Identification of bacteria K. pneum

Identification of bacteria K. pneumoniae
The form of K pneumoniae(Gram negetive bacterium) is rod and the average size of a length of 2 µm x0.5 µm wide Gram staining of K pneumoniae ITB1 shows in Fig. 3 shows the similarity to K. pneumoniae as a Gram negative and rod shape bacteria.
The further identification of bacteria is conducted by PCR 16S rRNA using universal primer 5’- AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3' (BactF1) and 5'-GGTTAC(GIC)TTTGTTACGACTT-3' (UniB 1). The PCR amplification result was sequence by dye terminator dideoxy Sanger method. And the 16S rRNA sequence was align with data in Gene Bank NCBI. It shows highest similaity to many strain of the K. pneumoniae(data not shown)

Isolation haloacid dehalogenase gene by PCR
The isolation of haloacid dehalogenase gene hakp1 is conducted by PCR mothod using forward primer 5’-ATGATCCGCGCCATCGTG-3’ (Tm=58.4 °C ) and reverse pimer 5'-TCATGC TGGGATC TGCTCC-3’ (Tm 57.1 °C) It ensure that all pre-heating for denaturation of chromosome(template ) for 4 minutes at temperature of 94 °C. This is done to by all chromosomes have become single stranded DNA. The PCR cycle denaturation temperatu of 94 °C followed by annealing temperature of 50 oc and elongation temperature of 72 °C. Cycles performed 34 times.
PCR amplification result of haloacid dehalogenase gene(hakp1) shown in the form of single band in agarose gel and the size of that DNA fragment hakpl1 is 690 base pairs (Fig.4) this DNA fragment size of in silico analysis of haloacid dehalogenase gene of K. pneumoniae with data Gene Bank using primer Blast program.
Recombinant plasmid transformation
Recombinant plasmid pGEM-HAD, transformed into competent cells of E.coli TOP10 using heat shock method Culture of transformation results further were grown in selective medium containing ampicillin,X-gel and IPTG. Bacterial cells were successfully transformed with a plasmid will be able to survive in a medium containing ampicillin, Colonies containing recombinant plasmid are white colonies, while the blue colonies are containing plasmid pGEM-T(Fig. 5)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บัตรประจำตัวของเชื้อแบคทีเรีย K. pneumoniae
รูปแบบของ K pneumoniae (แกรม negetive แบคทีเรีย) เป็นแกนและขนาดเฉลี่ยของความยาวของ 2 ไมครอนไมครอน x0.5 กรัมกว้างการย้อมสีของ K pneumoniae ITB1 แสดงให้เห็นในรูป 3 แสดงให้เห็นถึงความคล้ายคลึงกันเพื่อ K. pneumoniae เป็นแบคทีเรียแกรมลบและแกนแบคทีเรียรูปร่าง.
บัตรประจำตัวต่อไปของแบคทีเรียที่จะดำเนินการโดยวิธี PCR 16S rRNA ใช้ไพรเมอร์สากล 5'- AGAGTTTGATC (A / C) TGGCTCAG-3 '(BactF1) และ 5' -GGTTAC (GIC) TTTGTTACGACTT-3 '(UniB 1) ผลการขยาย PCR เป็นลำดับโดยการย้อม Terminator dideoxy วิธีการแซงเจอร์ และลำดับ 16S rRNA ถูกสอดคล้องกับข้อมูลในยีนธนาคาร NCBI มันแสดงให้เห็น similaity สูงสุดไปหลายสายพันธุ์ของ K. pneumoniae (ไม่ได้แสดงข้อมูล)

