน โดยการพล็อตค่า Ct ใน triplicates กับ dilutions ลอการิทึมประจำ มีคำนวณโดยใช้สูตรขยายประสิทธิภาพ (E) สำหรับ assays ISAV7 และ nsP1: (เจือจางคูณ (-1 / -ลาด)) -1 Assays ISAV7 และ nsP1 มีความลาดชันของ-2.4172 และ-3.6652 ตามลำดับ ค่าถดถอย (R2) ของ assays ต่าง ๆ ถูก 0.9989 สำหรับ ISAV7 และ 0.9975 สำหรับ nsP1 มีประสิทธิภาพ (E) ของ assays ISAV7 และ nsP1 E = 0.9461 และ E = 0.8743 ตามลำดับ นับญาติ (normalisation) ของอาร์เอ็นเอไวรัสจาก ISA ไวรัสในตัวอย่างน้ำที่ดำเนินการโดยใช้ Microsoft-excel ใช้คอมพิวเตอร์ซอฟต์แวร์ Q-ยีน (มูลเลอร์และ al., 2002) ค่า ct จากทดสอบ ISAV7 ได้ตามปกติกับค่า Ct จากทดสอบ nsP1 (ควบคุมบ่อย) ผลลัพธ์ของนิพจน์ normalised (NE) ค่าถูกเปลี่ยนเป็นพับเพิ่ม โดยกำหนด NE-ค่าต่ำสุดได้ในระหว่างการทดลองของตัวอย่างน้ำทั้งหมดเป็นข้อมูลได้จาก นั้น Log2 แปลง และเข้า GraphPad ปริซึม 6.02 Windows ซอฟต์แวร์ (ซอฟต์แวร์ GraphPad, Inc.) 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4.5 . rna การขุดเจาะและแบบ real - time Rt - pcr เนื้อเยื่อของปลา
rna ได้ถูกแยกออกมาจากเนื้อเยื่อบริเวณใจกลางเมืองโดยใช้ trizol ซัดยา( invitrogen )ตาม devold et al . ( 2000 ) การควบคุม exogenous sav ( supernatant ฆ่าเชื้อขวดนมที่กรองแล้ว)ที่ถูกเพิ่มในตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ระดับเสียงของ 7.0 μ L ต่อตัวอย่าง assays isav NSP 7 และ 1 ที่ถูกนำไปใช้เพื่อการวิเคราะห์ Rt - pcr แบบเรียลไทม์
2.4.6 . normalisation
ตามมาตรฐานของข้อมูลก่อนถึงการวิเคราะห์ Rt - pcr แบบ real - time 7 สอบ isav ที่เป็นการปรับแต่งด้วยการพิจารณาถึงความเข้มข้นของการสอบสวนและ primers การทดสอบ ประสิทธิภาพ การทำงานที่ได้ดำเนินการในการทดสอบ 7 สอบ isav ได้ การทดสอบ ประสิทธิภาพ และการปรับแต่งสำหรับ NSP 1 สอบได้ทำตามที่อธิบายไว้ในแอนเดอร์เซ่น et al . ( 2010 ) การทดสอบนี้ได้ดำเนินการโดยการใช้เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับเจือจาง Series สำหรับไวรัส, ISA ,เทมเพลตใช้ในการทดสอบ ประสิทธิภาพ เป็นไวรัส, ISA ,วัฒนธรรมเช่นที่อธิบายไว้ข้างต้น หมายความว่า CT - ค่าสำหรับเป็นสามแต่ละรายจะคำนวณและปรับตามความโค้งมนของรูปหน้าแบบมาตรฐานที่ได้ถูกสร้างขึ้นโดยการวางแนวคิด CT - ค่าใน triplicates กับ dilutions logarithmic Serial การขยาย ประสิทธิภาพ ( E )สำหรับ assays isav NSP 7 และ 1 ที่จะคำนวณโดยใช้สูตร(ปัจจัยเจือจาง( - 1 / - ลาด)) 1isav 7 และ 1 assays NSP มีความลาดชันของ -2.4172 และ -3.6652 ตามลำดับ ( Log ( R 2 )ของ assays ที่แตกต่างกันไปเป็น 0.9989 สำหรับ isav 7 และ 0.9975 สำหรับ NSP 1 ประสิทธิภาพ ( E )ของ isav 7 และ NSP 1 assays เป็น E = 0.9461 และ E = 0.8743 ตามลำดับญาติจึงจำเป็นต้องมี( normalisation )ของ rna ร่องรอยของไวรัสจากไวรัส, ISA ,ในตัวอย่างน้ำที่ได้ดำเนินการโดยใช้ Microsoft - Excel ,ซอฟต์แวร์ใช้งานบนคอมพิวเตอร์เครื่อง Q - ยีน( Muller et al . 2002 ) CT - ค่าจาก 7 สอบ isav ได้ปรับให้สอดคล้องกับ CT - ค่าที่ได้จาก NSP ที่ 1 สอบ(ควบคุม exogenous )ผลของการแสดงออกถึงความเป็นปกติ(ไมล์ด้านทิศตะวันออกเฉียงเหนือ)ได้ถูกเปลี่ยนไปสู่ท่าก้มตัวเพิ่มขึ้นโดยการกำหนดให้ต่ำสุดทางด้านทิศตะวันออกเฉียงเหนือด้วยความคุ้มค่าได้รับในระหว่างการทดลองของทั้งหมดที่น้ำตัวอย่างที่ 1 .ให้ข้อมูลได้ล็อกอินเข้าสู่ 2 ปรับเปลี่ยนและนำเข้าสู่ที่ graphpad ปริซึม 6.02 นิ้วซอฟท์แวร์ Windows ( graphpad ซอฟท์แวร์, Inc .)