Strain Selection and Shaker Cultiva

Strain Selection and Shaker Cultivation

The experiments in this work were performed using the nucleotide sequence [GenBank: AY560097] that encodes for L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII). The gene was previously amplified and cloned by Wink and coworkers (Wink et al., 2010) without the signal peptide encoding region.

The influences of temperature, E. coli strain and culture media were investigated with the one-factorat-a-time (OFAT) method to observe the optimum level of recombinant protein expression. rErAII expression was assessed in the following E. coli strains: BL21 (DE3), BL21 (DE3) Star, BL21 (DE3) NH, C41 (DE3), Rosetta (DE3) and C43 (DE3). Temperature was varied after inoculation in two levels (30 and 37 ºC) and three culture media compositions were prepared (Terrific Broth, Luria-Bertani and semi-defined medium). The strains were transformed by electroporation with a recombinant plasmid, pET30-asp, containing the gene encoding for the mature asparaginase II protein region from E. carotovora cloned into the kanamycin resistant vector pET-30a(+). As a negative control, the strains were transformed with the empty pET-30a(+) vector.

Transformed cells were selected on Luria-Bertani (LB) agar plates containing the appropriate antibiotics for each E. coli strain. The colonies were grown overnight in 10 mL LB medium (pre-inoculum) containing the appropriate antibiotics at 37 ºC. An aliquot of these cultures was used to inoculate flasks (final OD600 nm = 0.1) containing 50 mL of either one of the two complex media (TB or LB) or the semidefined medium (0.5 g L-1 NaCl, 1 g L-1 NH4Cl, 20 g L-1 yeast extract, 6 g L-1 Na2HPO4, 3 g L-1 KH2PO4, 30 µg mL-1 kanamycin, 5 g L-1 glucose, 1 mM MgSO4, 1 µg mL-1 thiamine, 1 mL L-1 trace element solution (FeSO4 2.8 g L-1, MnCl2 2 g L-1, CaCl2 2 g L-1, CuCl2 0.26 g L-1, ZnSO4 0.3 g L-1)) in a shaker at 180 rpm. Recombinant protein expression was induced by adding 1 mM IPTG when the OD600 nm reached 0.4-0.6. Control cultures were left uninduced. Samples were harvested at several different times after induction. The cells were disrupted, and the expression of rErAII was analyzed in the soluble and insoluble fractions on a 12% SDS-PAGE gel stained with Coomassie Brilliant Blue.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เลือกสายพันธุ์และการเพาะปลูกปั่นดำเนินการทดลองในงานนี้ใช้ลำดับนิวคลีโอไทด์ [GenBank: AY560097] ที่ encodes สำหรับ L-asparaginase II จาก Erwinia carotovora (rErAII) ยีนก่อนหน้านี้ถูกขยาย และโคลน โดย Wink และเพื่อนร่วมงาน (Wink et al. 2010) โดยบริเวณสัญญาณเข้ารหัสของเพปไทด์อิทธิพลของอุณหภูมิ E. coli สายพันธุ์ และวัฒนธรรมสื่อถูกตรวจสอบ ด้วยวิธีหนึ่ง factorat-เวลา (OFAT) ตามระดับเหมาะสมของนิพจน์ recombinant โปรตีน rErAII นิพจน์ถูกประเมินใน E. coli สายพันธุ์ที่ต่อไปนี้: BL21 (DE3), BL21 (DE3) ดาว BL21 (DE3) NH, C41 (DE3), Rosetta (DE3) และ C43 (DE3) อุณหภูมิที่แตกต่างกันหลังจากกักบริเวณในสองระดับ (30 และ 37 ºC) และองค์ประกอบของสื่อวัฒนธรรมสามวจัด (น้ำ ซุปเยี่ยม Luria Bertani และกำหนดกึ่งกลาง) สายพันธุ์ที่ถูกแปลง โดย electroporation มี plasmid เป็น recombinant, pET30-asp ที่ประกอบด้วยการเข้ารหัสยีนสำหรับภูมิภาคโปรตีน II asparaginase แก่ ๆ E. carotovora โคลนลงใน pET-30a(+) เวกเตอร์กานามัยซินทน เป็นค่าลบควบคุม สายพันธุ์ได้กลายกับเวกเตอร์ pET-30a(+) ว่างเปล่ารับการเปลี่ยนแปลงเซลล์ถูกเลือกบนแผ่นวุ้น Luria-Bertani (ปอนด์) ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมสำหรับแต่ละสายพันธุ์ของ E. coli โคโลนีที่ปลูกใน 10 มล.ปอนด์ค้างคืนได้ใน (ก่อน inoculum) ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่ 37 ºC ส่วนลงตัวของวัฒนธรรมเหล่านี้ถูกใช้เพื่อปลูกฝีขวด (สุดท้าย OD600 nm = 0.1) ที่ประกอบด้วยอย่างใดอย่างหนึ่งสื่อซับซ้อนสอง (TB หรือปอนด์) หรือตัวกลาง semidefined (0.5 g NaCl L-1, L-1 NH4Cl, 20 กรัมสารสกัดจากยีสต์ L-1, 6 กรัม L-1 Na2HPO4, L-1 KH2PO4, 3 g 1 g 30 µg mL-1 กานามัยซิน L-1 5 กรัมกลูโคส 50 มล. , 1 มม. MgSO4 วิตามิน 1 µg mL 1, 1 mL โซลูชันธาตุ L-1 (FeSO4 2.8 g g MnCl2 2 L-1, CaCl2 2 g L-1 L-1 CuCl2 0.26 กรัม L-1, ZnSO4 0.3 g L-1)) ในการปั่นที่ 180 รอบต่อนาที นิพจน์ recombinant โปรตีนถูกเหนี่ยวนำ โดยการเพิ่ม 1 มม. IPTG เมื่อ OD600 nm ถึง 0.4-0.6 ควบคุมวัฒนธรรมถูกทิ้ง uninduced ตัวอย่างถูกเก็บเกี่ยวในเวลาที่แตกต่างกันหลายหลังเหนี่ยวนำ ระหว่างสองวันเซลล์ และการแสดงออกของ rErAII แบบแยกส่วนที่ละลายน้ำ และไม่ละลายน้ำในเจล SDS-หน้า 12% ย้อม ด้วย Coomassie Blue สดใส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การคัดเลือกสายพันธุ์และการเพาะปลูก Shaker

