High quality DNA was isolated using

High quality DNA was isolated using a GenEluteTM Bacterial Genomic DNA Extraction Kit according to the manual procedures (Sigma-Aldrich, USA). PCR amplification was performed in a 25 μL reaction using thermostable DyNAzymeTM EXT DNA polymerase (Finnizymes, Finland) in a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, USA). The reaction mixture consisted of 1 × PCR buffer; 2.0 mM of MgCl2, 0.2 mM of dNTPs, 2 μM of forward and reverse primers, 100 ng of bacterial genomic DNA as template and 2.5 U of the enzyme mix. The 16S rRNA gene was amplified with the universal F8 (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3′) and rP2 (5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) primer pair [18]. Amplification reaction was carried out with the following cycling conditions: primary denaturation for 3 min at 95 °C, followed by 30 cycles of 30 s at 94 °C, 1 min at 55 °C and 2 min of 72 °C, and a final extension of 10 min at 72 °C. The PCR product was run through a 1% agarose gel and purified using QIA Quick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, U.S.). The TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen, U.S.) was used for cloning of the PCR product following the manufacturer’s protocol. Minipreparation of plasmid DNA was carried out using the QIAprep Spin miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA, U.S.), followed by restriction endonuclease analysis to identify the clones for sequencing. DNA sequencing was performed using an ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit and ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer, Foster City, CA) following the manufacturer’s instructions. The 16S rRNA gene sequences were aligned using ClustalW and analyzed by neighbor-joining (NJ) using the MEGA 4 program [19].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คุณภาพดีเอ็นเอที่แยกโดยใช้ GenEluteTM แบคทีเรีย Genomic DNA แยกชุดตามขั้นตอนด้วยตนเอง (Aldrich ซิก สหรัฐอเมริกา) ทำ PCR ขยายในปฏิกิริยา μL 25 ที่ใช้ thermostable DyNAzymeTM ต่อดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Finnizymes ฟินแลนด์) เป็น PTC 200 ร้อน cycler (วิจัย MJ สหรัฐอเมริกา) ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 1 การ PCR บัฟเฟอร์ 2.0 มม.ของ MgCl2, 0.2 mM ของ dNTPs, μM 2 ของไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ 100 ng เอ็น genomic แบคทีเรียเป็นต้นแบบและ 2.5 U ของผสมเอนไซม์ 16S rRNA ยีนถูกขยาย ด้วย F8 สากล (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3′) และ rP2 คู่รองพื้น (5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) [18] ปฏิกิริยาขยายถูกดำเนินการ ด้วยสภาพขี่จักรยาน: denaturation หลักใน 3 นาทีที่ 95 ° C ตามรอบ 30 30 s ที่ 94 ° C, 55 ° C และต่ำ สุด 2 72 องศาเซลเซียส 1 นาที และส่วนขยายสุดท้าย 10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกเรียกใช้ผ่านเจ 1% agarose และบริสุทธิ์ที่ใช้ QIA ด่วนเจแยกชุด (Qiagen, Valencia, CA สหรัฐอเมริกา) เดินโคลน TA ®ชุด (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้สำหรับของผลิตภัณฑ์ PCR ต่อของโพรโทคอล Minipreparation ของ plasmid DNA ถูกดำเนินใช้ชุด miniprep ของ QIAprep หมุน (Qiagen, Valencia, CA สหรัฐอเมริกา), ตาม ด้วย endonuclease จำกัดวิเคราะห์ระบุโคลนสำหรับลำดับงาน ลำดับดีเอ็นเอที่ดำเนินการใช้เป็นชุด ABI ปริซึมย้อมเทอร์มิเนเตอร์วงจรลำดับพร้อมปฏิกิริยาและ 3100 ปริซึม ABI พันธุกรรมวิเคราะห์ (เพอร์เอลเมอ ฟอสเตอร์ City, CA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต 16S rRNA ยีนลำดับถูกจัดโดยใช้ ClustalW และวิเคราะห์โดยเพื่อนบ้านรวม (NJ) ใช้โปรแกรม 4 ร็อค [19]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพสูงที่แยกได้โดยใช้ชุด GenEluteTM แบคทีเรียจีโนมการสกัดดีเอ็นเอตามขั้นตอนคู่มือ (Sigma-Aldrich สหรัฐอเมริกา) PCR ขยายได้รับการดำเนินการในการทำปฏิกิริยา 25 ไมโครลิตรโดยใช้อุณหภูมิ DyNAzymeTM EXT ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Finnizymes, ฟินแลนด์) ใน Cycler ความร้อน PTC-200 (MJ วิจัยสหรัฐอเมริกา) ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 1 ×บัฟเฟอร์ PCR; 2.0 มิลลิเมตร MgCl2, 0.2 มิลลิเมตร dNTPs 2 ไมครอนของไปข้างหน้าและย้อนกลับไพร 100 ng ของดีเอ็นเอของแบคทีเรียเป็นแม่แบบและ 2.5 U ผสมเอนไซม์ ยีน 16S rRNA ถูกขยายด้วย F8 สากล (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3) และ rp2 (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ') รองพื้นคู่ [18] ปฏิกิริยาขยายได้รับการดำเนินการโดยมีเงื่อนไขการขี่จักรยานต่อไปนี้: denaturation หลักสำหรับ 3 นาทีที่ 95 ° C ตามด้วย 30 รอบ 30 วินาทีที่ 94 ° C, 1 นาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและ 2 นาที 72 ° C, และครั้งสุดท้าย การขยายเวลา 10 นาทีที่ 72 ° C ผลิตภัณฑ์ PCR ที่กำลังวิ่งผ่านเจล agarose 1% และบริสุทธิ์ใช้ QIA เร็วเจลสกัด Kit (Qiagen, วาเลนเซีย, CA, US) TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้สำหรับการโคลนนิ่งของผลิตภัณฑ์ PCR ต่อไปนี้โปรโตคอลของผู้ผลิต Minipreparation ของพลาสมิดดีเอ็นเอถูกนำออกมาใช้ปั่น miniprep ชุด QIAprep (Qiagen, วาเลนเซีย, CA, US) ตามด้วยการวิเคราะห์ endonuclease ที่ จำกัด ในการระบุสายพันธุ์สำหรับการเรียงลำดับ ลำดับดีเอ็นเอได้รับการดำเนินการโดยใช้ชุดปฏิกิริยา ABI ปริซึมย้อม Terminator วงจรลำดับพร้อมและ ABI PRISM 3100 ทางพันธุกรรม Analyzer (เพอร์กินเอลเมอ, ฟอสเตอร์ซิตี้, CA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต 16S rRNA ลำดับยีนถูกจัดชิดโดยใช้ ClustalW และวิเคราะห์โดยเพื่อนบ้านเข้า (NJ) โดยใช้โปรแกรม MEGA 4 [19]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพสูงที่แยกใช้ genelutetm การสกัดดีเอ็นเอจากชุดตามขั้นตอนคู่มือ ( ซิกม่า Aldrich , USA ) PCR ( แสดงใน 25 μ L ใช้ในปฏิกิริยา dynazymetm ext DNA polymerase ( finnizymes , ฟินแลนด์ ) ใน ptc-200 Thermal cycler ( USA ) , MJ ) ปฏิกิริยาผสมประกอบด้วยบัฟเฟอร์ PCR 1 × ; 2.0 มม. ชุด dntps 0.2 มม. ,2 μ M ไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์ 100 นาโนดีเอ็นเอแบคทีเรียเป็นแม่แบบและ 2.5 U ของเอนไซม์ผสม ส่วนเบส 16S rRNA ยีนที่ถูกขยายด้วย F8 สากล ( 5 ’ - agagtttgatcmtggctc-3 School ) และ rp2 ( 5 ’ - ’คู่ไพรเมอร์ acggctaccttgttacgactt-3 ) [ 18 ] ปฏิกิริยาการเพิ่มข้อมูลต่อไปนี้ด้วยจักรยานเงื่อนไขหลัก ( สำหรับ 3 นาทีที่ 95 องศา Cตามด้วย 30 รอบ 30 s ที่ 94 ° C , 1 นาทีที่ 55 องศา C และ 2 นาที 72 ° C และสุดท้ายขยาย 10 นาทีที่ 72 ° C ) วิ่งผ่านผลิตภัณฑ์เจล ( 1 ) เจลสกัดบริสุทธิ์ใช้มั่นอย่างรวดเร็ว Kit ( QIAGEN , Valencia , CA , สหรัฐอเมริกา ) ที่สถานที่ทาโคลน® Kit ( Invitrogen , สหรัฐอเมริกา ) ใช้สำหรับการทำผลิตภัณฑ์ PCR ตามขั้นตอนของผู้ผลิตminipreparation ของพลาสมิดดีเอ็นเอถูกนำออกมาใช้ qiaprep ปั่น miniprep Kit ( QIAGEN , Valencia , CA , สหรัฐอเมริกา ) , ตามด้วยการวิเคราะห์เอนโดนิวคลีเอสจำกัดระบุสายพันธุ์สำหรับการติดตาม . การจัดลำดับดีเอ็นเอการใช้อบิปริซึมย้อม Terminator รอบลำดับชุดปฏิกิริยาพร้อมและ ABI ปริซึม 3100 พันธุกรรมวิเคราะห์ ( เพอร์กินเอลเมอร์ ฟอสเตอร์ ซิตี้แคลิฟอร์เนีย ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การลำดับเบส 16S rRNA ยีนชิด และวิเคราะห์ข้อมูลโดย ใช้ clustalw เพื่อนบ้านร่วม ( NJ ) โดยใช้โปรแกรมเด่น 4 [ 19 ]