2.10. Secondary screening2.10.1. Di

2.10. Secondary screening

2.10.1. Disc diffusion method
Antibacterial activities of the crude extracts were tested by using agar disc diffusion method as described by Kirby-Bauer with modification[33]. The inoculum was prepared by mixing a few bacterial colonies (1 mL) from exponential phase with 9 mL of sterile nutrient broth and compared the turbidity with that of the standard 0.5 McFarland solution which is equivalent to 106-108 CFU/mL. The sterile swab was dipped into properly adjusted inoculum and excess liquid was removed by gentle rotation of the cotton swab against the inner surface of the test tube. To obtain even growth, the entire Mueller Hinton agar (MHA) surface was swabbed uniformLy by the cotton swab. The inoculated plates were left at room temperature for 3-5 minutes to allow for any surface moisture to be absorbed before applying the extract. Ten mg/mL of each crude extracts was impregnated with filter paper (6 mm diameter disc) and placed on the surface of MHA medium. Standard antibiotic (tetracycline) disc was used as a positive control and filter paper disc soaked with methanol as a negative control. The selected standard antibiotic and the crude extracts were applied on the MHA in triplicate and left for 15 min to allow the extracts to diffuse. Then the plates were incubated at 37 °C for 18-24 h and the zone of inhibition (mm) was measured.

2.10.2. Agar well diffusion method
In this method inoculum was prepared as that of disc diffusion method. The well was prepared in the plate by using sterile cork borer (6 mm in diameter). A volumn of 100 µL of 10 mg/mL of crude extracts was carefully dispensed into each well and allowed to diffuse for 2 h and incubated at 37 °C for 24 h. The sterilized methanol was filtered and used as negative control. After 24 h of incubation, zone of inhibition around each well was recorded and the experiment was repeated for three times[34].

2.11. Determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC)

MIC and MBC was determined by broth two fold serial dilution method[35]. In this method one Gram positive and one Gram negative bacterial strain was used. For determination of MIC and MBC, 12 sterile screw capped test tubes were used. A volume of 1 mL of nutrient broth was dispensed into test tubes 1-10 and 2 mL into test tube 11 (broth control). 1 mL of the crude extract solution was added into test tubes 1 and 2 and 2 mL to test tube 12 (crude extract control). One milliliter of well mixed solution was transferred from test tube 2 to 3 and this process was continued serially up to the test tube 10 by mixing and changing the micropipette tips at each dilution. Finally 1 mL was discarded from test tube 10 and 0.1 mL of standardized inoculum was added into test tubes 1-10 and incubated at 37 °C for 18-24 h. After incubation, by observing the growth of bacteria in the test tube MIC value was determined. From the above test tubes with no growth (no turbidity), 0.1 mL was spreaded over the surface of Mueller Hinton agar plates. After incubation at 37 °C for 24 h, the colonies were observed and MBC was determined.

2.12. Characterization of actinomycetes

The potential actinomycetes selected from the primary and secondary screening was characterized by morphological, biochemical and physiological methods[36].

2.12.1. Morphological characterization by macroscopic method
Morphological characters of the selected isolates were studied by inoculating into sterile media like, glycerol yeast extract agar, oatmeal agar, mineral agar, and starch-casein agar[37]. The media was sterilized and poured into sterile Petri dishes. After solidification, selected isolates were streaked aseptically and incubated at 30 °C for 7 d. Morphological characters such as colony characteristics, pigment production, absence or presence of aerial and substrate mycelium was observed.

2.12.2. Morphological characterization by microscopic cover slip culture method
The arrangement of spores and sporulating structures were examined microscopically by using cover slip culture method by inserting sterile cover slip at an angle of 45 °C in the starch casein agar medium[38],[39]. A loop full of isolates was taken from 7 d old culture media, inoculated at the insertion place of the cover slip and incubated at 30 °C for 7 d. The cover slip was carefully removed by using sterile forceps and placed upward on a clean glass slide. The bacterial growth on the cover slip was fixed with few drops of absolute methanol for 15 min and washed with tap water then flooded with crystal violet reagent for 1 min followed by washing and blot drying. Finally, the cover slip was examined under the microscope by using oil immersion lens (100×).

2.12.3. Biochemical and physiological characterization
In this test, isolates was streaked on starch agar plates and incubated at 30 °C for 7 d. After incubation, iodine solution was poured on the agar and examined for hydrolysis of starch by the production of clear zone around the microbial growth.

Isolates was streaked on gelatin agar plates and incubated at 30 °C for 7 d to test for gelatin hydrolysis. After incubation, plates were flooded with 1 mL of mercuric chloride solution and observed for zone of hydrolysis.