การทดลองในงานนี้ได้ดำเนินการโดยใช้ลำดับเบส [GenBank: AY560097] ที่ encodes สำหรับ L-II จากแอสปารา Erwinia carotovora (rErAII) ยีนถูกขยายก่อนหน้านี้และโคลนโดยขยิบตาและเพื่อนร่วมงาน (ขยิบตา et al., 2010) ไม่มีสัญญาณเปปไทด์ภูมิภาคเข้ารหัส.

อิทธิพลของอุณหภูมิ E. coli สายพันธุ์และวัฒนธรรมสื่อถูกตรวจสอบกับหนึ่ง factorat-เวลา ( OFAT) วิธีการสังเกตระดับที่เหมาะสมในการแสดงออกโปรตีน การแสดงออก rErAII ได้รับการประเมินในต่อไปนี้ E. coli สายพันธุ์: BL21 (DE3) BL21 (DE3) สตาร์, BL21 (DE3) NH, C41 (DE3) Rosetta (DE3) และ C43 (DE3) อุณหภูมิที่แตกต่างกันหลังจากที่ได้รับการฉีดวัคซีนในสองระดับ (30 และ 37 องศาเซลเซียส) และวัฒนธรรมสามองค์ประกอบสื่อได้จัดทำ (สุดยอดน้ำซุป Luria-Bertani และกึ่งกลางที่กำหนดไว้) สายพันธุ์ที่ถูกเปลี่ยนโดย electroporation ที่มีพลาสมิด recombinant, pET30-ASP, ที่มียีนสำหรับผู้ใหญ่แอสปารา II ภูมิภาคโปรตีนจาก E. carotovora โคลนเข้าไปในกานามัยซิทนเวกเตอร์สำหรับผู้รักสัตว์ 30A (+) เป็นตัวควบคุมเชิงลบสายพันธุ์ถูกเปลี่ยนกับที่ว่างเปล่าสำหรับผู้รักสัตว์ 30A (+) เวกเตอร์.

