SDM is an in vitro procedure that u

SDM is an in vitro procedure that uses custom designed oligonucleotide primers to confer a desired mutation in a double-stranded DNA plasmid. Formerly, a method pioneered by Kunkel (Kunkel, 1985) that takes advantage of a strain deficient in dUTPase and uracil deglycosylase so that the recipient E. coli degrades the uracil-containing wild-type DNA was widely used. Currently, there are a number of commercially available kits that also require specific modification and/or unique E. coli strains (for example, the Phusion Site-Directed Mutagenesis® from Thermo and the GeneArt® system from Life). The most widely-used methods do not require any modifications or unique strains and incorporate mutations into the plasmid by inverse PCR with standard primers. For these methods, primers can be designed in either an overlapping (QuikChange®, Agilent) or a back-to-back orientation (Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit) (Figure 1). Overlapping primer design results in a product that will re-circularize to form a doubly-nicked plasmid. Despite the presence of these nicks, this circular product can be directly transformed into E. coli, albeit at a lower efficiency than non-nicked plasmids. Back-to-back primer design methods not only have the advantage of transforming non-nicked plasmids, but also allow exponential amplification to generate significantly more of the desired product (Figure 2). In addition, because the primers do not overlap each other, deletions sizes are only limited by the plasmid and insertions are only limited by the constraints of modern primer synthesis. Currently, by splitting the insertion between the two primers, insertions up to 100 bp can routinely be created in one step using this method.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

SDM เป็นกระบวนการเพาะเลี้ยงที่ใช้ไพรเมอร์ออก oligonucleotide เองประสาทกลายพันธุ์ต้องใน plasmid DNA ขนคู่ เดิม วิธีเป็นผู้บุกเบิก โดย Kunkel (Kunkel, 1985) ที่ใช้ประโยชน์จากการต้องใช้ขาดสารใน dUTPase และ uracil deglycosylase เพื่อให้ผู้รับ E. coli เสื่อม DNA ชนิดป่าประกอบด้วย uracil อย่างกว้างขวางใช้ ในปัจจุบัน มีจำนวนชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ที่ยัง ต้องปรับเปลี่ยนเฉพาะหรือเฉพาะ E. coli สายพันธุ์ (ตัวอย่าง การ Phusion Site-Directed Mutagenesis ®จากเทอร์โม) และระบบ GeneArt ®จากชีวิต วิธีการสุดใช้ไม่จำเป็นต้องปรับเปลี่ยนใด ๆ หรือสายพันธุ์เฉพาะ และรวมกลายพันธุ์เป็น plasmid ที่ โดยผกผัน PCR กับสังกะสี วัสดุมาตรฐาน สำหรับวิธีการเหล่านี้ ไพรเมอร์สามารถออกแบบในการซ้อนทับกัน (QuikChange ® Agilent) หรือแนวกลับไปกลับ (Q5® Site-Directed Mutagenesis ชุด) (รูปที่ 1) ผลการออกแบบพื้นทับซ้อนกันในตัวที่จะ circularize ใหม่กับแบบฟอร์มสองเหตุการณ์-nicked plasmid แม้สถานะของ nicks เหล่านี้ ผลิตภัณฑ์นี้ทรงกลมสามารถจะตรงแก่น E. coli แม้ว่าที่ประสิทธิภาพต่ำกว่าไม่ใช่ nicked plasmids วิธีการออกแบบกลับไปกลับพื้นไม่เพียงแต่มีข้อดีของการเปลี่ยนไม่ใช่ nicked plasmids ได้ยัง อนุญาตขยายเนนสร้างมากของผลิตภัณฑ์ที่ระบุ (รูปที่ 2) นอกจากนี้ เนื่อง จากไพรเมอร์ที่ไม่ทับซ้อนกัน ขนาดลบเท่านั้นถูกจำกัด โดย plasmid และแทรกจะถูกจำกัด โดยข้อจำกัดของการสังเคราะห์สมัยใหม่พื้นเท่านั้น ในปัจจุบัน โดยแบ่งแทรกระหว่างไพรเมอร์สอง แทรกถึง 100 bp เป็นประจำถูกสร้างขึ้นในขั้นตอนเดียวที่ใช้วิธีนี้ได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