Isolates was streaked on skimmed milk agar medium and incubated at 30 °C for 7 d and observed for zone of casein hydrolysis.

In the urea hydrolysis test, isolates was inoculated in to sterile urea agar slants and incubated at 30 °C for 7 d and a change in colour was observed.

Isolates was streaked on Simon's citrate slant agar and incubated at 30 °C for 7 d and a change in colour was observed.

To test sodium chloride resistance, starch casein agar was prepared in three batches and supplemented with 5%, 7% and 10% sodium chloride. The medium was autoclaved, poured in to the plates and allowed for solidification. The plates were streaked with isolates and incubated at 30 °C for 7 d. The visual observations was made to record the growth of isolates at the highest salt concentration.

The isolates was streaked on starch casein agar plates and incubated at 25 °C, 30 °C, 35 °C and 40 °C for 7 d. The optimum temperature for maximum growth was determined by visual examination of the growth[40].

2.13. Data analysis

The data collected from the secondary screening method was subjected to one way ANOVA to compare the level of significance within the isolates by using SPSS version 16 and the results were interpreted.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.10 การรองตรวจ

2.10.1 ดิสก์วิธีแพร่
ทดสอบกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของสารสกัดหยาบโดยวิธี agar ดิสก์แพร่ตามที่อธิบายไว้ โดยเคอร์บี้วเออร์กับการแก้ไข [33] Inoculum ที่เตรียม โดยผสมแบคทีเรียบางอาณานิคม (1 mL) จากระยะเนนกับ 9 mL ของซุปใส่ธาตุอาหาร และเปรียบเทียบความขุ่นกับ 0 มาตรฐานโซลูชัน McFarland 5 ซึ่งจะเท่ากับ 106-108 CFU/mL กวาดใส่ถูกจุ่มลงใน inoculum ปรับปรุงอย่างถูกต้อง และของเหลวส่วนเกินถูกเอาออก โดยหมุนเบา ๆ ของสำลีกับพื้นผิวด้านในของหลอดทดสอบ รับแม้การเจริญเติบโต พื้นผิวทั้งหมด Mueller Hinton agar (MHA) ถูก swabbed สม่ำเสมอเมื่อเทียบเคียง โดยสำลี แผ่น inoculated ถูกทิ้งที่อุณหภูมิห้อง 3-5 นาทีเพื่อให้ความชื้นใด ๆ ผิวจะดูดซึมก่อนที่จะใช้การดึงข้อมูล 10 mg/mL สารสกัดจากน้ำมันแต่ละ impregnated กับกระดาษกรอง (แผ่นเส้นผ่าศูนย์กลาง 6 มิลลิเมตร) และวางอยู่บนพื้นผิวของตัวกลาง MHA มีใช้ดิสก์มาตรฐานยาปฏิชีวนะ (เตตราไซคลีน) เป็นบวกควบคุมและกระดาษกรองดิสก์กับเมทานอลเป็นตัวควบคุมค่าลบที่เปี่ยมล้นไปด้วย ยาปฏิชีวนะมาตรฐานเลือกและสารสกัดหยาบที่ใช้กับ MHA ใน triplicate และซ้าย 15 นาทีให้สารสกัดขจาย แล้วแผ่นก็ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ h 18-24 และโซน (mm) ยับยั้งถูกวัด

2.10.2 วิธีแพร่ดี agar
วิธีนี้ inoculum ถูกเตรียมไว้เป็นของดิสก์วิธีการแพร่ ดีเตรียมไว้ในจานโดยคอร์กกอซ borer (เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 มิลลิเมตร) Volumn ของ 100 µL ของ 10 mg/mL สารสกัดจากน้ำมันอย่างระมัดระวังคำในแต่ละดี และสามารถกระจายใน 2 h และ incubated ที่ 37 ° C ใน 24 ชม เมทานอล sterilized กรอง และใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ หลังจาก 24 ชมของคณะทันตแพทยศาสตร์ โซนยับยั้งรอบละทั้งถูกบันทึก และทดลองถูกทำซ้ำสำหรับสามเวลา [34]

2.11 กำหนดความเข้มข้นลิปกลอสไขต่ำสุด (MIC) และความเข้มข้น bactericidal ต่ำสุด (ช่อง MBC)

