2.2. Multiple-sitelibrariesThe prev

2.2. Multiple-sitelibraries
The previous methods can be used to modify a single codon
and possibly two proxima lcodons per primer.In many cases,
however, it is desired to substitute several amino acids in distant
positions,requiring specialized mutagenesis techniques.A method
for multiple site mutagenesis was developed using a modified
version of OE-PCR(An etal.,2005). This method,referred to as
MOE-PCR,produces amplicons using forward and reverse mutagenic
primers containing complementary regions varying from 15to27
bases.After the first PCR reaction the resulting amplicons are
isolated and purified through agarose gel electrophoresis. Equimolar
amounts of two adjacent amplicons are then mixed and subjected to
15 cycles of PCR amplification.The reactions are combined for
additional 20 cycles and flanking primers are added in the final
10 cycles(Fig.2A).A modification of this method named
polyacrylamide gel electrophoresis overlap extension PCR(POEP) facilitates
the workflow(Pengetal.,2006).In POEP mutagenized amplicons
containing overlapping ends are produced as previously described.
The resulting fragments are then purified through polyacrylamide
gel electrophoresis which has superior resolving ability overa garose
allowing complete separation from the template.All fragments are
then assembled in a second PCR reaction using a high-fidelity
polymerase and flanking primers(Fig. 2B). Both MOE-PCR and POEP
can introduce mutations in at least six different regions of a DNA
fragment but the latter appears to be advantageous for SSM for its
superior mutagenesis efficiency.Another method for conducting
mutagenesis in more than 10 sites utilizes primer extension
technique. The method is performed by annealing two flanking
primers containing unique 25-nucleotide tails and three fold molar
excess of phosphorylated mutagenic primers to the target DNA
(SeyfangandJin,2004). Synthesis is conducted through primer
extension using T4-DNA polymerase and ligase,generating a single-
stranded mutagenic sequence that is used as a template for a PCR
reaction using the unique 25 nucleotide tails as anchors(Fig. 2C).
The method named ‘Incorporating Synthetic Nucleotides via Gene
Reassembly(ISOR)’ utilizes a biotililated PCR product as a template
(Herman andTawfik,2007). The PCR product is fragmented with
DNAseI and the fragments are mixed with mutagenic nucleotides.
The coding region is re-assembled through self-primer extension.
Assembled genes can be captured with streptavidin-coated
magnetic beads,but this step might not be required if the library
diversity is less than 106 mutants. The final mutagenized coding
region is then amplified using nested PCR(Fig.2C).An important
aspect of this method is that it can target a great number of codons
simultaneously and create libraries with varying degrees of