การแยกยีน haloacid dehalogenase โดยวิธี PCR
แยกของ haloacid hakp1 ยีน dehalogenase จะดำเนินการโดยวิธี PCR mothod ใช้ไพรเมอร์ไปข้างหน้า 5'-ATGATCCGCGCCATCGTG-3 '(TM = 58.4 ° C) และย้อนกลับ pimer 5'-TCATGC TGGGATC TGCTCC-3 '(TM 57.1 ° C) มันให้แน่ใจว่าทุกร้อนก่อนสำหรับการสูญเสียสภาพธรรมชาติของโครโมโซม (template) 4 นาทีที่อุณหภูมิ 94 ° C นี้จะกระทำโดยโครโมโซมทั้งหมดได้กลายเป็นดีเอ็นเอควั่นเดียว PCR รอบ denaturation temperatu 94 ° C ตามด้วยการอบที่อุณหภูมิ 50 องศากับมีอุณหภูมิการยืดตัวของ 72 ° C รอบการดำเนินการ 34 ครั้ง.
ผลขยาย PCR ของยีน dehalogenase haloacid (hakp1) ที่แสดงในรูปแบบของวงเดียวในเจล agarose และขนาดของที่ hakpl1 ชิ้นดีเอ็นเอเป็น 690 คู่เบส (Fig.4) ดีเอ็นเอขนาดนี้ส่วนของการวิเคราะห์ silico ยีน dehalogenase haloacid ของ K. pneumoniae กับข้อมูลยีนธนาคารโดยใช้โปรแกรมไพรเมอร์ระเบิด.
การเปลี่ยนแปลงพลาสมิด Recombinant
Recombinant พลาสมิด pGEM-ได้กลายเป็นเซลล์ที่มีอำนาจของ E.coli TOP10 ใช้วัฒนธรรมวิธีการช็อตความร้อนของผลการเปลี่ยนแปลงต่อไปปลูกในสื่อเลือกที่มี ampicillin X-เจลและ IPTG เซลล์แบคทีเรียถูกเปลี่ยนประสบความสำเร็จกับพลาสมิดจะสามารถที่จะอยู่รอดในสื่อที่มี ampicillin อาณานิคมที่มีพลาสมิด recombinant เป็นอาณานิคมสีขาวในขณะที่โคโลนีสีฟ้าจะมีพลาสมิด pGEM-T (รูปที่. 5)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การจำแนกชนิดของแบคทีเรีย K . pneumoniaeรูปแบบของ K pneumoniae ( กรัม negetive bacterium ) เป็นแท่งและมี ขนาดความยาว 2 เมตร กว้างµ x0.5 µการย้อมสีกรัม K pneumoniae itb1 แสดงในรูปที่ 3 แสดงความเหมือน K . pneumoniae เป็นแบคทีเรียแกรมลบรูปแท่ง และแบคทีเรียอีกตัวของแบคทีเรียจะดำเนินการโดยวิธี PCR โดยใช้ primer เบส 16S rRNA สากล 5 " - agagtttgatc ( A / C ) tggctcag-3 " ( bactf1 ) และ 5 " - ggttac ( GIC ) tttgttacgactt-3 " ( unib 1 ) ร่วมขยายผลเป็นลำดับโดยย้อม Terminator dideoxy แซงเกอร์ วิธี และเบส 16S rRNA ลำดับก็สอดคล้องกับข้อมูลในธนาคารยีน ncbi . มันแสดงให้เห็น similaity สูงสุดสายพันธุ์หลายของ K . pneumoniae ( ข้อมูลไม่แสดง )การแยกยีนโดยวิธี PCR haloacid dehalogenaseการแยกยีน haloacid dehalogenase hakp1 จะดําเนินการโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ mothod ไปข้างหน้า 5 " - atgatccgcgccatcgtg-3 " ( R = 58.4 ° C ) และกลับ pimer 5 " - tcatgc tgggatc tgctcc-3 " ( TM 57.1 ° C ) ให้มั่นใจว่าทุกเครื่องก่อน ( โครโมโซม ( แม่ ) 4 นาที ที่อุณหภูมิ 94 องศา C . นี้จะกระทำ โดยทั้งหมดได้กลายเป็นที่ควั่นดีเอ็นเอโครโมโซมเดี่ยว . การตรวจรอบ ( temperatu 94 ° C ตามด้วยการอบอ่อนที่อุณหภูมิ 50 และการ OC อุณหภูมิ 72 องศา รอบแสดง 34 ครั้งผลของ PCR ( haloacid dehalogenase ยีน ( hakp1 ) แสดงในรูปแบบของซิงเกิ้ลแบนด์ในเจลและขนาดของดีเอ็นเอ hakpl1 เป็น 690 คู่เบส ( fig.4 ) ดีเอ็นเอขนาดในการวิเคราะห์โครงข่ายของ haloacid dehalogenase ยีนของ K . pneumoniae ธนาคารยีนโดยใช้โปรแกรมระเบิดรองพื้นการรีคอมบิแนนท์พลาสมิดรีคอมบิแนนท์พลาสมิด pgem ได้แปรสภาพเป็นเซลล์ที่มีความสามารถของ Top10 E.coli โดยใช้ความร้อนช็อกวัฒนธรรมของผลการแปลงเพิ่มเติมวิธีเลือกปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี ampicillin และ x-gel , เข้ . เซลล์แบคทีเรียที่มีพลาสมิดถูกเปลี่ยนเรียบร้อยแล้วจะสามารถอยู่รอดได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีแอมพิซิลลิน อาณานิคมที่มีรีคอมบิแนนท์พลาสมิดเป็นโคโลนีสีขาว ในขณะที่อาณานิคมสีฟ้าที่มีพลาสมิด pgem-t ( รูปที่ 5 )