2.5. In situ hybridizationFresh pre

2.5. In situ hybridization
Fresh pre-clitellar, clitellar and post-clitellar earthworm body
parts were embedded in Tissue-Tek (Sakura) and immediately snap
frozen in an isopentane bath cooled with liquid nitrogen. Ten
micrometer thick transversal sections were prepared using a
cryostat at 20 C and then transferred onto a Superfrost Plus Gold
slide (Menzel-Glaser, Thermo Scienti € fic). The slides were air dried
for 5 min at room temperature and fixed in fresh RNase-free 4%
paraformaldehyde (pH 7.2) on ice for 15 min. Sections were
digested with 5 mg/ml proteinase K (Life Technologies) for 2 min
and postfixed with 4% paraformaldehyde (pH 6.5) on ice for 8 min.
The acetylation step was performed in a solution of 0.25% acetic
anhydride in 0.1 M triethanolamine (pH 8) for 10 min. Slides were
washed in 2
SSC (saline-sodium citrate buffer) and prehybridized
for 2 h at 42 C in prehybridization mixture (40% formamide,
4
SSC, 10% dextran sulfate, 1
Denhardt's solution, 10 mM DTT
(dithiotreithol), 0.1 mg/ml yeast tRNA). Antisense and sense probes
(final concentration 1 ng/ml) were heat denatured for 10 min at
70 C in the prehybridization mixture and then kept on ice. Sections
were hybridized with probes for 18 h at 52 C in a moist chamber.
Samples were washed with 4
SSC and treated with RNase A for
30 min at 37 C. For the removal of unhybridized probes, a
decreasing concentration gradient of SSC buffer at room temperature
(2
SSC, 1
SSC, 0.5
SSC) was used, followed by a final wash
step in 0.1
SSC at 52 C. Slides were treated with a blocking reagent
(Boehringer) for 1 h and then incubated with anti-DIGalkaline
phosphate antibody (1:5000, Roche) overnight at 4 C.
The labeling was visualized using a mixture of 0.04 mM nitroblue
tetrazolium, 0.05 mM bromochloroindoyl phosphate and 1.1 mM
levamisole in DIG buffer (pH 9.5). Sections were counterstained
with a 0.1% nuclear fast red aluminum sulfate solution for 20 min,
followed by washing in water and then mounting in Apathy's
mounting medium.
2.6. Histology
2.6.1. Hematoxylin/eosin staining
Earthworms stimulated with the microorganisms were examined
by using histological techniques. Post-clitellar body parts were
fixed in 4% formalin overnight and embedded in paraffin. Transverse
sections (5 mm thick) were prepared using a microtome and
dried overnight. Sections were deparaffinized in xylene and rehydrated
in a decreasing concentration gradient of ethanol. Staining
with hematoxylin/eosin was performed according to the protocol
(Kier

