Qualitative and real-time quantitat

Qualitative and real-time quantitative RT-PCR
Total RNA was reverse transcribed to cDNA, using a QuantiTect Reverse
Transcription kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada), according to the manufacturer's
protocol. Briefly, 1 μg of template total RNA were submitted to genomic DNA removal
and reverse transcribed using an optimized mix of oligo-dT and random primers,
Quantiscript RT buffer, and reverse transcriptase.
For qualitative RT-PCR reactions, total RNA from different regions of the brain
(telencephalon/preoptic region, optic tectum-thalamus (including midbrain tegmentum),
hypothalamus, posterior brain including cerebellum and medulla) samples were
reverse transcribed, submitted to a PCR using specific primers (Table 1) and ran on a
1.5% agarose gel. Elongation factor 1α (EF1α) was used as an internal control. The goal
of this qualitative assay was to determine in which brain areas GnRH and orexin were
present. Based on our qualitative assays and on previous literature on fish GnRH (Lin
and Peter, 1997; Yu et al., 1998) and orexin (Miura et al., 2007; Suzuki et al., 2007),

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คุณภาพและเรียลไทม์เชิงปริมาณ RT-PCR
RNA รวมได้รับการถ่ายทอดกลับไป cDNA ใช้ quantitect กลับ
ถอดความชุด (QIAGEN, Mississauga, ON, แคนาดาการ) ตาม
โปรโตคอลของผู้ผลิต สั้น 1 ไมโครกรัมของแม่ RNA รวมถูกส่งไปกำจัดดีเอ็นเอจีโนม
และย้อนกลับถ่ายทอดการใช้ผสมที่ดีที่สุดของไพรเมอร์ Oligo-dt และสุ่ม
บัฟเฟอร์ RT quantiscript,และ reverse transcriptase
. เพื่อคุณภาพปฏิกิริยา RT-PCR, RNA รวมจากภูมิภาคต่างๆของสมอง
(telencephalon / ภูมิภาค preoptic, แก้วนำแสง tectum-ฐานดอก (รวม tegmentum สมองส่วนกลาง)
มลรัฐสมองหลังรวมทั้งสมองและไขกระดูก) ตัวอย่างได้
ย้อนกลับคัดลอกคำสั่งส่งไปยัง PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง (ตารางที่ 1) และวิ่งบน
1.5% เจล agaroseยืดปัจจัย1α (ef1α) ถูกใช้เป็นระบบการควบคุมภายใน เป้าหมายของ
ทดสอบคุณภาพนี้คือการตรวจสอบในพื้นที่ที่สมอง gnrh และ orexin มี
ปัจจุบัน ขึ้นอยู่กับการตรวจคุณภาพของเราและในวรรณคดีก่อน gnrh ปลา (lin
และปีเตอร์, 1997. yu, et al, 1998) และ orexin (miura et al, 2007;.. suzuki et al, 2007)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เวลาจริง และเชิงคุณภาพเชิงปริมาณ RT-PCR
อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกย้อนทับศัพท์กับ cDNA ใช้กลับ QuantiTect
ชุด Transcription (Qiagen, Mississauga, ON แคนาดา), ตามของผู้ผลิต
โพรโทคอลการ สั้น ๆ μg 1 ของอาร์เอ็นเอรวมแม่ส่งมาที่ genomic DNA เอา
ทับศัพท์โดยใช้การผสมผสานให้เหมาะ oligo dT และไพรเมอร์แบบสุ่ม ย้อนกลับและ
บัฟเฟอร์ Quantiscript RT transcriptase กลับได้
สำหรับเชิงคุณภาพปฏิกิริยา RT-PCR อาร์เอ็นเอจากภูมิภาคที่แตกต่างกันของสมองทั้งหมด
(telencephalon/preoptic ภูมิภาค ทาลาแก้ว tectum-มัส (รวมทั้งสมองส่วนกลาง tegmentum),
hypothalamus สมองหลังซีรีเบลลัมและ medulla) ตัวอย่างดี
กลับทับศัพท์ ส่ง PCR ที่ใช้ไพรเมอร์เฉพาะ (ตารางที่ 1) และวิ่งบน a
1.5% agarose เจ Elongation ปัจจัย 1α (EF1α) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมภายใน เป้าหมาย
ของนี้วิเคราะห์เชิงคุณภาพเป็นการ กำหนดในสมองซึ่งมีพื้นที่บางส่วนและ orexin
ปัจจุบัน ตาม assays เชิงคุณภาพของเรา และ ตามวรรณกรรมก่อนหน้านี้ปลาบางส่วน (Lin
และ ปีเตอร์ 1997 Yu et al., 1998) และ orexin (มิอุระ et al., 2007 ซูซูกิเอส al., 2007),

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในเชิง คุณภาพ และแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ Rt - pcr
rna รวมเป็นที่ถอดสคริปต์แล้วการ cdna โดยใช้ quantitect ย้อนกลับการถอดสคริปต์
ชุด( qiagen Mississauga ในประเทศแคนาดา)ที่ตาม' smanufacturer
โปรโตคอลที่ให้ทำย้อนลำดับขั้นตอนข้างต้น เวลาสั้นๆ 1 ไมโครกรัมของเทมเพลต rna รวมถึงการส่งดีเอ็นเอ genomic
และถอดสคริปต์ย้อนกลับด้วยการผสมผสานที่ได้รับของ primers oligo - DT และสุ่มบัฟเฟอร์ Rt
quantiscriptและย้อนกลับ transcriptase .
สำหรับในเชิง คุณภาพ Rt - pcr ปฏิกิริยา,รวม rna จากพื้นที่ของที่สมอง
( telencephalon / preoptic ภูมิภาค ,ออปติก tectum - thalamus (รวมถึง midbrain tegmentum ),
hypothalamus ,ก้นสมองรวมถึง cerebellum และ medulla )ตัวอย่างมี
ย้อนกลับถอดสคริปต์,ส่งไปที่ pcr การใช้ primers (ตารางที่ 1 )และวิ่งไปบน
1.5% agarose เจล.ปัจจัย elongation 1 กล้อง( EF 1 กล้อง)ได้เคยถูกใช้เป็นการควบคุม ภายใน เป้าหมายที่จะสอบในเชิง คุณภาพ ของ
ซึ่งจะช่วยเป็นการกำหนดในสมองที่ orexin และ gnrh
ซึ่งจะช่วยเป็นปัจจุบัน ที่ใช้ assays เชิง คุณภาพ ของเราและในเอกสารก่อนหน้าในปลา gnrh ( LIN
และปีเตอร์ 1997 , Yu Garden , et al . 1998 )และ orexin ( miura et al . 2007 Suzuki et al . 2007 )