Discussion
Gibberellins are involved in multiple aspects of growth
and development, including stem elongation, seed maturation
and germination, floral induction, pollen germination,
and pollen tube growth [3,7,10,36]. In grapevine,
the effects of GA application on berry enlargement, the
induction of seedlessness in seeded cultivars and ripening
have been the subject of study for quite some time
[17,19,37-39]. Interestingly, we have previously demonstrated
that the exogenous pre-bloom application of GA3
inhibited berry growth in seeded ‘Kyoho’ and ‘Red Globe’
cultivars, yet stimulated berry growth in ‘Thompson
Seedless’ [17]. Similarly, it has also been shown that
berry growth was inhibited in the seeded grape cultivar
‘Emperador’ and promoted in the seedless cultivar
‘Emperatriz’ upon GA3 application [22]. Therefore, we
supposed that whether the exogenous pre-bloom application
of GA3 to grape inflorescences stimulates berry
Figure 8 Pathways controlled by genes exhibiting alterations in their expression levels after GA3 treatment. Numbers on the color bar
indicate -log (P value), where P value represents the significance. P value ≤0.05.
Cheng et al. BMC Genomics (2015) 16:128 Page 11 of 16
production may be cultivar-dependent. Here, we confirm
that the exogenous pre-bloom application of GA3
to ‘Kyoho’ inflorescences promotes flower opening
(Figure 2A-F), fruit coloring (Figure 2G-I), and seed
abortion (Figure 2J). To advance our understanding of
these GA-induced responses in grape, we carried out
RNA-Seq transcriptome analysis of grape flowers and
compared results between GA3-treated and untreated
samples.
In order to determine the appropriate time points following
GA3 treatment at which our RNA-Seq analysis should
be conducted, we assayed the gibberellin content in GA3-
treated and untreated flowers and found that levels were
elevated between 1 h and 24 h post-treatment, and then
dropped 72 h following application (Figure 3). These results
were consistent with previous findings in which GA3 application
was found to substantially increase berry GA content
for 24 h and then dropped to levels that were similar to
untreated controls 3 days post-treatment [20]. It has been
shown that the uptake percentage for GA3 was approximately
6.8% 24 h after GA3 application [40]. Therefore, we
speculate that the observed increase in GA content in GA3-
treated tissues stemmed from GA3 treatment. As a result of
these findings, we collected our GA3-treated/untreated
flower samples for RNA isolation and subsequent transcriptome
analysis 1 h and 24 h following treatment.
In each case, approximately 80% of the obtained reads
could be assigned to grape genes and were used for gene
expression profiling (Additional file 1: Table S2). The
robustness of this RNA-Seq dataset was revealed by the
high correlation observed among biological replicates
(Additional file 1: Table S3), while the very close
consistency between relative expression levels obtained
with RNA-Seq and qRT-PCR (Figure 7; Additional file 2:
Figure S5) indicates the legitimacy of both sets of results.
We detected 1975 and 2713 DEGs in grape flowers 1 h
and 24 h following application with GA3, respectively
(Figure 4A), indicating that the alterations in grape inflorescence
morphology noted following GA3 treatment
are likely mediated through modifications in genomic
expression profiles. The multiplicity of GO categories
found to be enriched in GA3-treated tissues (Figure 5;
Additional file 1: Table S4) hints at the complexity of the
response.
In this study, at both 1 h and 24 h following GA3 treatment,
up-regulated genes tended to fall into categories
encompassing cellular, protein modification and catabolic
processes, as well as multicellular organismal development
and reproduction (Figure 5; Additional file 1: Table S4).
Furthermore, many post-GA3 treatment DEGs were found
to be involved in various aspects of flower, fruit and embryonic
development, as well as pollination and cell death
(Additional file 1: Table S5). These processes correspond
well with observed morphological alterations that occur
following the application of GA3, including the promotion
of flower opening (Figure 2A-F) and fruit coloring
(Figure 2G-I), as well as the induction of seed abortion
(Figure 2J). In addition, we identified many DEGs that
are involved in various biochemical pathways, including
those comprising the biosynthesis or degradation of
diverse metabolites including hormones, sugars and
polysaccharides, amino acids, fatty acids and lipids, and secondary
metabolites (Figure 8; Additional file 1: Table S10).
