ven though effective anti-retroviral drugs are currently available against HIV-1 [1] , developing a vaccine still remains a major priority for slowing down the progression of HIV-1 incidences worldwide. Unfortunately, this has been a daunting task given the capacity of HIV-1 to maintain latency and mutate rapidly allowing it to evade the immune system [2] . Furthermore, many of the past HIV-1 vaccines that have elicited protective outcomes in animals have failed to do so in humans [3-8] .
The induction of high avidity anti-viral CD8+ T cells responses is thought to be critical for effective protective immunity against viruses including HIV-1 [9,10] . Various molecules that facilitate cell adhesion (e.g. CD2 and CD11a), cognate peptide-major histocompatibility class I complexes (pMHC-I) recognition (i.e. densities of CD8 and T cell receptor (TCR) interaction) and intracellular signalling such as lck have been known to regulate T cell avidity [11-14] . High avidity anti-viral CD8+ T cells can recognize and respond to lower densities of cognate pMHC-I on virus-infected cells compared to low avidity anti-viral CD8+ T cells [15] . This allows high avidity HIV-specific CD8+ T cells to minimize or prevent the spread of this virus from early exposed genito-rectal mucosae to the gut where the greatest CD4+ T cell depletion occur during HIV-1 infection [2,10] . High avidity anti-viral CD8+ T cells are also polyfunctional (i.e. produce multiple anti-viral/survival cytokines such as IFN-γ, TNF-[alpha] and IL-2) [16,17] . Numerous studies have demonstrated that elite controllers of HIV-1 infection maintain more high avidity and polyfunctional CD8+ T cells than non-controllers [18-20] . Therefore, development of vaccines that can induce high avidity HIV-specific CD8+ T cells could be extremely beneficial for optimizing protective outcomes against HIV-1.
Despite the knowledge that high avidity anti-viral CD8+ T cells are important for efficient virus control, the mechanisms responsible for enhancing the avidity of anti-viral CD8+ T cells following vaccination is not well understood. Previous studies have shown that IL-4 and IL-13 can modulate anti-viral efficacy of CD8+ T cells and control of virus infection [21-24] . We have shown that HIV-specific CD8+ T cells that develop following mucosal (intranasal (i.n.)/i.n. or i.n./intramuscular (i.m.)) compared to purely systemic (i.m./i.m.) HIV-1 recombinant pox viral prime-boost vaccination have reduced expression of IL-4/IL-13, but are higher in avidity [25] . In subsequent studies, we have shown following pox viral infection and HIV-1 recombinant pox viral prime-boost vaccination that IL-4, IL-13 and STAT6 can dampen the avidity and polyfunctionality of anti-viral CD8+ T cells [26,27] . Based on this knowledge we have now developed a novel HIV-1 recombinant pox viral IL-13 receptor [alpha] 2 (IL-13R[alpha]2) adjuvanted vaccine that can be used to transiently inhibit IL-13 activity at the vaccination site [24] . This vaccine was shown to enhance the avidity/polyfunctionality of HIV-specific CD8+ T cells as well as the protective efficacy [24] . Given that pox virus vectors are commonly used in vaccination studies, here we have addressed how IL-4 and IL-13 can dampen the avidity of anti-viral CD8+ T cells following HIV-1 recombinant pox viral vaccination with the hope of developing more effective HIV-1 vaccines that translate into future phase I clinical trials.
Materials and methods
Mice
Pathogen-free 6-8 weeks old female WT, IL-4-/- , IL-13-/- , and STAT6-/- BALB/c mice were all purchased from the Australian Phenomics Facility, the Australian National University. All the mice were handled and maintained under the Australian National University Animal Experimentation and Ethics Committee approved guidelines and protocol number A2011/018.
Recombinant HIV-1 prime-boost vaccination and vaccinia virus infection
The recombinant fowlpox virus vectors encoding HIV-1 AE clade Gag, Pol and Env (FPV-HIV) and recombinant vaccinia virus encoding HIV-1 AE clade Gag and Pol (VV-HIV) used in the current study were exactly as those used previously in Ranasinghe et al. [28] . Recombinant FPV-HIV and VV-HIV co-expressing the murine soluble IL-13R[alpha]2 (IL-13 inhibitor vaccines) were constructed exactly as described in [24] .