mutations in different positions.Recently,an enhanced method named
Omnichange was developed for simultaneous site-saturation
mutagenesis of 5 codons (Dennigetal.,2011).In this method
mutagenized amplicons containing12-nucleotide overlapping ends are
produced as described before.The overlapping regions in the 50
tails of the primers have phosphorothioate nucleotide bonds and
the resulting double stranded-DNA can be cleaved with iodine
treatment,generating50 overhangs(Blanusaetal.,2010). The
fragments are assembled via hybridization reconstituting nicked
plasmids that are directly transformed in E. coli (Fig.3). This
method is fast,cost-effective and does not require intricate
enzymatic steps for DNA modification,representing a good choice for
multiple-site mutagenesis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. sitelibraries หลาย
วิธีการก่อนหน้านี้สามารถใช้เพื่อปรับเปลี่ยนรหัสพันธุกรรมเดียว
และอาจสอง proxima lcodons ต่อรองพื้นได้ในหลายกรณี,
อย่างไรก็ตาม มันจะต้องทดแทนกรดอะมิโนต่าง ๆ ในที่ไกล
ตำแหน่ง mutagenesis เฉพาะเทคนิคที่ต้องการวิธี
หลายไซต์ mutagenesis ถูกพัฒนาโดยใช้การแก้ไข
รุ่น OE-PCR(An etal.,2005) วิธีการนี้ เรียกว่า
หมอ-PCR ผลิต amplicons ใช้ไปข้างหน้าและย้อนกลับ mutagenic
ไพรเมอร์ที่ประกอบด้วยภาคเสริมที่แตกต่างจาก 15to27
ฐานหลังจากปฏิกิริยา PCR แรก จะ amplicons ได้
แยกต่างหาก และบริสุทธิ์ผ่าน agarose electrophoresis เจ Equimolar
amplicons ติดกันสองจำนวนแล้วผสม และต้อง
15 รอบของ PCR ขยายปฏิกิริยาการรวมสำหรับ
เพิ่มเติม 20 รอบและไพรเมอร์ flanking ในสุดท้าย
10 cycles(Fig.2A)การปรับเปลี่ยนวิธีการนี้ชื่อ
ขยายซ้อน electrophoresis polyacrylamide เจ PCR(POEP) ช่วย
workflow(Pengetal.,2006)ใน POEP mutagenized amplicons
ผลิตปลายเหลื่อมมีอธิบายไว้ว่า ก่อนหน้านี้
บางส่วนของผลที่ได้จะบริสุทธิ์ที่ผ่าน polyacrylamide แล้ว
เจ electrophoresis ซึ่งมีเหนือกว่าแก้ไขความ overa garose
ให้สมบูรณ์แยกจากแม่ชิ้นส่วนทั้งหมด
แล้ว ประกอบในปฏิกิริยา PCR ที่สองที่ใช้คุณภาพสูง
พอลิเมอเรสและ flanking ไพรเมอร์ (Fig. 2B) หมอ-PCR และ POEP
สามารถกลายพันธุ์ในภูมิภาคหกน้อยของดีเอ็นเอแนะนำ
ส่วนแต่หลังดูเหมือนจะ เป็นประโยชน์สำหรับ SSM สำหรับของ
ห้องซูพีเรีย mutagenesis ประสิทธิภาพการอีกวิธีสำหรับการทำ
mutagenesis ในอเมริกามากกว่า 10 ใช้ส่วนขยายพื้น
เทคนิค วิธีการดำเนินการ โดยการอบเหนียว flanking สอง
ไพรเมอร์ที่ประกอบด้วยเฉพาะนิวคลีโอไทด์ 25 หางและสามพับสบ
ส่วนเกินของไพรเมอร์ mutagenic phosphorylated เป้าหมาย DNA
(SeyfangandJin,2004) ดำเนินการสังเคราะห์ผ่านพื้น
ส่วนขยายที่ใช้ T4-ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสและ ligase สร้างแบบเดี่ยว-
ควั่น mutagenic ลำดับที่ใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR เป็น
ปฏิกิริยาใช้หาง 25 นิวคลีโอไทด์ที่ไม่ซ้ำกันเป็น anchors(Fig. 2C)
ชื่อ 'เพจสังเคราะห์นิวคลีโอไทด์ผ่าน Gene
Reassembly(ISOR)' วิธีใช้ผลิตภัณฑ์ PCR biotililated เป็นแม่
(Herman andTawfik, 2007) ผลิตภัณฑ์ PCR คือการแยกส่วนกับ
DNAseI และชิ้นส่วนผสมกับนิวคลีโอไทด์ mutagenic.