These findings imply that GA3 application to grape flowers
has a fairly comprehensive impact on their metabolism.
Plant hormones regulate essentially all physiological
and developmental processes during a plant’s life cycle.
These structurally diverse compounds include abscisic
acid, auxins, brassinosteroids, cytokinins (CTKs), GAs,
ethylene, and jasmonates (JAs) [41]. In the present
study, the expression of many genes involved in the biosynthesis
of jasmonic acid, salicylic acid, ethylene and
gibberellin, as well as the degradation of cytokinins, were
significantly altered following GA3 application (Figure 8,
Additional file 1: Table S10). Genes involved in jasmonic
acid biosynthesis were up-regulated 1 h after GA3
treatment and down-regulated 24 h post-application
(Additional file 2: Figure S6). It has been found previously
that GA promotes the expression of jasmonate
(JA) biosynthetic genes and induces JA accumulation
in flowers [42,43], which correlates well with our results.
Since it has been demonstrated that both GA
and JA play important roles during stamen development
[44-48], it is possible that at least some aspects
of the floral/reproductive alterations apparent in grape
following GA3 application are the result of increased
levels of JA. Similarly, we found that five cytokinin oxidase/dehydrogenase
(CKX) genes, which encode enzymes
that are responsible for the breakdown of cytokinins
[49,50], were substantially up-regulated 24 h following
GA3 application (Additional file 2: Figure S9). Since cytokinins
play a role in gynoecia and fruit morphogenesis and
patterning [51], embryonic and post-embryonic growth
and development [52-54], and can also have an effect on
seed number [50], it is likely that a reduction in their levels
would interfere with seed development, and thus may be
involved in GA3-induced seedlessness (Figure 2J).
Conversely, we found that 24 h following GA3 treatment,
several genes with involvement in ethylene biosynthesis
(ACSs, GSVIVG0102696200, GSVIVG01005455001
and GSVIVG01019920001) were down-regulated
(Additional file 2: Figure S8), which may result in a reduction
in ethylene production flowers. Intriguingly,
ethylene plays important functions in tissue differentiation,
initiation of flowering, anthocyanin synthesis,
floral opening and senescence, pollination and fruit
ripening [55]. In particular, ethylene is known to delay
flowering by repressing GA levels [56]. Therefore, it is
Cheng et al. BMC Genomics (2015) 16:128 Page 12 of 16
feasible that GA3-induced premature floral opening
may be related to the down-regulation of ethylene biosynthetic
genes.
In terms of effects of GA3 application on the biosynthesis
of this hormone itself, we found that the majority of
GA20ox and GA3ox genes, which catalyze the penultimate
and final steps, respectively, in the formation of bioactive
GAs (GA1 and GA4) [7,8], were down-regulated following
application of GA3 (Figure 1C; Additional file 1: Table S8).
In contrast, the genes encoding GA2ox (GSVIVG01021468
00 and GSVIVG01028169001) were up-regulated following
GA treatment (Figure 1C; Additional file 1: Table S8). Both
of these findings correspond well with previous studies
[7,8,57-59]. These data suggest that feedback regulation
may control the concentration of active GAs after exogenous
GA3 application, which could have an effect on the
response of grape flowers to this hormone.
GA signaling is now understood to hinge on DELLA
proteins, which in the absence of GA negatively regulate
GA response genes [15,60]. In the presence of GA,
which binds to the GID1 receptor, interaction is enabled
between GID1 and DELLA proteins, which causes the
subsequent degradation of the latter. It has been found
previously that genes encoding GA receptors and
DELLA proteins were down-regulated and up-regulated,
respectively, following GA treatment [57,61], which
agrees with our results (Figure 1B-C; Additional file 1:
Table S8).
In addition, we also found that 157 (7.7% of total DEGs)
and 175 (7.23% of total DEGs) DEGs 1 h and 24 h after
GA3 treatment, respectively, encoded transcription factors.
Members of the AP2/EREBP transcription factor family
made up the majority of these DEGs, followed by members
of MYB, bHLH, WRKY, NAC, and ARF families
(Figure 6; Additional file 2: Figure S4; Additional file 1:
Table S9). Since transcription factors play essential
roles in the regulatory networks of many developmental
processes, it is probable that the alterations in their
levels play a role in the observed morphological
changes associated with GA3 application in grape.
