2.7. RNA extraction and gene expres

2.7. RNA extraction and gene expression
Total RNA was extracted from ∼300 mg mucosal homogenate using a Nucleo Spin® RNA II Kit for Tissue (Nucleo Spin,
Macherey & Nagel, Düren, Germany) following the manufacturer’s instructions. Yield and quality of the extracts was
determined by measuring absorbance at 260 and 280 nm (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA). The ratio
of absorbance at 260/280 nm was between 1.8 and 2.0. Samples were diluted to 100 ng/l for gene expression analysis.
Marker genes for cell turnover (proliferating cell nuclear antigen, PCNA; caspase-3, CASP3), barrier function (intestinal alkaline
phosphatase, IAP), digestion (lactase-phlorizine hydrolase, LPH; sucrase-isomaltase, SUC; aminopeptidase-N, APN) and
sodium-dependent glucose transporter 1 (SGLT1) were analyzed by reverse-transcription quantitative PCR. Expression of
hypoxanthine phosphoribosyl-transferase I (HPRTI) and -actin were used as housekeeping genes for data normalization.
Quantitative real-time PCR was performed using the one step qRT-PCR master mix kit (Brilliant®II SYBR®Green, Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA). Each reaction consisted of 24 l master mix (8.13 l RNAse free H2O, 12.5 l SYBRII
RT-qPCR reaction buffer, 1.5 l of 10 M primers (Table 2), 0.37 l 500 × ROX) and 1 l template RNA. The amplification
was performed on a Stratagene MX3000p (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands) with general cycling conditions as
follows: one cycle of reverse transcription for cDNA synthesis at 50 ◦C for 30 min, one cycle of denaturation at 95 ◦C for
15 min, followed by 40 cycles with 30 s annealing at 60 ◦C and a 30 s extension at 72 ◦C. Primers were designed based
on published sequences of the above mentioned target genes in the pig using the NCBI online primer design tool at
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast (Table 2). Melt curves were checked to ensure correct amplification of a
single PCR product. The Ct values were converted to arbitrary units using standard curves based on serially diluted RNA and
were normalized using the mean arbitrary unit for the housekeeping genes.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.7 อาร์เอ็นเอยีนและสกัดนิพจน์อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจาก ∼300 mg homogenate mucosal ใช้หมุน Nucleo ®อาร์เอ็นเอสองชุดสำหรับเนื้อเยื่อ (Nucleo หมุนMacherey แอนด์ Nagel, Düren เยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ผลผลิตและคุณภาพของสารสกัดได้กำหนด โดยการวัด absorbance ที่ 260 และ 280 nm (NanoDrop เทคโนโลยี อิงค์ วิลมิ DE สหรัฐอเมริกา) อัตราส่วนของ absorbance ที่ 260/280 nm ได้ระหว่าง 1.8 และ 2.0 ตัวอย่างถูกทำให้เจือจางใน 