Vaccinia virus Western Reserve (VV-WR) strain and infection with this virus was exactly as described in Wijesundara et al. [26] . Briefly, BALB/c mice were infected for 7 days intraperitoneally (i.p.) prior to isolation of splenocytes for flow cytometry analysis. For all recombinant HIV-1 prime-boost vaccinations except where indicated, pathogen free 6-8 weeks old BALB/c mice were primed i.n. with 1x10 7 PFU of FPV-HIV followed by i.m. booster vaccination with 1x107 PFU of VV-HIV 14 days apart as described in Ranasinghe et al. [28] . T cell responses were evaluated 14 days post booster vaccination.
Flow cytometry
Monoclonal antibodies against mouse antigens CD2 (clone RM2-5), CD11a (clone 2D7), TCRβ (clone H57-597), IFN-γ (clone XMG1.2), H-2Kd (clone SF1-1.1) and CD8β.2 (clone 53-5.8) were all purchased from BioLegend with the exception of CD8[alpha] (clone 53-6.7), lck (clone MOL 171) and TNF-[alpha] (clone MP6-XT22), which were purchased from Becton Dickinson (BD) Biosciences. These antibodies were used as purified (not conjugated) or conjugated with fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, peridinin chlorophyll protein, allophycocyanin or pacific blue. Peridinin chlorophyll protein conjugated monoclonal antibody against mouse IL-2 (clone JES6-5H4) was purchased from eBioscience. All cell surface and intracellular staining procedures with these antibodies were performed as described previously [26] . Stained samples were analyzed using the BD FACScalibur or BD LSR II prior to analysis using the FlowJo Tree Star software (version 8.8.7). For each sample 2,00,000-10,00,000 events were acquired.
เวนแม้ว่ายามีผลต้าน retroviral อยู่กับเอชไอวี-1 [1], พัฒนาวัคซีนยังคง มีความสำคัญสำคัญสำหรับการชะลอความก้าวหน้าของเอชไอวี-1 incidences ทั่วโลก อับ นี้ได้รับงานยุ่งยากให้กำลังการผลิตของเอชไอวี-1 เพื่อรักษาเวลาแฝง และผ่าเหล่าอย่างรวดเร็วให้การเลี่ยงระบบภูมิคุ้มกัน [2] นอกจากนี้ รู้เอชไอวี-1 ผ่านมาที่มี elicited ผลป้องกันสัตว์จำนวนมากมีเหลวในมนุษย์ [3-8]เหนี่ยวนำของ CD8 + T สูง avidity ป้องกันไวรัสเซลล์ตอบสนองเป็นความคิดที่สำคัญสำหรับภูมิคุ้มกันป้องกันผลจากไวรัสรวมทั้งเชื้อเอชไอวี-1 [9,10] โมเลกุลต่าง ๆ ที่ช่วยในการยึดเกาะของเซลล์ (เช่น CD2 และ CD11a), cognate หลักของเพปไทด์ histocompatibility คลาฉันคอมเพล็กซ์ (pMHC-ฉัน) การรับรู้ (เช่นความหนาแน่นของ CD8 และทีเซลล์ตัวรับ (TCR) โต้) และ intracellular แดงเช่น lck ทราบว่ามีเซลล์ T avidity [11-14] ควบคุม เซลล์ CD8 + T ป้องกันไวรัส avidity สูงสามารถรับรู้ และตอบสนองต่อความหนาแน่นต่ำของ cognate pMHC-I ในเซลล์ที่ไวรัสเปรียบเทียบกับเซลล์ CD8 + T ป้องกันไวรัส avidity ต่ำ [15] นี้ช่วยให้ avidity สูงเอชไอวีเฉพาะ CD8 + T