ภูมิภาครหัสจะบริโภคโดยใช้นามสกุลตนเองรองพื้นได้
Assembled ยีนที่สามารถจับกับเคลือบ streptavidin
เม็ดแม่เหล็ก แต่ขั้นตอนนี้อาจไม่จำเป็นถ้ารี
หลากหลายไม่น้อยกว่า 106 สายพันธุ์ได้ สุดท้าย mutagenized รหัส
แล้วขยายภูมิภาคใช้ PCR(Fig.2C) ซ้อนกันสำคัญ
ของวิธีนี้คือ มันสามารถระบุหมายเลขดีของ codons
กัน และสร้างไลบรารีที่ มีแตกต่างกัน
กลายพันธุ์ในตำแหน่งที่ต่างกันล่าสุด เพิ่มวิธีการชื่อ
Omnichange ได้รับการพัฒนาสำหรับไซต์เข้มพร้อม
mutagenesis codons 5 (Dennigetal. 2011)ในวิธีนี้
จะสิ้นสุดทับซ้อนกันของนิวคลีโอไทด์ containing12 mutagenized amplicons
ผลิตตามที่อธิบายไว้ก่อนพื้นที่ทับซ้อนกันใน 50
ของไพรเมอร์ที่มี phosphorothioate นิวคลีโอไทด์พันธบัตร และ
สามารถแหวกผลคู่ควั่น-DNA กับไอโอดีน
รักษา generating50 overhangs(Blanusaetal.,2010) ใน
เป็นประกอบชิ้นส่วนผ่าน hybridization reconstituting nicked
plasmids ที่อยู่โดยตรงใน E. coli (Fig.3) นี้
วิธีได้อย่างรวดเร็วคุ้มค่า และไม่ต้องซับซ้อน
เอนไซม์ในระบบขั้นตอนสำหรับการปรับเปลี่ยนดีเอ็นเอ การแสดงทางเลือกที่ดีสำหรับ
mutagenesis หลายไซต์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 . หลายคน - sitelibraries
ซึ่งจะช่วยได้ก่อนหน้าสามารถใช้วิธีการในการแก้ไขที่เดียว codon
และอาจเป็นไปได้ทั้งสอง proxima lcodons ต่อเชื้อปะทุในหลายกรณี,
แต่เป็นที่ต้องการในการเปลี่ยนหลายกรดอะมิโนกรด
ซึ่งจะช่วยอยู่ไกลออกไปในตำแหน่ง,ต้องมีความเชี่ยวชาญด้านเทคนิคผลผลิต.วิธี
ซึ่งจะช่วยให้ผลผลิตหลายไซต์ได้รับการพัฒนาขึ้นโดยใช้ที่แก้ไขได้
เวอร์ชันของมโอ - - pcr (ที่ etal . , 2005 ) วิธีนี้จะเรียกว่า
ตามมาตรฐานMoe - pcr ,ผลิต amplicons โดยใช้ส่งต่อและย้อนกลับ mutagenic
primers ประกอบด้วย อภิ นันทนาการที่หลากหลายพื้นที่จาก 15 เป็น 27
ฐานหลังจากที่ครั้งแรก pcr ปฏิกริยาที่ส่งผลให้ amplicons มี
แยกบริสุทธิ์และผ่าน agarose เจล electrophoresis . จำนวน equimolar
ของสอง amplicons อยู่ติดกันจะรวมตัวกันและต้องตกอยู่ใน
15 รอบการขยายสัญญาณเสียง pcr จากนั้นจึงได้เกิดปฏิกิริยาที่จะรวมกันสำหรับ
เพิ่มเติม 20 รอบและขนาบข้าง primers จะถูกเพิ่มลงในครั้งสุดท้าย
ซึ่งจะช่วย 10 รอบ(รูปที่ 2 )ของการแก้ไขที่ใช้วิธีนี้ชื่อ
polyacrylamide เจล electrophoresis ซ้อนกันต่อ pcr ( poep )
ซึ่งจะช่วยเพิ่มความสะดวกในขั้นตอน( pengetal ., 2006 )ใน poep mutagenized amplicons
มีทับซ้อนกันจะสิ้นสุดลงได้รับการผลิตที่อธิบายไว้.
ส่งผลให้ได้เรียนรู้จะบริสุทธิ์ผ่าน polyacrylamide
เจล electrophoresis ซึ่งได้มีการแก้ไขความสามารถในระดับ superior first class overa garose
ซึ่งจะช่วยทำให้เสร็จสมบูรณ์การแยกจากที่มีเทมเพลต.ทั้งหมดเศษมี
ซึ่งจะช่วยเข้ามาประกอบในที่ที่สอง pcr ปฏิกิริยาโดยใช้ High - Fidelity
polymerase และขนาบข้าง primers (รูปที่ 2 B ) Moe - pcr และ poep
ทั้งสองสามารถที่จะเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสในอย่างน้อย 6 เขตพื้นที่ที่แตกต่างกันของดีเอ็นเอ
สักเท่าไหร่แต่หลังจะปรากฏขึ้นเพื่อเป็นประโยชน์สำหรับ SSM สำหรับ
ประสิทธิภาพ การทำงานระดับ Superior First Class ผลผลิต.วิธีอื่นสำหรับการผลผลิต
ซึ่งจะช่วยในมากกว่า 10 สถานที่จะใช้เชื้อปะทุต่อ
เทคนิค วิธีการที่จะดำเนินการโดย annealing สองขนาบข้าง
primers ประกอบด้วยที่โดดเด่น 25 - nucleotide หางและสามเท่ากรามที่ใช้เคี้ยว
ส่วนเกินของ phosphorylated mutagenic primers ให้บรรลุเป้าหมายดีเอ็นเอ
( seyfangandjin, รุ่น HR 2004 ) การสังเคราะห์การดำเนินการผ่านเชื้อปะทุ
ตามมาตรฐานการขยายเวลาการใช้ ligase และ polymerase T 4 - ดีเอ็นเอการสร้างลำดับ mutagenic แบบ Single -
สายตีเกลียวที่ใช้เป็นเทมเพลตสำหรับปฏิกิริยา pcr
ซึ่งจะช่วยให้การใช้หางที่โดดเด่น 25 nucleotide ที่เป็นตัวยึด(รูปที่ วิธีการ 2 C ). n ที่มีชื่อว่า"ประกอบด้วยเส้นใยสังเคราะห์กว้างขวางผ่านทางยีน
:( isor )"ใช้ ผลิตภัณฑ์ pcr biotililated ที่เป็นเทมเพลต
( Herman andtawfik, 2007 ) ผลิตภัณฑ์ pcr คือต้องแยกย่อยด้วย
ตามมาตรฐานdnasei และเศษเสี้ยวที่เป็นการผสมผสานด้วยกว้างขวาง mutagenic .
เขตพื้นที่การเข้ารหัสที่มีการชุมนุมกันด้วยการเพิ่มขยายแบบบริการตัวเองเชื้อปะทุ.
ยีนสามารถจับประกอบด้วยลูกปัดแม่เหล็ก streptavidin - เคลือบ
แต่ขั้นตอนนี้อาจไม่จำเป็นต้องหากไลบรารี
ความหลากหลายที่มีไม่น้อยกว่า 106 ข้าวเจ้า mutagenized ครั้งสุดท้ายที่เข้ารหัส
เขตพื้นที่มีแอมพลิฟายโดยใช้ซ้อน pcr (รูปที่ 2 C )ที่สำคัญแล้ว
ลักษณะของวิธีนี้คือการที่จะสามารถกำหนดเป้าหมายที่จำนวนมากของ codons
พร้อมกันและสร้างไลบรารีพร้อมด้วยระดับของ
เข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสในตำแหน่ง.เมื่อไม่นานมานี้,หรือที่เรียกว่า Enhanced วิธีการตั้งชื่อ
omnichange ได้รับการพัฒนาขึ้นมาสำหรับในเวลาเดียวกันเว็บไซต์ - ความอิ่มตัวของ
ผลผลิตของ 5 codons ( dennigetal ., 2011 )ในวิธีนี้
mutagenized amplicons ประกอบด้วย 12 - nucleotide ทับซ้อนกันปลายมี
ผลิตตามที่ได้อธิบายไว้ก่อน.เขตพื้นที่ทับซ้อนกันใน 50
หางของ primers ที่มีพันธบัตร nucleotide phosphorothioate และ
ซึ่งจะช่วยส่งผลให้ดับเบิลคลิกสายตีเกลียว - ดีเอ็นเอจะสามารถติดกับไอโอดีน
ซึ่งจะช่วยรักษาการสร้างยานยนต์ 50 ( blanusaetal. 2010 )
เศษได้ประกอบโดยผ่านทาง reconstituting hybridization แหว่ง
plasmids ที่ได้รับการปรับเปลี่ยนรูปแบบเพื่อให้ในผล(รูปที่ 3 )โดยตรง
วิธีนี้ได้อย่างรวดเร็วใช้งานได้อย่างคุ้มค่าและไม่จำเป็นต้องมีขั้นตอน
enzymatic ประณีตบรรจงสำหรับการปรับเปลี่ยนดีเอ็นเอเป็นทางเลือกที่ดีสำหรับ
แบบหลายไซต์ผลผลิต.