Interestingly, in this study, venn diagram analysis
(Figure 4B) displayed six simultaneously down-regulated
genes at both 1 h and 24 h following GA3 application.
One of these six genes that was very significantly
down-regulated at both time points was a Pelota gene
(Additional file 3: Table S7), which was originally identified
in Drosophila melanogaster and is known to function
in meiosis [62]. In mouse, it has been reported that
disruption of the Pelota gene causes early embryonic
lethality and defects in cell cycle progression [63], and in
plants, a single homologue has been identified in Arabidopsis
[64]. Due to its known role in meiosis, it is highly
possible that reduction of Pelota expression in grape could
be related to GA3-induced seedlessness (Figure 2J).
สนทนาGibberellins เกี่ยวข้องในหลายด้านของการเจริญเติบโตและการ พัฒนา รวมถึงก้าน elongation เมล็ดแก่และ การงอก เหนี่ยวนำดอกไม้ การงอกของละอองเกสรและเจริญเติบโตของละอองเกสรหลอด [3,7,10,36] ใน grapevineผลของโปรแกรมประยุกต์ GA ในเบอร์รี่ขยาย การเหนี่ยวนำของ seedlessness พันธุ์ seeded และ ripeningมีเรื่องการศึกษาสำหรับค่อนข้างบางเวลา[17,19,37-39] เป็นเรื่องน่าสนใจ มีก่อนหน้านี้ว่าที่บ่อยบลูมก่อนใช้ GA3เติบโตรี่ห้าม seeded 'Kyoho' และ 'แดงโลก'พันธุ์ ยังถูกกระตุ้นเติบโตเบอร์รี่ ' ทอมป์สันไร้เมล็ดของ [17] ในทำนองเดียวกัน จะมีการแสดงที่เติบโตรี่ถูกห้ามใน cultivar องุ่น seeded'เอ็ม ' เพราเดอร์ และเลื่อนขึ้นใน cultivar ไร้เมล็ด'Emperatriz' เมื่อใช้ GA3 [22] ดังนั้น เราควรที่ว่าแอพลิเคชันบลูมก่อนบ่อยของ GA3 กับช่อองุ่นเขียวกระตุ้นเบอร์รี่ตัวเลข 8 หลักที่ควบคุม โดยยีนอย่างมีระดับเปลี่ยนแปลงในระดับของนิพจน์หลังรักษา GA3 ตัวเลขบนแถบสีระบุ - ล็อก (P value), ซึ่งค่า P แทนความสำคัญด้วย P ค่า ≤0.05Al. ร้อยเอ็ดเฉิง BMC Genomics 16:128 (2015) หน้า 11 16ผลิตได้ขึ้นอยู่กับ cultivar เรายืนยันที่นี่ที่บ่อยบลูมก่อนใช้ GA3การช่อเขียว 'Kyoho' ส่งเสริมการเปิดดอก(รูปที่ 2A-F), ผลไม้สี (รูปที่ 2G-ฉัน), และทำแท้ง (รูป 2J) ความเข้าใจของเราล่วงหน้าเหล่านี้เกิดจาก GA ตอบในองุ่น เราดำเนินการอาร์เอ็นเอลำดับการวิเคราะห์ transcriptome ของดอกไม้องุ่น และเปรียบเทียบผลระหว่าง รับ GA3 และไม่ถูกรักษาตัวอย่างการเพื่อกำหนดจุดเวลาที่เหมาะสมต่อไปนี้รักษา GA3 ที่ควรวิเคราะห์ลำดับอาร์เอ็นเอของเราให้เราดำเนินการ assayed เนื้อหา gibberellin ใน GA3ถือว่าไม่ถูกรักษาดอกไม้ และพบว่า ระดับได้ยกระดับระหว่างรักษาหลัง 24 ชม และ 1 h แล้วลดลง 72 h ต่อแอพลิเคชัน (รูปที่ 3) ผลลัพธ์เหล่านี้ได้สอดคล้องกับการค้นพบก่อนหน้านี้ในโปรแกรมประยุกต์ที่ GA3พบการเพิ่มเนื้อหา GA เบอร์รี่ใน 24 ชม และลดลงแล้ว ระดับที่คล้ายคลึงกับตัวควบคุมไม่ถูกรักษา 3 วันหลังการรักษา [20] จะได้รับแสดงว่า เปอร์เซ็นต์การดูดซับสำหรับ GA3 เป็นประมาณ6.8% 24 ชมหลังจากใช้ GA3 [40] ดังนั้น เราคาดการณ์ที่พบเพิ่มเนื้อหา GA ใน GA3ถือว่าดังจาก GA3 รักษาเนื้อเยื่อ เป็นผลมาจากค้นพบเหล่านี้ เรารวบรวมของ GA3-ปฏิบัติ/ไม่ถูกรักษาตัวอย่างดอกไม้แยกอาร์เอ็นเอและ transcriptome ต่อมาวิเคราะห์ 1 h และ h ตามรักษา 24ในแต่ละกรณี ประมาณ 80% ของผู้อ่านได้รับสามารถใช้กับองุ่นยีน และใช้สำหรับยีนสร้างโพรไฟล์นิพจน์ (เพิ่มเติมไฟล์ 1: S2 ตาราง) ที่เสถียรภาพของชุดข้อมูลลำดับอาร์เอ็นเอนี้ถูกเปิดเผยโดยสังเกตระหว่างชีวภาพเหมือนกับความสัมพันธ์ที่สูง(เพิ่มเติมไฟล์ 1: S3 ตาราง), ในขณะอีกมากความสอดคล้องระหว่างระดับสัมพัทธ์นิพจน์ที่ได้รับอาร์เอ็นเอลำดับและ qRT-PCR (รูปที่ 7 แฟ้มเพิ่มเติม 2:รูป S5) บ่งชี้ว่า ชอบธรรมทั้งสองชุดของผลลัพธ์เราตรวจพบ 1 h ดอกไม้ 1975 และ 2713 DEGs ในองุ่น24 ชมตามแอพลิเคชันกับ GA3 ตามลำดับ(รูปที่ 4A), ซึ่งบ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงทาง inflorescence องุ่นสัณฐานวิทยากล่าวต่อไปนี้รักษา GA3มี mediated มักผ่านการปรับเปลี่ยนใน genomicส่วนกำหนดค่าของนิพจน์ มากมายหลายหลากประเภทไปพบว่าอุดมไปใน GA3 ถือว่าเนื้อเยื่อ (รูปที่ 5แฟ้มเพิ่มเติม 1: S4 ตาราง) คำแนะนำที่ความซับซ้อนของการตอบสนองในการศึกษานี้ 1 h และ 24 ชมต่อการรักษา GA3ยีนที่กำหนดขึ้นมีแนวโน้มที่จะ ตกอยู่ในประเภทท่านปรับเปลี่ยนโปรตีนเซล และ catabolicกระบวนการ ตลอดจนพัฒนาสิ่ง organismalและการทำซ้ำ (รูปที่ 5 แฟ้มเพิ่มเติม 1: S4 ตาราง)นอกจากนี้ หลายโพสต์ GA3 รักษา DEGs พบการมีส่วนร่วมในด้านต่าง ๆ ของดอกไม้ ผลไม้ และตัวอ่อนพัฒนา เป็น pollination และเซลล์ตาย(เพิ่มเติมไฟล์ 1: S5 ตาราง) กระบวนการเหล่านี้สอดคล้องดีสังเกตของการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นต่อไปนี้ใช้ GA3 รวมโปรโมชั่นเปิด (รูปที่ 2A-F) ดอกไม้และผลไม้ที่ระบายสี(รูปที่ 2G-ฉัน), และเหนี่ยวนำเมล็ดทำแท้ง(2J รูป) นอกจากนี้ เราระบุ DEGs หลายที่มีส่วนร่วมในหลักชีวเคมีต่าง ๆ รวมทั้งผู้ประกอบด้วยการสังเคราะห์หรือสลายตัวของmetabolites ที่หลากหลายรวมถึงฮอร์โมน น้ำตาล และpolysaccharides กรดอะมิโน กรดไขมัน และโครงการ และรองmetabolites (รูปที่ 8 แฟ้มเพิ่มเติม 