ไมค์และช่อง MBC ได้ถูกกำหนด โดยซุปสองพับวิธีเจือจางประจำ [35] ในการนี้วิธีหนึ่งกรัมบวกและกรัมหนึ่ง ต้องใช้แบคทีเรียลบถูกใช้ สำหรับเรื่องของไมค์และช่อง MBC มีใช้หลอดทดสอบกระบอกสกรูปรบมือ 12 ปริมาตรของ 1 mL ของธาตุอาหารซุปมีคำลงในหลอดทดสอบ 1-10 และ 2 มล.ลงในหลอดทดสอบ 11 (ซุปควบคุม) 1 mL ของสารสกัดหยาบถูกเพิ่มเข้าไปในหลอดทดสอบ 1 และ 2 และ 2 mL เพื่อทดสอบหลอด 12 (สารสกัดน้ำมันควบคุม) Milliliter หนึ่งของโซลูชันที่ดีผสมถูกโอนย้ายจากหลอดทดสอบ 2-3 และกระบวนการนี้ถูกต่อ serially ถึง 10 หลอดทดสอบ โดยผสม และเคล็ดลับ micropipette ที่เจือจางแต่ละการเปลี่ยนแปลง สุดท้าย 1 mL ถูกละทิ้งจากหลอดทดสอบ 10 และ 0.1 mL ของ inoculum มาตรฐานถูกเพิ่มเข้าไปในหลอดทดสอบ 1-10 และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ h 18-24 หลังจากคณะทันตแพทยศาสตร์ ค่าถูกกำหนด โดยการสังเกตการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในหลอดทดสอบ MIC จากหลอดทดสอบข้างต้นกับไม่เจริญเติบโต (ไม่ความขุ่น), 0.1 mL ได้ spreaded ผ่านพื้นผิวของแผ่น Mueller Hinton agar หลังจากบ่มที่ 37 ° C ใน 24 ชม อาณานิคมถูกสังเกต และกำหนดช่อง MBC

2.12 คุณสมบัติของ actinomycetes

Actinomycetes เป็นที่เลือกจากการคัดกรองหลัก และรองถูกลักษณะสัณฐาน ชีวเคมี และสรีรวิทยาวิธี [36] .

2.12.1 การ จำแนกสัณฐาน โดยวิธี macroscopic
อักขระของแยกเลือกได้ศึกษา โดย inoculating เป็นสื่อกอซเช่น กลีเซอรยีสต์สารสกัด agar ข้าวโอ๊ต agar แร่ agar และแป้ง-เคซีน agar [37] สื่อ sterilized และ poured ในจาน Petri กอซ หลังจาก solidification แยกเลือกลาย aseptically และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับอักขระของ d. 7 เช่นลักษณะโคโลนี pigment ผลิต การขาดงานหรือสถานะของ mycelium ชั้นและพื้นผิวถูกสังเกต

2.12.2 จำแนกสัณฐาน โดยวิธีครอบด้วยกล้องจุลทรรศน์บันทึกวัฒนธรรม
จัดเพาะเฟิร์นและโครงสร้าง sporulating ได้ตรวจสอบ microscopically โดยใช้วิธีจัดส่งครอบคลุมวัฒนธรรมใส่ใส่ปกจัดเป็นมุม 45 องศาเซลเซียสในแป้งเคซีน agar สื่อ [38], [39] วนเต็มแยกได้มาจาก 7 d เก่าวัฒนธรรมสื่อ inoculated สแทรกของใบปก และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d ใบปกถูกเอาออก โดยใช้คีมกอซอย่างรอบคอบ และวางบนสไลด์แก้วที่สะอาดขึ้น การเจริญเติบโตเชื้อแบคทีเรียบนใบหน้าปกถูกถาวรกับหยดของเมทานอลนอนสำหรับ 15 นาที และล้าง ด้วยน้ำประปา แล้วน้ำท่วมกับรีเอเจนต์คริสตัลไวโอเลตใน 1 นาทีตาม ด้วยการซักผ้าและอบแห้งคืนในตา สุดท้าย ใบปกถูกตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ โดยใช้เลนส์แช่น้ำมัน (100 ×) .