100 ng/l สำหรับการวิเคราะห์ยีนนิพจน์ยีนเครื่องหมายสำหรับการหมุนเวียนเซลล์ (proliferating เซลล์นิวเคลียร์ตรวจหา PCNA; caspase-3, CASP3), ฟังก์ชันอุปสรรค (ลำไส้ด่างฟอสฟาเตส ให้), ย่อยอาหาร (lactase phlorizine hydrolase, LPH; sucrase isomaltase, SUC; aminopeptidase-N, APN) และขนส่งขึ้นอยู่กับโซเดียมกลูโคส 1 (SGLT1) ได้วิเคราะห์ โดยกลับ transcription PCR เชิงปริมาณ ค่าของhypoxanthine phosphoribosyl-transferase ฉัน (HPRTI) และ - แอกตินใช้เป็นยีนที่ทำความสะอาดสำหรับการฟื้นฟูข้อมูลทำ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์โดยใช้ชุดหลักผสมขั้นตอนเดียว qRT PCR (สีเขียวสดใส® II SYBR ® Agilentเทคโนโลยี ซานตาคลารา CA, USA) แต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วยส่วนผสมหลัก 24 l (8.13 l RNAse ฟรี H2O, 12.5 l SYBRIIRT-qPCR บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 10 M ไพรเมอร์ (ตาราง 2), 0.37 l 500 × ROX 1.5 l) และแบบ 1 l อาร์เอ็นเอ ขยายการทำตาม Stratagene MX3000p (Stratagene อัมสเตอร์ดัม ประเทศเนเธอร์แลนด์) กับเงื่อนไขทั่วไปขี่จักรยานเป็นดังต่อไปนี้: วงจรหนึ่งของราชบัณฑิตยสถานย้อนกลับสำหรับการสังเคราะห์ cDNA ที่ 50 ◦C สำหรับ 30 นาที วงจรหนึ่งของ denaturation ที่ 95 ◦C สำหรับ15 นาที ตาม ด้วยรอบ 40 กับ 30 s การอบเหนียวที่ 60 ◦C และนามสกุลเป็น s 30 ที่ 72 ◦C ไพรเมอร์ออกแบบตามในประกาศลำดับข้างต้นกล่าวถึงยีนเป้าหมายในการใช้เครื่องมือออกแบบพื้นที่ออนไลน์ NCBI ที่หมูhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast (ตารางที่ 2) ละลายเส้นโค้งถูกเลือกให้ขยายถูกต้องของการผลิตภัณฑ์ PCR เดียว ค่า Ct ได้แปลงหน่วยที่กำหนดโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานที่ใช้ในอาร์เอ็นเอ serially แตกออก และได้ตามปกติใช้กำหนดหน่วยหมายถึงยีนทำความสะอาด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 การสกัดอาร์เอ็นเอและการแสดงออกของยีน
รวม RNA ถูกสกัดจาก ~300 มิลลิกรัม homogenate เยื่อเมือกใช้ Nucleo Spin®อาร์เอ็นเอที่สองชุดสำหรับเนื้อเยื่อ (Nucleo ปั่น
Macherey และแจคกี้Düren, เยอรมนี) ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต ผลผลิตและคุณภาพของสารสกัดที่ถูก
กำหนดโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตรและ 280 (NanoDrop Technologies, Inc, วิลมิง, DE, สหรัฐอเมริกา) อัตราส่วน
ของการดูดกลืนแสงที่ 260/280 นาโนเมตรอยู่ระหว่าง 1.8 และ 2.0 ตัวอย่างที่ถูกลดลงเหลือ 100 นาโนกรัม / ลิตรสำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน.
ยีนเครื่องหมายสำหรับผลประกอบการมือถือ (proliferating เซลล์แอนติเจนนิวเคลียร์ PCNA; caspase-3, CASP3) ฟังก์ชั่นกั้น (อัลคาไลน์ลำไส้
phosphatase, IAP) การย่อยอาหาร (lactase-phlorizine hydrolase, LPH; sucrase-isomaltase, SUC; aminopeptidase-N, APN) และ
โซเดียมขึ้นอยู่กับการขนย้ายน้ำตาลกลูโคสที่ 1 (SGLT1) ได้รับการวิเคราะห์โดยการถอดรหัสย้อนกลับ PCR เชิงปริมาณ การแสดงออกของ
hypoxanthine phosphoribosyl-transferase ฉัน (HPRTI) และ -actin ถูกนำมาใช้เป็นยีนดูแลทำความสะอาดสำหรับข้อมูลการฟื้นฟู.
