Partial purification of lysozymeFor

Partial purification of lysozyme
For the partial purification of lysozyme, egg whites,
carefully separated from the egg yolks, were diluted 3- or
3.3-fold with 0.05 M NaCl solution. To precipitate the egg
white proteins other than lysozyme, the pH of this
mixture was set to 4.0 by carefully adding several drops
of 1 N acetic acid and it was diluted with an equal volume
of 40%, 60%, or 80% (v/v) ethanol. After 0-, 2-, 4-, 6-
, 7-, or 8-h incubation at room temperature in the
presence of different concentrations of ethanol, the
mixtures were centrifuged at 15,000 x g for 15 min at 4
°C; then the precipitates were discarded. The
supernatants were analyzed for their lysozyme activity
and protein content to determine the effects of different
procedures on the efficiency of partial purification.
Dialysis and lyophilization of partially purified
lysozyme
The lyophilized lysozymes were obtained by using
supernatants from centrifugation of ethanol-treated
(40%, 60%, or 80%) and 6-h (or 7-h) incubated
samples. Before lyophilization, the supernatants
containing lysozyme were dialyzed for 21 h at 4 °C by 3
changes of 2000 ml of distilled water. Lyophilization was
applied by a freeze drier (Labconco, FreeZone, 6 liter,
Kansas City, MO, USA) with –44 to –47 °C collector
temperature, and 50 x 10-3 and 100 x 10-3 mbar vacuum.
The sample container volume was 2-3 times the sample
volume. The lyophilized enzymes were kept at –18 °C
until they were used in different studies.
Protein content and enzyme activity of lyophilized
partially purified lysozymes
The protein content and residual enzyme activity of
lyophilized enzymes were determined by dissolving 20
mg of lyophilized preparation in 10 ml of distilled water.
After centrifugation at 15 000 x g for 15 min at 4 °C, the
residual lysozyme activity and protein content of the
enzyme preparations were determined by the methods
given below. Protein content was expressed as mg
protein per mg of powder, while enzyme activity was
expressed as U per mg of powder or protein.
Thermal stability of lyophilized partially purified
lysozyme
Thermal inactivation studies were conducted at 60,
70, 80, and 90 °C with thermal inactivation time (TIT)
tubes (i.d.: 9 mm; wall thickness: 1 mm). To minimize
the lag phase, TIT tubes were heated to inactivation
temperature. Then, 0.2 ml of the enzyme solution was
prepared by dissolving lyophilized lysozyme in 0.05 M
Na-phosphate buffer (pH 7.0), which was then pipetted
into the TIT tubes. After heating for a given period the
tubes were cooled in an ice water bath and their contents
were immediately assayed for residual lysozyme activity.
The calculation of heat inactivation parameters of
lysozyme was conducted by applying the standard
methods that explain enzyme and microbial inactivation
kinetics by a first order reaction (Holdsworth, 1997).
The heat inactivation curves were formed by plotting log
of percent remaining activity vs. heating time (min). The
inactivation rate constants (k min-1) were calculated by
multiplying the slope of the heat inactivation curves by
the factor of 2.303. The half-lives (t1/2, min), which refer
to the heating time at constant temperature to achieve
50% inactivation of the enzyme, were calculated from
the formula t1/2 = ln (0.5) k-1. The decimal reduction
times (D, min), which refer to the heating time at
constant temperature to achieve 90% inactivation of the
enzyme, were calculated from the negative reciprocals of
the slopes of the heat inactivation curves. The z values
(°C) that show the temperature dependency of heat
inactivation was calculated from the equation z = T2-
T1/log (D1/D2), where T is temperature (°C).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Partial purification of lysozymeFor the partial purification of lysozyme, egg whites,carefully separated from the egg yolks, were diluted 3- or3.3-fold with 0.05 M NaCl solution. To precipitate the eggwhite proteins other than lysozyme, the pH of thismixture was set to 4.0 by carefully adding several dropsof 1 N acetic acid and it was diluted with an equal volumeof 40%, 60%, or 80% (v/v) ethanol. After 0-, 2-, 4-, 6-, 7-, or 8-h incubation at room temperature in thepresence of different concentrations of ethanol, themixtures were centrifuged at 15,000 x g for 15 min at 4°C; then the precipitates were discarded. Thesupernatants were analyzed for their lysozyme activityand protein content to determine the effects of differentprocedures on the efficiency of partial purification.Dialysis and lyophilization of partially purifiedlysozymeThe lyophilized lysozymes were obtained by usingsupernatants from centrifugation of ethanol-treated(40%, 60%, or 80%) and 6-h (or 7-h) incubatedsamples. Before lyophilization, the supernatantscontaining lysozyme were dialyzed for 21 h at 4 °C by 3changes of 2000 ml of distilled water. Lyophilization wasapplied by a freeze drier (Labconco, FreeZone, 6 liter,Kansas City, MO, USA) with –44 to –47 °C collectortemperature, and 50 x 10-3 and 100 x 10-3 mbar vacuum.The sample container volume was 2-3 times the samplevolume. The lyophilized enzymes were kept at –18 °Cuntil they were used in different studies.Protein content and enzyme activity of lyophilizedpartially purified lysozymesThe protein content and residual enzyme activity oflyophilized