2.12.3 จำแนกสรีรวิทยา และชีวเคมี
ในการทดสอบนี้ แยกลายบนแผ่นแป้ง agar และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d หลังจากบ่ม โซลูชันไอโอดีนถูก poured ใน agar และตรวจสอบสำหรับไฮโตรไลซ์ของแป้ง โดยการผลิตของโซนล้างสถานที่เจริญเติบโตของจุลินทรีย์

แยกเป็นลายบนแผ่นตุ๋น agar และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d การทดสอบไฮโตรไลซ์ตุ๋น หลังจากบ่ม แผ่นถูกน้ำท่วม ด้วย 1 mL ของ mercuric คลอไรด์ และสังเกตในโซนของไฮโตรไลซ์

แยกลายอยู่กลาง agar นมขาดมันเนย และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d และสังเกตในโซนของเคซีนไฮโตรไลซ์

ในการทดสอบไฮโตรไลซ์ยูเรีย แยก inoculated ในการใส่ยูเรีย agar slants และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d และมีสังเกตการเปลี่ยนแปลงสี

แยกลายบนของ Simon ซิเตรตเอียง agar และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d และมีสังเกตการเปลี่ยนแปลงสี

การทดสอบต้านทานโซเดียมคลอไรด์ แป้งเคซีน agar ถูกเตรียมในสามชุด และเสริม ด้วย 5%, 7% และ 10% โซเดียมคลอไรด์ สื่อถูก autoclaved, poured ในการแผ่น และได้รับอนุญาตสำหรับ solidification แผ่นมีลายกับแยก และ incubated ที่ 30 ° C สำหรับ 7 d สังเกตภาพทำการบันทึกการเจริญเติบโตของแยกในสุดเกลือความเข้มข้น

แยกลายบนแผ่นแป้งเคซีน agar และ incubated ที่ 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C และ 40 ° C สำหรับ 7 d อุณหภูมิเหมาะสมสำหรับการเจริญเติบโตสูงสุดถูกกำหนด โดยการตรวจสอบการเจริญเติบโต [40] ภาพ