เซลล์ลด หรือป้องกันการแพร่กระจายของไวรัสนี้จากต้น mucosae genito ไส้สัมผัสกับลำไส้ที่ลดลงของเซลล์ CD4 + T สูงสุดเกิดขึ้นระหว่างการติดเชื้อเอชไอวี-1 [2,10] เซลล์ CD8 + T ป้องกันไวรัส avidity สูงก็ polyfunctional (เช่นผลิต cytokines ป้องกัน-viral/รอด หลายเช่น IFN-γ TNF- [alpha] และ IL-2) [16,17] ศึกษาจำนวนมากได้แสดงว่า ตัวชนชั้นสูงของการติดเชื้อเอชไอวี-1 รักษา avidity สูงมากขึ้นและเซลล์ CD8 + T polyfunctional กว่าไม่ตัวควบคุม [18-20] ดังนั้น พัฒนาความรู้ที่สามารถก่อให้เกิดเซลล์ CD8 + T avidity สูงเฉพาะเชื้อเอชไอวี อาจเป็นประโยชน์มากในการเพิ่มประสิทธิภาพผลป้องกันกับเอชไอวี-1Despite the knowledge that high avidity anti-viral CD8+ T cells are important for efficient virus control, the mechanisms responsible for enhancing the avidity of anti-viral CD8+ T cells following vaccination is not well understood. Previous studies have shown that IL-4 and IL-13 can modulate anti-viral efficacy of CD8+ T cells and control of virus infection [21-24] . We have shown that HIV-specific CD8+ T cells that develop following mucosal (intranasal (i.n.)/i.n. or i.n./intramuscular (i.m.)) compared to purely systemic (i.m./i.m.) HIV-1 recombinant pox viral prime-boost vaccination have reduced expression of IL-4/IL-13, but are higher in avidity [25] . In subsequent studies, we have shown following pox viral infection and HIV-1 recombinant pox viral prime-boost vaccination that IL-4, IL-13 and STAT6 can dampen the avidity and polyfunctionality of anti-viral CD8+ T cells [26,27] . Based on this knowledge we have now developed a novel HIV-1 recombinant pox viral IL-13 receptor [alpha] 2 (IL-13R[alpha]2) adjuvanted vaccine that can be used to transiently inhibit IL-13 activity at the vaccination site [24] . This vaccine was shown to enhance the avidity/polyfunctionality of HIV-specific CD8+ T cells as well as the protective efficacy [24] . Given that pox virus vectors are commonly used in vaccination studies, here we have addressed how IL-4 and IL-13 can dampen the avidity of anti-viral CD8+ T cells following HIV-1 recombinant pox viral vaccination with the hope of developing more effective HIV-1 vaccines that translate into future phase I clinical trials.Materials and methodsMicePathogen-free 6-8 weeks old female WT, IL-4-/- , IL-13-/- , and STAT6-/- BALB/c mice were all purchased from the Australian Phenomics Facility, the Australian National University. All the mice were handled and maintained under the Australian National University Animal Experimentation and Ethics Committee approved guidelines and protocol number A2011/018.Recombinant HIV-1 prime-boost vaccination and vaccinia virus