enzymes were determined by dissolving 20mg of lyophilized preparation in 10 ml of distilled water.After centrifugation at 15 000 x g for 15 min at 4 °C, theresidual lysozyme activity and protein content of theenzyme preparations were determined by the methodsgiven below. Protein content was expressed as mgprotein per mg of powder, while enzyme activity wasexpressed as U per mg of powder or protein.Thermal stability of lyophilized partially purifiedlysozymeThermal inactivation studies were conducted at 60,70, 80, and 90 °C with thermal inactivation time (TIT)tubes (i.d.: 9 mm; wall thickness: 1 mm). To minimizethe lag phase, TIT tubes were heated to inactivationtemperature. Then, 0.2 ml of the enzyme solution wasprepared by dissolving lyophilized lysozyme in 0.05 MNa-phosphate buffer (pH 7.0), which was then pipettedinto the TIT tubes. After heating for a given period thetubes were cooled in an ice water bath and their contentswere immediately assayed for residual lysozyme activity.The calculation of heat inactivation parameters oflysozyme was conducted by applying the standardmethods that explain enzyme and microbial inactivationkinetics by a first order reaction (Holdsworth, 1997).The heat inactivation curves were formed by plotting logเปอร์เซ็นต์คงเหลือ กิจกรรมเปรียบเทียบกับความร้อนเวลา (นาที) ที่ยกเลิกการเรียกค่าคงที่อัตรา (k min-1) คำนวณได้โดยความชันของเส้นโค้งการยกเลิกการเรียกความร้อนโดยการคูณตัว 2.303 ครึ่งชีวิต (t1/2 นาที), ซึ่งอ้างอิงเวลาทำความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้บรรลุ50% ยกเลิกการเรียกของเอนไซม์ คำนวณได้จากt1/2 สูตร = ln (0.5) k-1 การลดทศนิยมเวลา (D นาที), ซึ่งหมายถึงเวลาทำความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้ยกเลิกการเรียก 90% ของการเอนไซม์ คำนวณได้คือค่าลบของลาดของเส้นโค้งการยกเลิกการเรียกความร้อน ค่า z(° C) ที่แสดงอ้างอิงอุณหภูมิความร้อนยกเลิกการเรียกคำนวณจากสมการ z = T2 -T1/ล็อก (ง 1/D2), โดยที่ T คือ อุณหภูมิ (° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไลโซไซม์สำหรับการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไลโซไซม์, ไข่ขาว, แยกออกจากกันอย่างระมัดระวังจากไข่แดงที่ถูกปรับลด 3 หรือ3.3 เท่ากับ 0.05 M NaCl การแก้ปัญหา เพื่อให้เกิดการตกตะกอนไข่โปรตีนสีขาวอื่น ๆ นอกเหนือจากไลโซไซม์ค่า pH นี้ส่วนผสมถูกกำหนดให้4.0 โดยระมัดระวังเพิ่มหลายหยดของ1 N กรดอะซิติกและมันก็เจือจางด้วยปริมาณเท่ากับ40%, 60% หรือ 80% (v / โวลต์) เอทานอล หลังจาก 0-, 2, 4, 6, 7, 8 ชั่วโมงบ่มที่อุณหภูมิห้องในการปรากฏตัวของความเข้มข้นแตกต่างกันของเอทานอลที่ผสมถูกหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 XG 15 นาทีที่ 4 ° C; แล้วตกตะกอนที่ถูกทิ้ง supernatants วิเคราะห์กิจกรรมไลโซไซม์ของพวกเขาและมีปริมาณโปรตีนเพื่อตรวจสอบผลกระทบของการที่แตกต่างกันวิธีการที่มีต่อประสิทธิภาพของการทำให้บริสุทธิ์บางส่วน. ไตและ lyophilization ของบริสุทธิ์บางส่วนlysozyme lysozymes แห้งที่ได้รับโดยใช้supernatants จากการหมุนเหวี่ยงของเอทานอลที่ได้รับ(40% 60% หรือ 80%) และ 6 ชั่วโมง (หรือ 7 ชั่วโมง) บ่มตัวอย่าง ก่อน lyophilization, supernatants มี lysozyme ถูก dialyzed 21 ชั่วโมงที่ 4 ° C 3 การเปลี่ยนแปลงของปี 2000 มล. น้ำกลั่น lyophilization ถูกนำมาใช้โดยการแช่แข็งแห้ง(Labconco, FreeZone, 6 ลิตร, แคนซัสซิตี, สหรัฐอเมริกา) ด้วยเพื่อ -44 -47 ° C เก็บอุณหภูมิและ50 x 10-3 และ 100 x 10-3 สูญญากาศเอ็มบาร์. ตัวอย่าง ปริมาณของภาชนะบรรจุเป็น 2-3 ครั้งตัวอย่างปริมาณ เอนไซม์แห้งถูกเก็บไว้ที่ -18 องศาเซลเซียสจนกว่าพวกเขาจะถูกนำมาใช้ในการศึกษาที่แตกต่างกัน. ปริมาณโปรตีนและเอนไซม์ของแห้งlysozymes บริสุทธิ์บางส่วนปริมาณโปรตีนและเอนไซม์ที่เหลือของเอนไซม์แห้งได้รับการพิจารณาโดยการละลาย20 มก. ในการจัดทำแห้งใน 10 มล. น้ำกลั่น. หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ 15 000 XG นาน 15 นาทีที่ 4 ° C, กิจกรรม lysozyme คงเหลือและปริมาณโปรตีนของการเตรียมเอนไซม์ถูกกำหนดโดยวิธีการที่ได้รับด้านล่าง ปริมาณโปรตีนที่ถูกแสดงเป็นมิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิกรัมของผงในขณะที่กิจกรรมของเอนไซม์ถูกแสดงเป็นยูต่อมิลลิกรัมของผงโปรตีน. ความมั่นคงทางความร้อนของแห้งบริสุทธิ์บางส่วนlysozyme ศึกษาพลังความร้อนได้รับการดำเนินการที่ 60, 70, 80 และ 90 องศาเซลเซียสด้วย เวลาการใช้งานความร้อน (TIT) ท่อ (ID: 9 มมความหนาของผนัง: 1 มิลลิเมตร) เพื่อลดขั้นตอนการล่าช้าหลอด TIT ถูกความร้อนการใช้งานที่อุณหภูมิ แล้ว 0.2 มล. ของการแก้ปัญหาการทำงานของเอนไซม์ที่ถูกจัดทำขึ้นโดยการละลายในไลโซไซม์แห้ง0.05 M บัฟเฟอร์นาฟอสเฟต (pH 7.0) ซึ่งได้รับการปิเปตแล้วลงในหลอดTIT หลังจากที่ความร้อนในช่วงเวลาที่กำหนดหลอดถูกระบายความร้อนในอ่างน้ำน้ำแข็งและเนื้อหาของพวกเขาถูกassayed ได้ทันทีสำหรับกิจกรรมไลโซไซม์ที่เหลือ. การคำนวณของพารามิเตอร์พลังความร้อนของไลโซไซม์ได้ดำเนินการโดยใช้มาตรฐานวิธีการที่อธิบายการทำงานของเอนไซม์และยับยั้งจุลินทรีย์จลนศาสตร์โดยปฏิกิริยาสั่งซื้อครั้งแรก (Holdsworth, 1997). โค้งพลังความร้อนที่ถูกสร้างขึ้นโดยการวางแผนการเข้าสู่ระบบของกิจกรรมที่เหลืออีกร้อยละเมื่อเทียบกับความร้อนเวลา (นาที) ค่าคงที่อัตราการใช้งาน (k-1 นาที) จะถูกคำนวณโดยการคูณความชันของเส้นโค้งพลังความร้อนจากปัจจัยของ2.303 ชีวิตครึ่ง (t1 / 2 นาที) ซึ่งหมายถึงเวลาที่ความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้เกิดการใช้งาน50% ของเอนไซม์จะถูกคำนวณจากสูตรt1 / 2 = LN (0.5) k-1 การลดทศนิยมครั้ง (d นาที) ซึ่งหมายถึงเวลาที่ความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้เกิดการใช้งาน90% ของเอนไซม์จะถูกคำนวณจากส่วนกลับเชิงลบของความลาดชันของเส้นโค้งพลังความร้อน ค่าซี(° C) ที่แสดงให้เห็นการพึ่งพาอุณหภูมิของความร้อนที่ใช้งานที่คำนวณได้จากสมซี= T2- T1 / เข้าสู่ระบบ (D1 / D2) ที่ T คืออุณหภูมิ (° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไลโซไซม์

สำหรับการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไลโซไซม์ , ไข่ขาว
อย่างระมัดระวัง แยกออกจากไข่แดง ลด 3 - หรือ
3.3-fold กับ 0.05 M NaCl สารละลาย ตกตะกอนโปรตีนไข่สีขาว
นอกจากไลโซไซม์ , pH ของส่วนผสมนี้
ตั้งไว้ที่ 4.0 โดยรอบคอบเพิ่มหลายหยด
1 N กรดอะซิติกและเจือจางด้วย
ขนาดเท่ากัน 40% , 60% ,หรือ 80 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) เอทานอล หลังจาก 0 - 2 - 4 - 6 -
7 - หรือการบ่มที่อุณหภูมิห้องประมาณใน
ตนของระดับความเข้มข้นของเอทานอลผสมอยู่ที่ระดับ 12 , 000
x G สำหรับ 15 นาทีที่ 4
/ C ; จากนั้นตะกอนถูกละทิ้ง .
supernatants วิเคราะห์กิจกรรมของไลโซไซม์
และโปรตีนเพื่อตรวจสอบผลของความแตกต่าง
ขั้นตอนเกี่ยวกับประสิทธิภาพของการทำให้บริสุทธิ์บางส่วน .
การฟอกไตและเอนไซม์ของไลโซไซม์บริสุทธิ์บางส่วน