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 hybridization ในแหล่งกำเนิดร่างกายล่วงหน้า clitellar, clitellar และ clitellar หลังไส้เดือนสดส่วนฝังอยู่ในเนื้อเยื่อ-Tek (ซากุระ) และถ่ายทันทีแช่ในอ่าง isopentane เย็น ด้วยไนโตรเจนเหลว สิบไมโครมิเตอร์หนาส่วนลอยถูกเตรียมการใช้การcryostat ที่ 20 C และการ โอนย้ายไป Superfrost พร้อมทองภาพนิ่ง (Menzel-Glaser เทอร์โม Scienti € fic) ภาพนิ่งที่มีอากาศแห้ง5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและถาวรในสด RNase ฟรี 4%paraformaldehyde (ค่า pH 7.2) บน 15 นาทีส่วนย่อย มี 5 mg/ml proteinase K (ชีวิตเทคโนโลยี) 2 นาทีและ postfixed กับ paraformaldehyde 4% (ค่า pH 6.5) น้ำแข็งสำหรับ 8 นาทีดำเนินการขั้นตอน acetylation ในโซลูชันของ 0.25% อะซิติกanhydride ใน 0.1 M triethanolamine (ค่า pH 8) 10 นาทีภาพนิ่งได้ล้างใน SSC 2 (เกลือโซเดียมซิเตรตบัฟเฟอร์) และ prehybridizedสำหรับ 2h ที่ 42 C ส่วนผสม prehybridization (formamide 40%4 SSC ซัลเฟต 10% เดกซ์แทรน โซลูชัน 1 Denhardt, 10 มม. DTT(dithiotreithol), 0.1 mg/ml ยีสต์ป้องกันสลาย) โพรบ antisense และความรู้สึก(ความเข้มข้นสุดท้าย 1 ng/ml) ถูกความร้อนเอทิลแอลกอฮอล์ 10 นาทีที่C 70 ส่วนผสม prehybridization แล้ว เก็บไว้บนน้ำแข็ง ส่วนมีไฮบริด ด้วยโพรบสำหรับ h 18 ที่ 52 C ในห้องชื้นตัวอย่างล้าง ด้วย 4 SSC และ RNase A สำหรับรับ30 นาทีที่ 37 c สำหรับการกำจัดของโพรบ unhybridized การลดไล่ระดับความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ SSC ที่อุณหภูมิห้อง(2 SSC, 1 SSC, 0.5 SSC) ถูกใช้ ตาม ด้วยการล้างขั้นสุดท้ายขั้นตอนใน SSC 0.1 ที่นิ่ง 52 C. ได้รับการรักษา ด้วยสารบล็อก(Boehringer) สำหรับ 1 h และจากนั้น ได้รับการกกกับป้องกัน DIGalkalineฟอสเฟตแอนติบอดี (1:5000, Roche) ค้างคืนที่ 4 cติดฉลากถูกมองเห็นโดยใช้ส่วนผสมของ nitroblue 0.04 มม.tetrazolium ฟอสเฟต bromochloroindoyl 0.05 mM และ 1.1 mMlevamisole ในขุดบัฟเฟอร์ (pH 9.5) ส่วนที่ counterstainedมี 0.1% นิวเคลียร์สีแดงอะลูมิเนียมซัลเฟตโซลูชันสำหรับ 20 นาทีตาม ด้วยการล้างน้ำแล้ว ติดตั้งในของ Apathyขนาดกลางติดตั้ง2.6. มิญชวิทยา2.6.1. ย้อมสี eosin ละ hematoxylinไส้เดือนที่กระตุ้น ด้วยจุลินทรีย์ถูกตรวจสอบโดยใช้เทคนิคทางเนื้อเยื่อวิทยา ส่วนของร่างกาย clitellar หลังถูกแก้ไขใน 4% formalin ค้างคืน และฝังตัวในพาราฟิน ขวางส่วน (หนา 5 มม.) ได้เตรียมการใช้เครื่อง microtome และแห้ง ส่วน deparaffinized ในไซลีน และ rehydratedในการไล่ลดลงความเข้มข้นของเอทานอล การย้อมสีกับ hematoxylin/eosin ดำเนินตามโพรโทคอล(Kier

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 ในแหล่งกำเนิดพันธุ์
สดก่อน clitellar ร่างกายไส้เดือน clitellar และหลัง clitellar
ชิ้นส่วนที่ถูกฝังอยู่ในเนื้อเยื่อ-Tek (ซากุระ) และทันทีที่สแน็ป
แช่แข็งในห้องอาบน้ำ isopentane เย็นสบายด้วยไนโตรเจนเหลว สิบ
ไมโครเมตรส่วนขวางหนาได้จัดทำขึ้นโดยใช้
cryostat ที่ 20 C และย้ายไปยัง Superfrost พลัสโกลด์แล้ว
สไลด์ (Menzel-ตับ, เทอร์โม scienti € FIC) สไลด์ถูกอากาศแห้ง
เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและการแก้ไขในสด RNase ฟรี 4%
paraformaldehyde (pH 7.2) บนน้ำแข็งนาน 15 นาที ส่วนที่ถูก
ย่อยด้วย 5 mg / ml โปร K (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) เป็นเวลา 2 นาที
และหลังค่าเงินกับ paraformaldehyde 4% (pH 6.5) บนน้ำแข็งเป็นเวลา 8 นาที.