ปริมาณ PCR เรียลไทม์ได้รับการดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนเดียว qRT-PCR ต้นแบบชุดผสม (Brilliant®IISYBR®Green, Agilent
Technologies, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ปฏิกิริยาแต่ละประกอบด้วย 24 ลิตรผสมต้นแบบ (8.13 ลิตร RNase ฟรี H2O, 12.5 ลิตร SYBRII
RT-qPCR บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 1.5 ลิตร 10 M ไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) 0.37 ลิตร 500 × ROX) และ 1 ลิตรแม่แบบอาร์เอ็นเอ การขยาย
กำลังดำเนินการ Stratagene MX3000p (Stratagene, อัมสเตอร์ดัม, เนเธอร์แลนด์) โดยมีเงื่อนไขการขี่จักรยานทั่วไปเป็น
ดังนี้หนึ่งรอบของการถอดรหัสย้อนกลับสำหรับการสังเคราะห์ยีนที่ 50 ◦Cเป็นเวลา 30 นาทีซึ่งเป็นหนึ่งในวงจรของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 ◦Cสำหรับ
15 นาที ตามด้วย 40 รอบด้วยการอบ 30 วินาทีที่ 60 ◦Cและ 30 วินาทีส่วนขยายที่ 72 ◦C ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบตาม
การตีพิมพ์ในลำดับของยีนเป้าหมายดังกล่าวข้างต้นที่กล่าวถึงในสุกรโดยใช้เครื่องมือการออกแบบไพรเมอร์ออนไลน์ NCBI ที่
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast (ตารางที่ 2) เส้นโค้งละลายถูกตรวจสอบเพื่อให้แน่ใจว่าการขยายที่ถูกต้องของ
สินค้า PCR เดียว ค่า Ct เปลี่ยนหน่วยโดยพลการโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานขึ้นอยู่กับการปรับลดลำดับอาร์เอ็นเอและ
ถูกปกติโดยใช้ค่าเฉลี่ยสำหรับหน่วยพลยีนดูแลทำความสะอาด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . การสกัด DNA และ
การแสดงออกของยีนทั้งหมดซึ่งสกัดจาก∼ 300 มก. ( แยกโดยใช้นิวคลีโอปั่น®อาร์เอ็นเอ 2 ชุดสำหรับเนื้อเยื่อ ( นิวคลีโอปั่น
macherey &นาเกล , D üเรน , เยอรมนี ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ผลผลิตและคุณภาพของสารสกัดถูกกำหนดโดยวัดการดูดกลืนแสงที่
260 และ 280 nm ( nanodrop Technologies , Inc , Wilmington , DE , USA ) อัตราส่วน
ของการดูดกลืนแสงที่ 260 / 280 nm อยู่ระหว่าง 1.8 และ 2.0 จำนวนประมาณ 100 กรัม / ลิตร สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน ยีน
เครื่องหมายเซลล์การหมุนเวียน ( proliferating เซลล์นิวเคลียร์แอนติเจน PCNA ; การศึกษาลักษณะ casp3 , ) , อุปสรรคการทำงาน ( intestinal อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส
, , ( IAP ) การย่อยแลค phlorizine ไฮโดรเลส LPH ; ซูเครส , isomaltase SUC ;
aminopeptidase-n , APN ) และโซเดียมขึ้นอยู่กับกลูโคสขนย้าย 1 ( sglt1 ) วิเคราะห์ข้อมูลโดยการถอดความย้อนกลับเชิงปริมาณ PCR การแสดงออกของ
ไฮโปแซนทีน phosphoribosyl ทรานสเฟอเรส ( hprti ) และ - actin ซึ่งใช้แม่บ้านยีนสำหรับการฟื้นฟูข้อมูลเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์ .
ได้ดําเนินการโดยใช้หนึ่งในขั้นตอนที่ข้าพเจ้า PCR Master Mix Kit ( สดใส® II SYBR ®สีเขียว , Agilent
เทคโนโลยี ซานตาคลารา แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา )แต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วยต้นแบบผสม 24 L ( 8.13 ผมเลสฟรี H2O , 12.5 ลิตร sybrii
RT qpcr ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ 1.5 ลิตร 10 M ชนิด ( ตารางที่ 2 ) 0.37 ลิตร× Rox ) และ RNA Template 1 L . การเพิ่มปริมาณ
แสดงบน stratagene mx3000p ( stratagene , อัมสเตอร์ดัม , เนเธอร์แลนด์ ) กับสภาพจักรยานทั่วไป
ดังนี้ : 1 รอบย้อนกลับสำหรับการสังเคราะห์ cDNA ที่ถอดความ 50 ◦ C เป็นเวลา 30 นาที1 รอบ ( 95 ◦ C
15 นาที ตามด้วย 40 รอบ 30 S อบอ่อนที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส และ 30 ◦เป็นส่วนขยายที่ 72 ◦ C โดยออกแบบตาม
ในหัวข้อข้างต้นที่กล่าวถึงเป้าหมายลำดับของยีนในสุกร โดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบ ncbi ออนไลน์เครื่องมือ
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast ( ตารางที่ 2 ) ละลายเส้นถูกตรวจสอบเพื่อให้แน่ใจ การเพิ่มปริมาณที่ถูกต้องของ
ผลิตภัณฑ์ PCR เดียว CT มีค่าแปลงหน่วยหนึ่งโดยใช้มาตรฐานเป็นเส้นโค้งตามจำนวน RNA และ
เป็นปกติใช้หมายถึงหนึ่งหน่วยสำหรับ housekeeping ยีน