lysozymes แห้งได้โดยใช้ supernatants จากเอทานอลการปั่น

( 40% , 60% หรือ 80% ) และ 6-h ( หรือ 7-h ) บ่ม
ตัวอย่าง ก่อนที่ Tool , supernatants
ที่มีไลโซไซม์ได้ผ่าน 21 H 4 ° C 3
โดยการเปลี่ยนแปลงของ 2000 ml ของน้ำกลั่น เอนไซม์คือ
ประยุกต์โดยตรึงแห้ง ( แล็บคอนโก้ ฟรี โซน 6 ลิตร ,
, Kansas City , โม , USA ) – 44 47 ° C อุณหภูมิสะสมไป )
, 50 x 100 x 10-3 10-3 มิลลิบาร์ สูญญากาศ
ตัวอย่างภาชนะปริมาณ 2-3 ครั้งตัวอย่าง
ปริมาณ เอนไซม์โปรตีนที่ถูกเก็บไว้ที่ - 18 ° C
จนกว่าพวกเขาจะถูกใช้ในการศึกษาที่แตกต่างกัน .
ปริมาณโปรตีนและเอนไซม์ของโปรตีนบริสุทธิ์บางส่วน lysozymes

เนื้อหาโปรตีนและกิจกรรมเอนไซม์ของเอนไซม์เป็นโปรตีนตกค้าง
20
มก. เตรียมโดยละลายในน้ำกลั่นแห้ง 10 ml .
หลังการปั่นเหวี่ยงที่ 15 000 x G สำหรับ 15 นาทีที่ 4 ° C ,
3 กิจกรรมไลโซไซม์และปริมาณโปรตีน ของ
การเตรียมเอนไซม์ถูกกำหนดโดยวิธีการ
ได้รับด้านล่าง . โปรตีนจะแสดงเป็นโปรตีน mg
ต่อมิลลิกรัมของแป้ง ในขณะที่เอนไซม์คือ
แสดงเป็นคุณต่อมิลลิกรัมโปรตีนผงหรือ .
เสถียรภาพทางความร้อนของโปรตีนบริสุทธิ์บางส่วน

ทำให้การศึกษาไลโซไซม์ความร้อนทดสอบที่ 60
70 , 80 และ 90 ° C กับเวลาเมื่อความร้อน ( ติ๊ด )
ท่อ ( ID : 9 มม. ; ความหนา :1 มิลลิเมตร ) เพื่อลด
lag phase , หัวนมท่อ คืออุ่นที่อุณหภูมิใช้งาน

งั้น , 0.2 มิลลิลิตรของสารละลายเอนไซม์ที่เตรียมได้โดยละลาย
ไลโอไลโซไซม์ใน 0.05 M
นา ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) ซึ่งก็ pipetted
เป็นหัวนมท่อ หลังจากเครื่องที่กำหนด
ท่อ คือเย็นในน้ำแข็ง น้ำอาบ และเนื้อหาของพวกเขา
ได้ทันที สำหรับกิจกรรมเอนไซม์ไลโซไซม์ตกค้าง .
การคำนวณความร้อนทำให้ค่า
ไลโซไซม์ดำเนินการโดยใช้มาตรฐาน
วิธีการอธิบายและเอนไซม์จลนศาสตร์การยับยั้ง
โดยจุลินทรีย์ปฏิกิริยาลำดับแรก ( โฮลด์สเวิร์ท , 1997 ) .
ความร้อนทำให้โค้งขึ้น โดยวางแผนบันทึก
) กิจกรรมกับเวลาร้อน ( ที่เหลือ มิน )