infectionThe recombinant fowlpox virus vectors encoding HIV-1 AE clade Gag, Pol and Env (FPV-HIV) and recombinant vaccinia virus encoding HIV-1 AE clade Gag and Pol (VV-HIV) used in the current study were exactly as those used previously in Ranasinghe et al. [28] . Recombinant FPV-HIV and VV-HIV co-expressing the murine soluble IL-13R[alpha]2 (IL-13 inhibitor vaccines) were constructed exactly as described in [24] .Vaccinia virus Western Reserve (VV-WR) strain and infection with this virus was exactly as described in Wijesundara et al. [26] . Briefly, BALB/c mice were infected for 7 days intraperitoneally (i.p.) prior to isolation of splenocytes for flow cytometry analysis. For all recombinant HIV-1 prime-boost vaccinations except where indicated, pathogen free 6-8 weeks old BALB/c mice were primed i.n. with 1x10 7 PFU of FPV-HIV followed by i.m. booster vaccination with 1x107 PFU of VV-HIV 14 days apart as described in Ranasinghe et al. [28] . T cell responses were evaluated 14 days post booster vaccination.Flow cytometryMonoclonal antibodies against mouse antigens CD2 (clone RM2-5), CD11a (clone 2D7), TCRβ (clone H57-597), IFN-γ (clone XMG1.2), H-2Kd (clone SF1-1.1) and CD8β.2 (clone 53-5.8) were all purchased from BioLegend with the exception of CD8[alpha] (clone 53-6.7), lck (clone MOL 171) and TNF-[alpha] (clone MP6-XT22), which were purchased from Becton Dickinson (BD) Biosciences. These antibodies were used as purified (not conjugated) or conjugated with fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, peridinin chlorophyll protein, allophycocyanin or pacific blue. Peridinin chlorophyll protein conjugated monoclonal antibody against mouse IL-2 (clone JES6-5H4) was purchased from eBioscience. All cell surface and intracellular staining procedures with these antibodies were performed as described previously [26] . Stained samples were analyzed using the BD FACScalibur or BD LSR II prior to analysis using the FlowJo Tree Star software (version 8.8.7). For each sample 2,00,000-10,00,000 events were acquired.
การแปล กรุณารอสักครู่..
ven แม้ว่ายาต้านไวรัสที่มีประสิทธิภาพมีอยู่ในปัจจุบันกับ HIV-1 [1] การพัฒนาวัคซีนยังคงมีความสำคัญที่สำคัญสำหรับการชะลอตัวลงของอุบัติการณ์ความคืบหน้าการติดเชื้อ HIV-1 ทั่วโลก แต่น่าเสียดายที่นี้ได้รับงานที่น่ากลัวได้รับความจุของ HIV-1 ในการรักษาความล่าช้าและการกลายพันธุ์อย่างรวดเร็วปล่อยให้มันหลบเลี่ยงระบบภูมิคุ้มกัน [2] นอกจากนี้หลายที่ผ่านมาวัคซีน HIV-1 ที่มีผลออกมาป้องกันในสัตว์ได้ล้มเหลวที่จะทำเช่นนั้นในมนุษย์ [3-8]. การชักนำของความโลภสูงป้องกันไวรัสเซลล์ CD8 + T การตอบสนองจะคิดว่าเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการป้องกันที่มีประสิทธิภาพ ภูมิคุ้มกันต่อไวรัสเอชไอวีรวมทั้ง-1 [9,10] โมเลกุลต่างๆที่อำนวยความสะดวกในการยึดเกาะของเซลล์ (เช่น CD2 และ CD11a) สายเลือดระดับ histocompatibility เปปไทด์ที่สำคัญฉันคอมเพล็กซ์ (pMHC-I) การรับรู้ (ความหนาแน่นเช่นของ CD8 และเซลล์รับ T (TCR) การทำงานร่วมกัน) และเซลล์ส่งสัญญาณเช่น LCK ได้รับทราบ เพื่อควบคุมความโลภมือถือ T [11-14] สูงความโลภต้านไวรัสเซลล์ CD8 + T สามารถรับรู้และตอบสนองต่อความหนาแน่นต่ำกว่าของสายเลือด pMHC-I ในเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัสที่ต่ำเมื่อเทียบกับความโลภต้านไวรัสเซลล์ CD8 + T [15] นี้จะช่วยให้ความโลภเอชไอวีสูงเฉพาะเซลล์ CD8 + T เพื่อลดหรือป้องกันการแพร่กระจายของเชื้อไวรัสนี้จากการสัมผัสต้น mucosae genito-ทางทวารหนักกับลำไส้ที่ยิ่งใหญ่ที่สุดของ CD4 + T เซลล์สูญเสียเกิดขึ้นในระหว่างการติดเชื้อ HIV-1 การติดเชื้อ [2,10] สูงความโลภต้านไวรัสเซลล์ CD8 + T นอกจากนี้ยังมีหลายหน้าที่ (เช่นการผลิตหลายต้านไวรัส / ความอยู่รอด cytokines เช่น IFN-γ, TNF- [alpha] และ IL-2) [16,17] การศึกษาหลายชิ้นแสดงให้เห็นว่าการควบคุมที่ยอดเยี่ยมของการติดเชื้อเอชไอวี -1 รักษาความโลภสูงมากขึ้นและหลายหน้าที่เซลล์ CD8 + T กว่าตัวควบคุมที่ไม่ใช่ [18-20] ดังนั้นการพัฒนาวัคซีนที่สามารถก่อให้เกิดความโลภสูงเอชไอวีเฉพาะเซลล์ CD8 + T อาจจะเป็นประโยชน์อย่างมากสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพผลการป้องกันเอชไอวี -1. แม้จะมีความรู้ที่ความโลภสูงป้องกันไวรัสเซลล์ CD8 + T ที่มีความสำคัญสำหรับการควบคุมไวรัสที่มีประสิทธิภาพกลไก รับผิดชอบในการเสริมสร้างความโลภของการต่อต้านไวรัสเซลล์ CD8 + T ต่อไปนี้การฉีดวัคซีนที่ไม่ได้เป็นที่เข้าใจกันดี การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า IL-4 และ IL-13 สามารถปรับประสิทธิภาพต้านไวรัสของเซลล์ CD8 + T และควบคุมการติดเชื้อไวรัส [21-24] เราได้แสดงให้เห็นว่าเอชไอวีเฉพาะเซลล์ CD8 + T ที่พัฒนาต่อไปเยื่อเมือก (intranasal (ใน) / หรือใน / กล้ามเนื้อ (IM)) เมื่อเทียบกับระบบหมดจด (im / im) HIV-1 recombinant โรคฝีฉีดวัคซีนไวรัสเพิ่มนายกได้ลดลง การแสดงออกของ IL-4 / IL-13 แต่สูงขึ้นในความโลภ [25] ในการศึกษาต่อมาเราได้แสดงให้เห็นต่อไปนี้โรคฝีไวรัสเอชไอวีการติดเชื้อและโรคฝี-1 recombinant ฉีดวัคซีนไวรัสเพิ่ม-prime ที่ IL-4, IL-13 และ STAT6 สามารถรองรับความโลภและ polyfunctionality ของไวรัสเซลล์ CD8 + T [26,27] . บนพื้นฐานความรู้ที่เรามีตอนนี้พัฒนาฝี recombinant นวนิยาย HIV-1 เชื้อไวรัสรับ IL-13 [alpha] 2 (IL-13R [alpha] 2) วัคซีน adjuvanted ที่สามารถนำมาใช้เพื่อ transiently ยับยั้งกิจกรรม IL-13 ที่เว็บไซต์ของการฉีดวัคซีน [24] วัคซีนนี้ถูกนำมาแสดงเพื่อเพิ่มความโลภ / polyfunctionality เอชไอวีเฉพาะเซลล์ CD8 + T รวมถึงประสิทธิภาพในการป้องกัน [24] ระบุว่าเป็นพาหะไวรัสโรคฝีเป็นที่นิยมใช้ในการศึกษาการฉีดวัคซีนที่นี่เรามี addressed วิธี IL-4 และ IL-13 สามารถรองรับความโลภของการต่อต้านไวรัสเซลล์ CD8 + T ต่อไปนี้การติดเชื้อ HIV-1 โรคฝี recombinant ฉีดวัคซีนไวรัสด้วยความหวังของการพัฒนาที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น วัคซีน HIV-1 ที่แปลเป็นขั้นตอนในอนาคตผมทดลองทางคลินิก. วัสดุและวิธีหนูเชื้อโรคฟรี6-8 สัปดาห์หญิงอายุ WT, IL-4 - / -, IL-13 - / - และ STAT6 - / - Balb / C หนูถูกซื้อมาจากออสเตรเลีย Phenomics สิ่งอำนวยความสะดวก, มหาวิทยาลัยแห่งชาติออสเตรเลีย หนูทั้งหมดถูกจัดการและการบำรุงรักษาภายใต้มหาวิทยาลัยแห่งชาติออสเตรเลียสัตว์ทดลองและคณะกรรมการจริยธรรมได้รับการอนุมัติแนวทางและโปรโตคอลจำนวน A2011 / 018. Recombinant HIV-1 การฉีดวัคซีนที่สำคัญ-เพิ่มและการติดเชื้อไวรัสวัคซีนเวกเตอร์ไวรัสfowlpox recombinant เข้ารหัส HIV-1 AE clade ปิดปาก , Pol และ Env (FPV เอชไอวี) และไวรัสวัคซีน recombinant เข้ารหัส HIV-1 AE clade ปิดปากและ Pol (VV เอชไอวี) ที่ใช้ในการศึกษาในปัจจุบันได้ตรงตามที่ผู้ใช้ก่อนหน้านี้ใน Ranasinghe et al, [28] Recombinant FPV เอชไอวีและ VV เอชไอวีร่วมแสดงที่ละลายน้ำหมา IL-13R [alpha] 2 (IL-13 วัคซีนยับยั้ง) ถูกสร้างขึ้นตรงตามที่อธิบายไว้ใน [24]. วัคซีนไข้ทรพิษไวรัส Western Reserve (VV-WR) สายพันธุ์และการติดเชื้อ ไวรัสนี้ได้รับตรงตามที่อธิบายไว้ใน Wijesundara et al, [26] สั้น ๆ , หนู Balb / c มีการติดเชื้อเป็นเวลา 7 วัน intraperitoneally ip () ก่อนที่จะมีการแยก splenocytes สำหรับการไหลของภูมิคุ้มกันวิเคราะห์ สำหรับทุก recombinant HIV-1 การฉีดวัคซีนที่สำคัญ-เพิ่มยกเว้นในกรณีที่ระบุเชื้อโรคฟรี 6-8 สัปดาห์หนู Balb / c ถูกเตรียมไว้ด้วย 1x10 7 PFU FPV ของเอชไอวีตามด้วยการฉีดวัคซีนสนับสนุน im กับ 1x107 PFU VV ของเอชไอวี 14 วัน ออกจากกันตามที่อธิบายไว้ใน Ranasinghe et al, [28] T เซลล์ตอบสนองได้รับการประเมิน 14 วันฉีดวัคซีนสนับสนุนโพสต์. cytometry ไหลโคลนอลแอนติบอดีต่อแอนติเจนเมาส์ CD2 (โคลน RM2-5) CD11a (โคลน 2D7) TCRβ (โคลน H57-597) IFN-γ (โคลน XMG1.2) H-2Kd (โคลน SF1-1.1) และCD8β.2 (โคลน 53-5.8) ทุกคนที่ซื้อมาจาก BioLegend มีข้อยกเว้นของ CD8 [alpha] (โคลน 53-6.7) LCK (โคลน MOL 171) และ TNF- [อัลฟา ] (โคลน MP6-XT22) ซึ่งซื้อมาจาก Becton ดิกคินสัน (BD) ชีววิทยาศาสตร์ แอนติบอดีเหล่านี้ถูกนำมาใช้เป็นบริสุทธิ์ (ไม่ผัน) หรือผันกับ fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, peridinin โปรตีนคลอโรฟิล allophycocyanin แปซิฟิกหรือสีฟ้า Peridinin โปรตีนคลอโรฟิลแอนติบอดีผันกับเมาส์ IL-2 (โคลน JES6-5H4) ซื้อมาจาก eBioscience เซลล์ผิวทุกขั้นตอนการย้อมสีและเซลล์ที่มีแอนติบอดีเหล่านี้ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26] ตัวอย่างสีที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้ BD FACSCalibur หรือ BD ขี้ครั้งที่สองก่อนที่จะมีการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ต้นไม้ FlowJo ดาว (เวอร์ชั่น 8.8.7) สำหรับแต่ละตัวอย่าง 2,00,000-10,00,000 เหตุการณ์ได้มา
การแปล กรุณารอสักครู่..