เซลล์เปลี่ยนได้รับการคัดเลือกใน Luria-Bertani (ปอนด์) วุ้นแผ่นที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสมสำหรับแต่ละสายพันธุ์เชื้อ E. coli อาณานิคมปลูกค้างคืนใน 10 มล LB กลาง (Pre-เชื้อ) ที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่ 37 องศาเซลเซียส หารของวัฒนธรรมเหล่านี้ถูกใช้ในการฉีดวัคซีนขวด (สุดท้าย OD600 นาโนเมตร = 0.1) ที่มี 50 มลของคนใดคนหนึ่งของทั้งสองสื่อที่ซับซ้อน (TB หรือปอนด์) หรือขนาดกลาง semidefined นี้ (0.5 กรัม L-1 โซเดียมคลอไรด์ 1 กรัม L-1 NH4Cl, 20 กรัมสารสกัดจาก L-1 ยีสต์, 6 กรัม L-1 Na2HPO4 3 G L-1 KH2PO4 30 ไมโครกรัม mL-1 กานามัยซิ, 5 กรัม L-1 กลูโคส 1 มิลลิ MgSO4 1 ไมโครกรัม mL-1 วิตามินบี 1 มลแก้ปัญหาองค์ประกอบ L-1 ร่องรอย (FeSO4 2.8 กรัม L-1 MnCl2 2 L-1 กรัม, CaCl2 2 L-1 กรัม, CuCl2 0.26 กรัม L-1, ZnSO4 0.3 L-1 กรัม)) ในเครื่องปั่นที่ 180 รอบต่อนาที . การแสดงออกของโปรตีน recombinant ถูกชักนำโดยการเพิ่ม 1 มิลลิ IPTG เมื่อ OD600 นาโนเมตรถึง 0.4-0.6 วัฒนธรรมการควบคุมถูกทิ้ง uninduced ตัวอย่างที่ถูกเก็บเกี่ยวในช่วงเวลาที่แตกต่างกันหลายหลังเหนี่ยวนำ เซลล์กระจัดกระจายและการแสดงออกของ rErAII ถูกวิเคราะห์ในเศษส่วนที่ละลายน้ำและไม่ละลายน้ำบน 12% เจล SDS-PAGE ย้อมด้วย Coomassie สีฟ้าสดใส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเลือกสายพันธุ์และการเขย่าการทดลองในงานวิจัยนี้ศึกษาการใช้ลำดับนิวคลีโอไทด์ขนาด : ay560097 [ ] ที่เข้ารหัสสำหรับ l-asparaginase II จากเชื้อ Erwinia carotovora ( reraii ) ยีนเคยขยายตัวโดยขยิบตาและเพื่อนร่วมงาน ( ขยิบตา et al . , 2010 ) โดยไม่มีสัญญาณเปปไทด์เขตการเข้ารหัสอิทธิพลของอุณหภูมิ , E . coli สายพันธุ์และศึกษาวัฒนธรรมสื่อกับ one-factorat-a-time ( ofat ) วิธีสังเกตระดับที่เหมาะสมของรีคอมบิแนนท์โปรตีน การแสดงออก ประเมินการแสดงออก reraii ใน E . coli สายพันธุ์ BL21 ( DE3 ) ต่อไปนี้ : BL21 ( DE3 ) ดาว BL21 ( DE3 ) NH c41 , ( DE3 ) , Rosetta ( DE3 ) และ c43 ( DE3 ) อุณหภูมิที่แตกต่างกันคือหลังจากที่ได้รับใน 2 ระดับ ( 30 และ 37 º C ) และสามวัฒนธรรมสื่อองค์ประกอบเตรียม ( ยอดเยี่ยมซุป ลุเรียแบร์ตานิ และกึ่งกำหนดขนาดกลาง ) สายพันธุ์ที่ถูกเปลี่ยนโดย electroporation พลาสมิดที่มีรีคอมบิแนนท์ pet30 ASP ที่มียีนสำหรับผู้ใหญ่ 2 E . carotovora ภาคนกฟิวแฟร์โปรตีนจากโคลนเข้าไปในอาณาจักรมอญป้องกันเวกเตอร์ pet-30a ( + ) เป็นชุดควบคุมลบ สายพันธุ์ที่ถูกเปลี่ยนด้วย pet-30a ว่างเปล่า ( + ) เวกเตอร์เปลี่ยนเซลล์ที่เลือกในลุเรียแบร์ตานิ ( LB ) อาหารจานที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสมสำหรับแต่ละเชื้ออีโคไลสายพันธุ์ อาณานิคมโตแล้วพักค้างคืนใน 10 ml ( ปริมาณปานกลางปอนด์ก่อน ) ที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่อุณหภูมิ 37 º C เป็นส่วนลงตัวของวัฒนธรรมเหล่านี้ถูกใช้เพื่อฉีดขวดสุดท้าย ( od600 nm = 0.1 ) ผสม 50 มิลลิลิตร ให้หนึ่งในสองที่ซับซ้อนสื่อ ( TB หรือปอนด์ ) หรือ semidefined ปานกลาง ( L-1 เกลือแกง 0.5 กรัม 1 G L-1 4 . 20 กรัม L-1 extract , 6 g L-1 na2hpo4 3 G L-1 kh2po4 30 กรัม 5 กรัมแน่นอนµ kanamycin L-1 = 1 mm MgSO4 ใ 1 µกรัมแน่นอนวิตามินบี 1 ml L-1 ธาตุโซลูชั่น ( feso4 2.8 กรัม L-1 mncl2 L-1 , 2 G , G L-1 CaCl2 2 cucl2 0.26 กรัม , L-1 znso4 0.3 กรัม , L-1 ) ในเครื่องปั่นที่ 180 รอบ / นาที รีคอมบิแนนท์โปรตีนที่แสดงออกเมื่อกระตุ้นด้วยการเพิ่มโปรตีน 1 มม. เมื่อ od600 nm ถึง 0.4-0.6 . วัฒนธรรมควบคุมซ้าย uninduced . จำนวนที่อายุแตกต่างกันหลายครั้ง หลังจากป้อน เซลล์ที่ถูกทำลาย และการแสดงออกของ reraii วิเคราะห์ในเศษส่วนได้ลงบนเจล SDS-PAGE 12% เปื้อนเหล่านี้น่าจะเป็นสดใสสีฟ้า