2.13 วิเคราะห์ข้อมูล

ข้อมูลรวบรวมจากวิธีคัดกรองรองถูกต้องวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวเพื่อเปรียบเทียบระดับของความสำคัญในการแยก โดยใช้โปรแกรมรุ่น 16 และมีแปลผลการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.10 การตรวจคัดกรองมัธยมศึกษา2.10.1 วิธีการแพร่กระจายแผ่นกิจกรรมแบคทีเรียของสารสกัดได้มีการทดสอบโดยใช้วิธีการกระจายแผ่นวุ้นตามที่อธิบายไว้โดยเคอร์บี้-Bauer มีการดัดแปลง [33] เชื้อที่ได้รับการจัดทำขึ้นโดยการผสมโคโลนีของแบคทีเรียไม่กี่ (1 มิลลิลิตร) จากขั้นตอนการชี้แจงกับ 9 มิลลิลิตรของน้ำซุปสารอาหารที่ผ่านการฆ่าเชื้อและเมื่อเทียบกับที่ความขุ่นของสารละลายมาตรฐาน 0.5 McFarland ซึ่งเทียบเท่ากับ 106-108 CFU / ml ไม้กวาดผ่านการฆ่าเชื้อได้รับการจุ่มลงในการปรับเชื้ออย่างถูกต้องและมีสภาพคล่องส่วนเกินที่ถูกลบออกตามวาระอ่อนโยนของก้านสำลีกับพื้นผิวด้านในของหลอดทดลอง ที่จะได้รับการเจริญเติบโตได้ทั้งมูลเลอร์ฮินตันวุ้น (หมา) ผิวถูก swabbed สม่ำเสมอโดยกวาดฝ้าย แผ่นเชื้อถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องนาน 3-5 นาทีเพื่อให้ความชื้นที่พื้นผิวใด ๆ ที่จะถูกดูดซึมก่อนที่จะใช้สารสกัดจาก สิบ mg / ml ของแต่ละสารสกัดถูกฉาบไว้ด้วยกระดาษกรอง (6 มม. แผ่นเส้นผ่าศูนย์กลาง) และวางไว้บนพื้นผิวของเลดกลาง ยาปฏิชีวนะ (tetracycline) แผ่นดิสก์มาตรฐานถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมบวกและแผ่นกรองกระดาษเปียกโชกไปด้วยเมทานอลเป็นตัวควบคุมเชิงลบ เลือกมาตรฐานยาปฏิชีวนะและสารสกัดหยาบที่ถูกนำมาใช้ในเลดในเพิ่มขึ้นสามเท่าและที่เหลือเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อให้สารสกัดที่จะกระจาย จากนั้นแผ่นบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมงและโซนของการยับยั้ง (มม. ) วัด2.10.2 วิธีการที่ดีวุ้นแพร่เชื้อในวิธีการนี้ได้รับการจัดทำขึ้นเป็นวิธีการที่แผ่นกระจาย ดีที่ได้รับการจัดทำแผ่นโดยใช้ไม้ก๊อกเจาะผ่านการฆ่าเชื้อ (6 มม. ) ระดับเสียงจาก 100 ไมโครลิตร 10 mg / ml ของสารสกัดหยาบที่ได้รับการจ่ายอย่างรอบคอบในการแต่ละอย่างดีและได้รับอนุญาตให้กระจายเป็นเวลา 2 ชั่วโมงและบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เมทานอลถูกกรองผ่านการฆ่าเชื้อและนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ หลังจาก 24 ชั่วโมงของการบ่มโซนยับยั้งแต่ละรอบเป็นอย่างดีได้รับการบันทึกและการทดสอบซ้ำสามครั้ง [34] 2.11 การตรวจสอบความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้ง (MIC) และความเข้มข้นของเชื้อแบคทีเรียขั้นต่ำ (MBC) MIC และ MBC ถูกกำหนดโดยวิธีการเจือจางน้ำซุปแบบอนุกรมสองเท่า [35] ในวิธีการนี้หนึ่งแกรมบวกและแกรมลบหนึ่งสายพันธุ์แบคทีเรียที่ถูกนำมาใช้ สำหรับการกำหนด MIC และ MBC, 12 หมันกรูปกคลุมหลอดทดลองถูกนำมาใช้ ปริมาณ 1 มิลลิลิตรของน้ำซุปสารอาหารที่ได้รับการจ่ายลงในหลอดทดลอง 1-10 และ 2 มิลลิลิตรลงในหลอดทดสอบ 11 (การควบคุมน้ำซุป) 1 มิลลิลิตรของสารละลายสารสกัดหยาบที่ถูกเพิ่มเข้าไปในหลอดทดลองที่ 1 และ 2 และ 2 มิลลิลิตรในการทดสอบหลอด 12 (การควบคุมสารสกัดหยาบ) หนึ่งมิลลิลิตรของสารละลายผสมกันถูกย้ายจากหลอดทดลอง 2 ถึง 3 และกระบวนการนี้ได้รับการอย่างต่อเนื่องเป็นลำดับขึ้นไปทดสอบหลอด 10 โดยการผสมและการเปลี่ยนแปลง micropipette เคล็ดลับในแต่ละเจือจาง ในที่สุด 1 มิลลิลิตรทิ้งจากการทดสอบท่อ 10 และ 0.1 มิลลิลิตรของเชื้อที่ได้มาตรฐานถูกเพิ่มเข้าไปในหลอดทดลอง 1-10 และบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง หลังจากการบ่มโดยการสังเกตการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในค่า MIC หลอดทดลองถูกกำหนด จากหลอดทดลองข้างต้นโดยไม่มีการเจริญเติบโต (ไม่มีความขุ่น), 0.1 มิลลิลิตรกระจายไปทั่วพื้นผิวของแผ่นวุ้นมูลเลอร์ฮินตัน หลังจากการบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงอาณานิคมถูกตั้งข้อสังเกตและ MBC ได้กำหนด2.12 ลักษณะของ actinomycetes ที่actinomycetes ที่มีศักยภาพการคัดเลือกจากการตรวจคัดกรองประถมศึกษาและมัธยมศึกษาก็มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาชีวเคมีและสรีรวิทยาวิธีการ [36] รูป 2.12.1 ลักษณะทางสัณฐานวิทยาโดยวิธีเปล่าอักขระทางสัณฐานวิทยาของเชื้อที่เลือกได้รับการศึกษาโดยการฉีดวัคซีนเป็นสื่อผ่านการฆ่าเชื้อเช่นกลีเซอรอลสารสกัดจากยีสต์วุ้นข้าวโอ๊ตวุ้นวุ้นเกลือแร่และแป้งเคซีนวุ้น [37] สื่อที่ได้รับการฆ่าเชื้อและเทลงในจานเพาะเชื้อผ่านการฆ่าเชื้อ หลังจากการแข็งตัวแยกเลือกลายได้เลี้ยงในขวดทดลองและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน ลักษณะทางสัณฐานวิทยาเช่นลักษณะอาณานิคมการผลิตเม็ดสีที่ขาดหายไปหรือการแสดงตนของทางอากาศและพื้นผิวไมซีเลียมเป็นที่สังเกต2.12.2 ลักษณะทางสัณฐานวิทยาโดยวิธีการเพาะเลี้ยงใบปกกล้องจุลทรรศน์การจัดเรียงของสปอร์และโครงสร้างสร้างสปอร์ได้รับการตรวจสอบกล้องจุลทรรศน์โดยใช้วิธีการเพาะเลี้ยงปกใบผ่านการฆ่าเชื้อโดยการใส่ฝาครอบใบที่มุม 45 ° C ในกลางแป้งเคซีนวุ้น [38], [39] วงเต็มไปด้วยสายพันธุ์ถูกนำมาจาก 7 d สื่อวัฒนธรรมเก่าเชื้อในสถานที่ที่แทรกของฝาครอบใบและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน ปกใบจะถูกลบออกอย่างระมัดระวังโดยใช้คีมผ่านการฆ่าเชื้อและวางขึ้นบนสไลด์แก้วสะอาด เจริญเติบโตของแบคทีเรียบนปกใบได้รับการแก้ไขด้วยไม่กี่หยดของเมทานอลแน่นอนสำหรับ 15 นาทีและล้างด้วยน้ำประปาแล้วน้ำท่วมด้วยคริสตัลสีม่วงสารเป็นเวลา 1 นาทีตามด้วยการซักผ้าและอบแห้ง blot สุดท้ายปกใบถูกตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์โดยใช้เลนส์แช่น้ำมัน (100 ×) 2.12.3 ชีวเคมีและสรีรวิทยาของตัวละครในการทดสอบนี้แยกเป็นลายบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อแป้งและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน หลังจากการบ่มสารละลายไอโอดีนถูกเทลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อและการตรวจสอบการย่อยสลายของแป้งโดยการผลิตของวงใสรอบการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที่แยกเป็นลายบนจานวุ้นเจลาตินและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วันเพื่อทดสอบการย่อยสลายเจลาติน หลังจากการบ่ม, จานที่ถูกน้ำท่วมด้วย 1 มิลลิลิตรของสารละลายคลอไรด์ปรอทและตั้งข้อสังเกตสำหรับโซนย่อยที่แยกเป็นลายบนไขมันต่ำกลางวุ้นนมและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วันและตั้งข้อสังเกตสำหรับโซนของเคซีนไฮโดรไลซ์ในการทดสอบการย่อยสลายยูเรีย , ได้รับการแยกเชื้อในการฆ่าเชื้อยูเรีย slants วุ้นและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วันและเปลี่ยนสีเป็นที่สังเกตที่แยกเป็นลายบนวุ้นเอียงไซมอนซิเตรตและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วันและเปลี่ยนสีเป็น ข้อสังเกตในการทดสอบความต้านทานโซเดียมคลอไรด์, แป้งเคซีนวุ้นเตรียมในสามสำหรับกระบวนการและเสริมด้วย 5%, 7% และ 10% โซเดียมคลอไรด์ กลางเป็นเบา, เทในจานและได้รับอนุญาตให้แข็งตัว แผ่นถูกลายเชื้อและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน สังเกตภาพที่ถูกสร้างขึ้นเพื่อบันทึกการเจริญเติบโตของสายพันธุ์ที่มีความเข้มข้นสูงสุดเกลือแยกเป็นลายบนแผ่นแป้งเคซีนวุ้นและบ่มที่ 25 ° C, 30 ° C 35 ° C และ 40 ° C เป็นเวลา 7 วัน อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการเจริญเติบโตสูงสุดถูกกำหนดโดยการตรวจสอบภาพของการเจริญเติบโต [40] 2.13 การวิเคราะห์ข้อมูลที่เก็บรวบรวมข้อมูลจากวิธีการตรวจคัดกรองที่สองก็จะถูกหนึ่งในการวิเคราะห์เพื่อเปรียบเทียบระดับความสำคัญในสายพันธุ์โดยใช้โปรแกรม SPSS รุ่นที่ 16 และผลที่ได้รับการตีความ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.10 . การคัดกรองรอง