ขั้นตอน acetylation ได้ดำเนินการในการแก้ปัญหาของอะซิติก 0.25% และ
สารประกอบใน 0.1 M Triethanolamine (pH 8) เป็นเวลา 10 นาที สไลด์ถูก
ล้างใน 2 หรือไม่? SSC (น้ำเกลือโซเดียมบัฟเฟอร์ซิเตรต) และ prehybridized
เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 42 C ในส่วนผสม prehybridization (40% formamide,
4? SSC 10% ซัลเฟต dextran 1? Denhardt วิธีการแก้ปัญหา 10 มิลลิ DTT
(dithiotreithol) 0.1 mg / ยีสต์มล. tRNA) antisense และความรู้สึกฟิวส์
(สุดท้ายเข้มข้น 1 ng / ml) ถูกความร้อนเอทิลแอลกอฮอล์ 10 นาทีที่
70 C ในส่วนผสม prehybridization แล้วเก็บไว้ในน้ำแข็ง ส่วนที่
ถูกไฮบริดที่มีฟิวส์ 18 ชั่วโมงที่ 52 C ในห้องชื้น.
ตัวอย่างถูกล้างด้วย 4? SSC และรับการรักษาด้วย RNase สำหรับ
30 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียสสำหรับการกำจัดของยานสำรวจ unhybridized, การ
ไล่ระดับความเข้มข้นลดลงของ SSC บัฟเฟอร์ที่อุณหภูมิห้อง
(2? SSC 1? SSC, 0.5? SSC) ถูกนำมาใช้ตามด้วยเป็นครั้งสุดท้าย ล้าง
ขั้นตอนใน 0.1? เอสเอส 52 ซีสไลด์ได้รับการรักษาด้วยการปิดกั้นสาร
(Boehringer) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและจากนั้นบ่มกับป้องกัน DIGalkaline
ฟอสเฟตแอนติบอดี (1: 5000 Roche) ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส
ติดฉลากถูกมองเห็นโดยใช้ส่วนผสมของ 0.04 มิลลิ nitroblue
tetrazolium, 0.05 มิลลิ bromochloroindoyl ฟอสเฟตและ 1.1 มิลลิ
levamisole ใน DIG บัฟเฟอร์ (pH 9.5) ส่วนที่ถูก counterstained
ด้วยโซลูชั่นอลูมิเนียมซัลเฟต 0.1% นิวเคลียร์อย่างรวดเร็วสีแดงสำหรับ 20 นาที
ตามด้วยการซักผ้าในน้ำและการติดตั้งแล้วในอารมณ์ของ
กลางติดตั้ง.
2.6 จุล
2.6.1 Hematoxylin / ย้อมสี Eosin
ไส้เดือนกระตุ้นด้วยเชื้อจุลินทรีย์มีการตรวจสอบ
โดยใช้เทคนิคการตรวจชิ้นเนื้อ ส่วนของร่างกายที่โพสต์ clitellar ถูก
แก้ไขใน 4% ฟอร์มาลินในชั่วข้ามคืนและฝังตัวอยู่ในพาราฟิน ขวาง
ส่วน (5 มมหนา) ได้จัดทำขึ้นโดยใช้ไมโครและ
แห้งในชั่วข้ามคืน ส่วนที่ถูก deparaffinized ในไซลีนและคืนรูป
ในการไล่ระดับความเข้มข้นลดลงของเอทานอล การย้อมสี
ด้วย hematoxylin / Eosin ได้ดำเนินการตามโปรโตคอล
(Kier