1: S10 ตาราง)ผลการวิจัยเหล่านี้เป็นสิทธิ์แบบประยุกต์ GA3 ที่ดอกไม้องุ่นมีผลกระทบค่อนข้างครอบคลุมในการเผาผลาญฮอร์โมนพืชควบคุมหลักทั้งหมดสรีรวิทยาและวงจรของกระบวนการพัฒนาในช่วงชีวิตของพืชสารเหล่านี้มีความหลากหลาย structurally รวมแอบไซซิกกรด auxins, brassinosteroids, cytokinins (CTKs), ก๊าซเอทิลีน และ jasmonates (โรงแรม) [41] ในปัจจุบันศึกษา ค่าของยีนจำนวนมากที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์กรดจัสโมนิก กรดซาลิไซลิ เอทิลีน และgibberellin ตลอดจนการสลายตัวของ cytokinins ถูกเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญต่อ GA3 แอพลิเคชัน (รูปที่ 8แฟ้มเพิ่มเติม 1: S10 ตาราง) ยีนที่เกี่ยวข้องกับจัสโมนิกการสังเคราะห์กรดมี h 1 กำหนดขึ้นหลังจาก GA3รักษาและควบคุมลง 24 ชมหลังสมัคร(เพิ่มเติมไฟล์ 2: S6 รูป) มันถูกค้นพบก่อนหน้านี้นิพจน์ของ jasmonate ส่งเสริมว่า GAยีน biosynthetic (JA) และจะสะสมก่อให้เกิดในดอกไม้ [42,43], ซึ่งคู่กับผลของเราเนื่องจากการแสดงที่ทั้ง GAและจะมีบทบาทสำคัญในระหว่างการพัฒนา stamen[44-48], มันเป็นไปได้ที่ลักษณะบางอย่างอย่างไรดอกไม้/สืบพันธุ์ปรากฏในองุ่นเพิ่มโปรแกรมประยุกต์เป็นผลของ GA3 ต่อไปนี้ระดับของ JA ในทำนองเดียวกัน เราพบว่าห้า cytokinin oxidase/dehydrogenaseยีน (CKX) การเข้ารหัสเอนไซม์ที่รับผิดชอบการแบ่งของ cytokinins[49,50], ถูกมากขึ้นควบคุม 24 ชมต่อไปนี้ใช้ GA3 (เพิ่มเติมไฟล์ 2: S9 รูป) ตั้งแต่ cytokininsบทบาทใน morphogenesis gynoecia และผลไม้ และเจริญเติบโตของตัวอ่อน และตัวอ่อนภายหลัง patterning [51]และการพัฒนา [52-54], และยังสามารถมีผลในจำนวนเมล็ด [50], ก็มีแนวโน้มที่ลดลงในระดับของพวกเขาจะรบกวนการพัฒนาเมล็ด และดังนั้น อาจจะเกี่ยวข้องในการเกิด GA3 seedlessness (รูป 2J)ในทางกลับกัน เราพบว่า 24 ชมต่อการรักษา GA3ยีนหลายกับการมีส่วนร่วมในการสังเคราะห์เอทิลีน(ACSs, GSVIVG0102696200, GSVIVG01005455001และ GSVIVG01019920001) มีกำหนดลง(เพิ่มเติมไฟล์ที่ 2: รูป S8), ซึ่งอาจส่งผลให้ลดในดอกไม้ผลิตเอทิลีน Intriguinglyเอทิลีนเล่นฟังก์ชั่นที่สำคัญในการสร้างความแตกต่างของเนื้อเยื่อเริ่มต้นของเวอร์ริ่ง มีโฟเลทสูงสังเคราะห์ลายดอกไม้เปิด และ senescence, pollination และผลไม้ripening [55] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เอทิลีนเป็นที่รู้จักกันความล่าช้าฟลาวเวอร์ริ่ง โดย repressing ระดับ GA [56] ดังนั้น จึงเป็นAl. ร้อยเอ็ดเฉิง BMC Genomics ของ 16 หน้า (2015) 16:128เป็นไปได้ที่ GA3 ที่เกิดก่อนวัยดอกไม้เปิดอาจเกี่ยวข้องกับระเบียบลงของเอทิลีน