2.10.1 . แผ่นกระจายวิธี
ต้านกิจกรรมของสารสกัดทดสอบโดยวิธี agar disc diffusion ตามที่อธิบายไว้โดยเคอร์บี้ บาวเออร์ กับการปรับเปลี่ยน [ 33 ] เชื้อถูกเตรียมโดยผสมอาณานิคมแบคทีเรียไม่กี่ ( 1 มล. ) จากชี้แจงระยะ 9 มิลลิลิตรของน้ำซุปและอาหารปลอดเชื้อเปรียบเทียบความขุ่นที่มาตรฐาน 05 โซลูชั่นแมคฟาร์แลนด์ซึ่งเทียบเท่ากับ 106-108 CFU / ml เช็ดล้างฆ่าเชื้อถูกจุ่มลงในของเหลวและเชื้ออย่างถูกต้องปรับส่วนเกินออกด้วยการหมุนที่อ่อนโยนของผ้าฝ้ายกับผิวด้านในของหลอดทดสอบ รับการเติบโต แม้ว่าทั้ง มุลเลอร์ ฮินตัน ( MHA ) พื้นผิวทำความสะอาดอย่างสม่ำเสมอ โดยผ้าฝ้าย .การใส่แผ่น ถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง ประมาณ 3-5 นาที เพื่อให้ความชื้นของพื้นผิวใด ๆที่จะถูกดูดซึมก่อนที่จะใช้สารสกัด มล. มิลลิกรัม / 10 ของแต่ละสกัดถูกชุบด้วยกระดาษกรอง ( 6 มม. เส้นผ่าศูนย์กลางดิสก์ ) และวางไว้บนพื้นผิวของมะ )มาตรฐานยาปฏิชีวนะ ( tetracycline ) ดิสก์ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวกและกรองกระดาษแผ่นแช่ด้วยเมทานอลเป็นตัวควบคุมลบ เลือกมาตรฐานยาปฏิชีวนะและสารสกัดที่ใช้ใน MHA ทั้งสามใบแล้ว 15 นาที เพื่อให้สารสกัด เพื่อกระจาย . แล้วจานก็บ่มที่ 37 ° C ระหว่าง H และโซนของการยับยั้ง ( มม. ) วัด