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 ใน situ hybridizationก่อน clitellar สด , และ clitellar ไส้เดือนตัว clitellar โพสต์ส่วนที่ฝังอยู่ในเนื้อเยื่อ เต็ก ( ซากุระ ) และทันที ตะครุบแช่แข็งในไอโซเพนเทนนํ้าเย็นด้วยไนโตรเจนเหลว สิบไมโครเมตรหนาขวางส่วนเตรียมใช้Cryostat ที่ 20 C และจากนั้นย้ายไปยัง superfrost พลัสโกลด์ภาพนิ่ง ( Menzel เกลเซอร์ , เทอร์โม scienti ดฟิค ) สไลด์ให้แห้งสำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและ 4 % คงที่สดเลสฟรีพาราฟอร์มาลดิไฮด์ ( pH 7.2 ) บนน้ำแข็งนาน 15 นาที ส่วน คือย่อย 5 mg / ml โปร K ( เทคโนโลยี ) เป็นเวลา 2 นาทีและ postfixed ด้วย 4% พาราฟอร์มาลดิไฮด์ ( pH 6.5 ) บนน้ำแข็ง เป็นเวลา 8 นาทีส่วนการกันขั้นตอนแสดงในสารละลาย 0.25% ติคแอนไฮไดรด์ใน 0.1 M ไตร pH 8 ) นาน 10 นาที ภาพนิ่งคือล้างใน SSC ( เกลือโซเดียมซิเตรตบัฟเฟอร์ 2 ) และ prehybridized2 H ที่ 42 องศาเซลเซียส ในส่วนผสม prehybridization ( 40% Formamide ,4 SSC 10% dextran sulfate , 1 denhardt โซลูชั่น 10 - 20( dithiotreithol ) , 0.1 mg / ml การเมารถยีสต์ ) antisense และความรู้สึก ชื่อว่าสุดท้าย ( ความเข้มข้น 1 ng / ml ) ใช้ความร้อนสำหรับ 10 นาทีที่70 องศาเซลเซียส ใน prehybridization ผสมแล้วเก็บไว้บนน้ำแข็ง ส่วนถูกกับดีเอ็นเอติดตาม 18 H ที่ 52 C ในห้องชุ่มชื้นตัวอย่างการล้างด้วย 4 SSC และรักษาด้วยเลสสำหรับ30 นาที ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เพื่อกำจัด unhybridized probes ,การลดความเข้มข้นของ SSC บัฟเฟอร์ที่อุณหภูมิห้อง( 2 SSC 1 SSC 0.5 SSC ) ถูกใช้ตามล้างสุดท้ายขั้นตอนใน 0.1 SSC ที่ 52 C ได้รับการรักษาด้วยการใช้สไลด์ขวางทาง( ความ ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นทำการ digalkaline กับการป้องกันแอนติบอดี ( 1:5000 ฟอสเฟต , ค้างคืนที่โรช ) 4 Cการติดฉลากถูกมองเห็นโดยการใช้ส่วนผสมของ nitroblue 0.04 มม.tetrazolium ฟอสเฟต bromochloroindoyl 0.05 มม. และ 1.1 มม.เลวาไมโซลในขุดบัฟเฟอร์ pH 9.5 ) ส่วนที่เป็น counterstainedกับ 0.1% นิวเคลียร์สีแดงอย่างรวดเร็ว อลูมิเนียมซัลเฟตโซลูชั่นสำหรับ 20 นาทีตามด้วยล้างในน้ำแล้วติดในอารมณ์ของสื่อการติดตั้ง2.6 เนื้อเยื่อดูแล . ย้อม / eosin คราบไส้เดือนกระตุ้นด้วยเชื้อจุลินทรีย์ทดสอบโดยการใช้เทคนิคทางจุลกายวิภาค . โพสต์ clitellar ส่วนร่างกายคือถาวรในฟอร์มาลิน 4% ค้างคืนและฝังในพาราฟิน ตามขวางส่วน ( หนา 5 มม. ) ถูกเตรียมขึ้นโดยใช้เครื่องตัดชิ้นเนื้อ และค้างคืนให้แห้ง ส่วนใน และได้ทำการ รีไฮเดรทมเป็น deparaffinized ไซลีนในการลดความเข้มข้นของเอทานอล .กับย้อม / โอซินได้ปฏิบัติตามพิธีสาร( เคียร์