biosyntheticยีนในแง่ของผลของ GA3 แอพลิเคชันในการสังเคราะห์ฮอร์โมนนี้เอง เราพบว่าส่วนใหญ่GA20ox และ GA3ox ยีน ซึ่งสถาบัน penultimateและสุดท้ายขั้น ตอน ลำดับ ในการก่อตัวของกรรมการกก๊าซ (GA1 และ GA4) [7,8], ได้ลงระเบียบดังต่อไปนี้โปรแกรมประยุกต์ของ GA3 (รูปที่ 1C แฟ้มเพิ่มเติม 1: S8 ตาราง)ในทางตรงข้าม ยีนเข้ารหัส GA2ox (GSVIVG0102146800 และ GSVIVG01028169001) ได้ตั้งระเบียบดังต่อไปนี้GA รักษา (รูปที่ 1C แฟ้มเพิ่มเติม 1: S8 ตาราง) ทั้งสองอย่างสิ่งเหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้[7,8,57-59] . ระเบียบที่ติชมแนะนำข้อมูลเหล่านี้สามารถควบคุมความเข้มข้นของแก๊สที่ใช้งานอยู่หลังบ่อยใช้ GA3 ซึ่งสามารถมีผลในการตอบดอกไม้องุ่นฮอร์โมนนี้ตอนนี้ความเข้าใจสัญญาณ GA กับบานพับเดลลาโปรตีน ซึ่งในการขาดงานของ GA ส่งควบคุมGA ตอบยีน [15,60] ในต่อหน้าของ GAซึ่ง binds กับตัวรับ GID1 โต้ตอบได้ระหว่างโปรตีน GID1 และเดลลา ซึ่งทำให้เกิดการสลายตัวที่ตามมาของหลัง มีการพบก่อนหน้านี้ยีนที่เข้ารหัส GA receptors และเดลลาโปรตีนถูก ควบคุมลง และขึ้น ควบคุมต่อ GA รักษา [57,61], ตามลำดับ ซึ่งตกลงกับผลของเรา (รูปที่ 1B-C แฟ้มเพิ่มเติม 1:ตาราง S8)นอกจากนั้น เรายังพบว่า 157 (7.7% ของ DEGs รวม)h DEGs 1 (7.23% DEGs รวม) และ 175 และ 24 ชมหลังจากรักษา GA3 ตามลำดับ เข้ารหัส transcription ปัจจัยสมาชิกของครอบครัวปัจจัย transcription AP2/EREBPทำค่า DEGs เหล่านี้ ตามหลังสมาชิกส่วนใหญ่ของครอบครัว MYB, bHLH, WRKY เอ็นเอซี และ ARF(รูปที่ 6 แฟ้มเพิ่มเติม 2: S4 รูป แฟ้มเพิ่มเติม 1:ตาราง S9) เนื่องจากปัจจัยการ transcription เล่นจำเป็นบทบาทในการกำกับดูแลเครือข่ายของพัฒนากระบวนการ มันเป็นความน่าเป็นที่เปลี่ยนแปลงในการระดับมีบทบาทในการสังเกตของเปลี่ยนแปลงที่สัมพันธ์กับใบสมัคร GA3 ในองุ่นเป็นเรื่องน่าสนใจ ในการศึกษานี้ วิเคราะห์แผนภาพเวนน์(รูปที่ 4B) แสดง 6 พร้อมลงควบคุมยีน 1 h และ h 24 ต่อโปรแกรมประยุกต์ GA3ยีนเหล่านี้หกที่มากอย่างมีนัยสำคัญอย่างใดอย่างหนึ่งควบคุมลงที่จุดทั้งสองครั้งถูกยีน Pelota(เพิ่มเติมไฟล์ 3: S7 ตาราง), ซึ่งมีการระบุไว้แต่เดิมในแมลงวันทอง และเป็นที่รู้จักกันทำงานในไมโอซิส [62] ในเมาส์ มีรายงานที่ทรัพยยีน Pelota ทำให้ช่วงตัวอ่อนlethality และข้อบกพร่อง ในวงจรเซลล์ก้าวหน้า [63], และมีการระบุพืช homologue เดียวใน Arabidopsis[64] เนื่องจากบทบาทของมันรู้จักในไมโอซิส เป็นอย่างมากสุดที่สามารถลด Pelota นิพจน์ในองุ่นจะเกี่ยวข้องกับ GA3 เกิด seedlessness (รูป 2J)
การแปล กรุณารอสักครู่..