2.10.2 .วุ้นดีกระจายวิธี
ในวิธีนี้โดยเตรียมเป็นวิธีแพร่แผ่นดิสก์ ได้เป็นอย่างดีที่เตรียมไว้ในจาน ใช้ฆ่าเชื้อก๊อกเจาะ ( 6 มม. ) มีปริมาตร 100 µ L 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรของสารสกัดเป็นอย่างดีจ่ายในแต่ละอย่างดีและอนุญาตให้กระจาย สำหรับ 2 ชั่วโมงและบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงโดยเมทานอลเป็นกรองและใช้ควบคุมลบ หลังจาก 24 ชั่วโมง 1 , โซนยับยั้งในแต่ละรอบก็ถูกบันทึก และทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง [ 34 ] .

2.11 . การหาความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้ง ( MIC ) และความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถฆ่าเชื้อ ( MBC )

' และ MBC ถูกกำหนดโดยซุปสองพับอุทิศถวายวิธี [ 35 ]ในวิธีนี้หนึ่งกรัมบวกและแกรมลบแบคทีเรียสายพันธุ์ที่ใช้ หาไมค์และ MBC 12 เป็นหมันกรูปกคลุมหลอดทดลองมาใช้ ปริมาณ 1 มิลลิลิตรของน้ำซุปลงในหลอดทดสอบธาตุ dispensed 2 มล. ในหลอดทดลอง 1-10 และ 11 ( ควบคุมน้ำซุป ) 1 มิลลิลิตรของสารละลายสกัดที่เพิ่มลงในหลอดทดลองที่ 1 และ 2 และ 2 มล. ในหลอดทดสอบที่ 12 ( การควบคุมสารสกัด )หนึ่งมิลลิลิตรของสารละลายผสม ถูกย้ายจากหลอดทดลอง 2 และกระบวนการนี้ต่ออนุกรมขึ้นไปทดสอบหลอด 10 โดยการผสมและการเปลี่ยนแปลงไมโครปิเปตทิปที่แต่ละเจือจาง ในที่สุด 1 ml ถูกทิ้งจากหลอด 10 และ 0.1 มิลลิลิตร ปริมาณมาตรฐานถูกเพิ่มลงในหลอดทดลอง 1-10 และบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง หลังจากระยะเวลาโดยการสังเกตการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในหลอดทดลองไมค์ค่าถูกกำหนดไว้ จากข้างต้นการทดสอบท่อที่ไม่มีการเติบโต ( ไม่ขุ่น ) , 0.1 ml พบแพร่กระจายบนพื้นผิวของ มุลเลอร์ ฮินตัน วุ้นแผ่น หลังจากบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่าอาณานิคมและตั้งใจ

2.12 . คุณสมบัติของแอคติโนมัย

โดยแอคติโนมัยซีทอาจเลือกจากประถมศึกษาและมัธยมศึกษาการคัดกรองมีลักษณะสัณฐานวิทยาสรีรวิทยา ชีวเคมี และวิธีการ [ 36 ] .