SDM เป็นขั้นตอนในหลอดทดลองที่ใช้กำหนดเองที่ออกแบบไพรเมอร์ oligonucleotide เพื่อให้คำปรึกษาการกลายพันธุ์ที่ต้องการในพลาสมิดดีเอ็นเอเกลียวคู่ เดิมวิธีการบุกเบิกโดยเกิล (เกิล, 1985) ที่ใช้ประโยชน์จากสายพันธุ์ขาด dUTPase และ uracil deglycosylase เพื่อให้ผู้รับ E. coli ลดป่าชนิดดีเอ็นเอ uracil ที่มีใช้กันอย่างแพร่หลาย ปัจจุบันมีจำนวนของชุดสามารถใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ที่ยังต้องแก้ไขที่เฉพาะเจาะจงและ / หรือที่ไม่ซ้ำกัน E. coli สายพันธุ์ (เช่นเว็บไซต์ Phusion กำกับกลายพันธุ์®จากเทอร์โมและ GeneArt ®ระบบจากชีวิต) วิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายไม่จำเป็นต้องมีการปรับเปลี่ยนใด ๆ หรือสายพันธุ์ที่ไม่ซ้ำกันและรวมการกลายพันธุ์เป็นพลาสมิดโดยผกผัน PCR ด้วยไพรเมอร์มาตรฐาน สำหรับวิธีการเหล่านี้ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบทั้งในที่ทับซ้อนกัน (QuikChange ®, Agilent) หรือปฐมนิเทศกลับไปกลับ (Q5 ®เว็บไซต์กำกับกลายพันธุ์ Kit) (รูปที่ 1) ไพรเมอร์ที่ทับซ้อนกันในผลการออกแบบผลิตภัณฑ์ที่จะส่งจดหมายเวียนอีกครั้งในรูปแบบพลาสมิดทวีคูณ-แหว่ง แม้จะมีการแสดงตนของชื่อเล่นเหล่านี้ผลิตภัณฑ์วงกลมนี้สามารถเปลี่ยนโดยตรงใน E. coli, แม้ว่าที่มีประสิทธิภาพต่ำกว่าพลาสมิดที่ไม่แหว่ง Back-to-Back วิธีการออกแบบไพรเมอร์ไม่เพียง แต่มีประโยชน์จากการเปลี่ยนพลาสมิดที่ไม่จับ แต่ยังช่วยให้การขยายชี้แจงเพื่อสร้างอย่างมีนัยสำคัญมากขึ้นของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ (รูปที่ 2) นอกจากนี้เนื่องจากไพรเมอร์ไม่ได้ทับซ้อนกันขนาดลบจะถูก จำกัด ด้วยพลาสมิดและการแทรกจะถูก จำกัด ด้วยข้อ จำกัด ของการสังเคราะห์ไพรเมอร์ที่ทันสมัย ปัจจุบันโดยแยกการแทรกระหว่างสองไพรเมอร์แทรกถึง 100 bp ประจำสามารถถูกสร้างขึ้นในขั้นตอนเดียวโดยใช้วิธีการนี​​้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

SDM เป็นในขั้นตอนการใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบเอง ซึ่งจะหารือที่ต้องการการกลายพันธุ์ในคู่เกลียวดีเอ็นเอพลาสมิด เดิมที วิธีการบุกเบิกโดย คันเกิล ( คันเกิล , 1985 ) ที่ใช้ประโยชน์จากการขาด dutpase ยูราซิล deglycosylase และเพื่อให้ผู้รับเชื้ออีโคไลนี้ Name ของดีเอ็นเอที่มีการใช้กันอย่างแพร่หลาย ในปัจจุบันมีจำนวนของอุปกรณ์ที่สามารถใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ยังต้องปรับเปลี่ยนที่เฉพาะเจาะจงและ / หรือเฉพาะ E . coli สายพันธุ์ ( ตัวอย่างเช่น phusion เว็บไซต์กำกับการ®จากเทอร์โมและ GENEART ®ระบบจากชีวิต ) ที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย วิธีการ ไม่จําเป็นต้องมีการปรับเปลี่ยน หรือสายพันธุ์ที่ไม่ซ้ำกันและรวมลงในพลาสมิดดีเอ็นเอการกลายพันธุ์โดยผกผันกับวิธีมาตรฐานสำหรับวิธีการเหล่านี้ โดยสามารถออกแบบได้ทั้งกัน ( quikchange ® Agilent , ) หรือชนกันปฐมนิเทศ ( Q5 ®เว็บไซต์โดยตรงของชุด ) ( รูปที่ 1 ) ซ้อนผลออกแบบไพรเมอร์ในผลิตภัณฑ์ที่จะเป็น circularize แบบทวีคูณแหว่งพลาสมิด แม้จะมีการแสดงตนของบาดแผลนั้น ผลิตภัณฑ์นี้เป็นวงกลมสามารถแปลงโดยตรงลงใน E . coli ,แม้ว่าที่ประสิทธิภาพต่ำกว่า ไม่แหว่ง พลาส . หลังการออกแบบไพรเมอร์ไม่เพียง แต่มีประโยชน์ในการเปลี่ยนไม่แหว่ง พลาสมิด แต่ยังอนุญาตให้ขยายชี้แจงเพื่อสร้างกลุ่มของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ ( รูปที่ 2 ) นอกจากนี้ เพราะด้วยไม่ทับซ้อนกันขนาดลบเท่านั้น จำกัด โดยสายพันธุ์ใหม่และ จำกัด เฉพาะด้วยข้อจำกัดของการสังเคราะห์ primer ที่ทันสมัย ในปัจจุบัน โดยการแยกแทรกระหว่างสองไพรเมอร์ใหม่ถึง 100 BP สามารถตรวจถูกสร้างขึ้นในขั้นตอนเดียว โดยใช้วิธีนี้