2.12.1 . ลักษณะทางสัณฐานวิทยาลักษณะทางสัณฐานวิทยาโดยวิธี
ตัวอักษรของสายพันธุ์ที่เลือกศึกษาโดยผ่านสื่อเช่นณเป็นกลีเซอรอลยีสต์สกัดวุ้นวุ้นวุ้น , ข้าวโอ๊ต , แร่ ,และแป้ง โปรตีนวุ้น [ 37 ] สื่อถูกฆ่าเชื้อและเทลงในจาน Petri เป็นหมัน หลังจากการแข็งตัว เลือกจากลาย aseptically บ่มที่ 30 ° C เป็นเวลา 7 วันของตัวละคร เช่น ลักษณะโคโลนี , การผลิตสี ขาดหรือการแสดงตนของอากาศและพื้นผิวเส้นใยพบ

2.12.2 .ลักษณะสัณฐานวิทยาด้วยกล้องจุลทรรศน์ครอบคลุมสลิปวิธีการเลี้ยง
จัดโครงสร้างและผลผลิตสปอร์สปอร์ทดสอบโดยใช้วิธีวัฒนธรรมสลิปครอบคลุมโดยการแทรกเป็นหมันครอบคลุมสลิปที่มุม 45 องศา C ในอาหารวุ้นแป้งเคซีน [ 38 ] [ 39 ] วงเต็มรูปแบบของสายพันธุ์ถูกนำมาจาก 7 D สื่อวัฒนธรรมเก่าแต่ที่แทรกสถานที่ของปกลื่นและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 7 วัน ครอบคลุมสลิปลบออกอย่างระมัดระวังโดยใช้คีมปลอดเชื้อและสะอาดวางขึ้นบนกระจกสไลด์ การเจริญเติบโตของแบคทีเรียบนปกใบถูกตรึงกับไม่กี่หยดของ Absolute methanol 15 นาทีและล้างด้วยน้ำประปา แล้วน้ำท่วมด้วยคริสตัลสีม่วงรีเอเจนต์ 1 นาทีตามด้วยการล้างและ blot แห้งในที่สุด , ปกใบตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ โดยใช้น้ำมันแช่เลนส์ ( 100 × )

2.12.3 . ชีวเคมีและสรีรวิทยาลักษณะ
ในการทดสอบนี้ แยกเป็นลายบนแป้งวุ้นแผ่น และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 7 วัน หลังจากบ่มในสารละลายไอโอดีนลงในวุ้น และตรวจสอบการย่อยสลายของแป้ง โดยการผลิตของบริเวณใสรอบการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ .

ไอโซเลตเป็นลายบนแผ่นวุ้นวุ้น และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C 7 D เพื่อทดสอบไฮโดรไลซ์เจลาติน หลังจากบ่มแผ่นเต็มไปด้วย 1 มิลลิลิตรของสารละลายเมอร์คิวริกคลอไรด์และสังเกตสำหรับโซนของการย่อยสลาย

ไอโซเลทเป็นลายบนอาหารวุ้นนมบ่มที่ 30 ° C 7 D และสังเกตสำหรับโซนของเคซีน ไฮโดร

ในยูเรียโดยใช้การทดสอบเชื้อเป็นเชื้อในวุ้นปลอดเชื้อยูเรีย slants บ่มที่ 30 ° C 7 D และเปลี่ยนสีค่า

ไอโซเลทคือไซม่อน ซิเตรต ลาดลายบนวุ้น และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C 7 D และเปลี่ยนสีค่า

เพื่อทดสอบการต้านทานคลอไรด์ โซเดียม วุ้น , เคซีน แป้งที่เตรียมไว้ 3 ชุด และเสริมด้วย 5% , 7% และ 10% โซเดียมคลอไรด์สื่อถูกสังเคราะห์ , เทในจานให้แข็ง . จานลายกับไอโซเลทและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา C เป็นเวลา 7 วัน สังเกตภาพที่ได้บันทึกการเจริญเติบโตของเชื้อที่ความเข้มข้นเกลือสูง แยกได้เป็น

ลายบนแป้ง โปรตีนวุ้นแผ่น และบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศา C 30 ° C , 35 ° C และ 40 ° C 7 Dอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการเจริญเติบโตสูงสุดถูกกำหนดโดยการตรวจสอบภาพในการเจริญเติบโต [ 40 ] .

2.13 . การวิเคราะห์ข้อมูล

ข้อมูลที่รวบรวมได้จากการคัดกรองวิธีภายใต้ทางเดียว ANOVA เพื่อเปรียบเทียบระดับความสำคัญภายในสายพันธุ์โดยการใช้โปรแกรม SPSS รุ่นที่ 16 และการตีความ