Caspase 3-like activityP19 cells we

Caspase 3-like activity
P19 cells were trypsinized and washed in PBS.
After washing, cells were concentrated by centrifuging at
300 g for 3 minutes and the supernatant was discarded.
The pellets were resuspended in a lysis buffer containing
100 mM NaCl, 0.1% CHAPS, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA,
50 mM HEPES pH 7.4. The samples were kept on ice for
20 minutes following by protein quantification through the
BCA kit assay (23227; Thermo Scientific). Then, 25 μg of cell protein extracts were aliquoted in an assay buffer (100
mM NaCl, 0.1% CHAPS, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA,
10% glycerol, 50 mM HEPES pH 7.4) supplemented with
100 μM caspase-3 substrate Ac-DEVD-pNA (235400;
Merck Millipore, Darmstadt, Germany) and incubated
for 2 hours at 37ºC. Caspase 3-like activity was accessed
following the detection of the chromophore p-nitroaniline
(pNA) after cleavage from the labeled substrate
Ac-DEVD-pNA. Method calibration was achieved using
known concentrations of p-NA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กิจกรรม 3 เหมือน Caspaseเซลล์ P19 ถูก trypsinized และล้างใน PBSหลังจากซักผ้า เซลล์เข้มข้น โดย centrifuging ที่300 กรัม 3 นาทีและ supernatant ถูกละทิ้งเกล็ดถูก resuspended ในการ lysis บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยNaCl 100 มม. CHAPS 0.1, 1 mM DTT, EDTA, 0.1 มม.50 มม. HEPES pH 7.4 ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้บนน้ำแข็ง20 นาทีตาม ด้วยโปรตีนนับผ่านการBCA ชุดทดสอบ (23227 เทอร์โมวิทยาศาสตร์) แล้ว μg 25 สารสกัดจากโปรตีนของเซลล์ถูก aliquoted ในบัฟเฟอร์การทดสอบ (100NaCl mM, 0.1% CHAPS, DTT, EDTA, 0.1 mM 1 mM10% กลีเซอร 50 มม. HEPES pH 7.4) เสริมด้วยพื้นผิวของ caspase-3 100 μM Ac-DEVD-pNA (235400เมอร์คมาก ดาร์มส เยอรมนี) และ incubated2 ชั่วโมงที่ 37ºC เข้าถึงกิจกรรม 3 เหมือน Caspaseต่อการตรวจพบของ chromophore p-nitroaniline(pNA) หลังจากความแตกแยกจากพื้นผิวที่ป้ายAc-DEVD-pNA ใช้วิธีเทียบสำเร็จทราบความเข้มข้นของ p เรี่ยม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

caspase กิจกรรม 3 เหมือน
เซลล์ P19 ถูก trypsinized และล้างในพีบีเอส.
หลังจากล้างเซลล์มีความเข้มข้นโดยเหวี่ยงที่
300 กรัมเป็นเวลา 3 นาทีและใสทิ้ง.
เม็ดที่ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์สลายที่มี
100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 0.1% CHAPS 1 มิลลิ DTT 0.1 มิลลิ EDTA,
50 มิลลิ HEPES ค่า pH 7.4 ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ในน้ำแข็ง
20 นาทีตามด้วยปริมาณโปรตีนที่ผ่าน
การทดสอบชุดเก็บกวาด (23227; เทอร์โมวิทยาศาสตร์) จากนั้น 25 ไมโครกรัมของสารสกัดจากโปรตีนของเซลล์ถูก aliquoted ในบัฟเฟอร์ทดสอบ (100
มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 0.1% CHAPS 1 มิลลิ DTT 0.1 มิลลิ EDTA,
กลีเซอรีน 10%, 50 มิลลิ HEPES ค่า pH 7.4) เสริมด้วย
100 ไมครอน caspase-3 พื้นผิว Ac -DEVD-PNA (235400;
เมอร์ค, Darmstadt, เยอรมนี) และบ่ม
เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่37ºC caspase กิจกรรม 3 เหมือนถูกเข้าถึง
ต่อไปนี้การตรวจสอบของ chromophore พี nitroaniline
(PNA) หลังจากที่แตกแยกจากพื้นผิวที่มีข้อความ
Ac-DEVD-PNA วิธีการสอบเทียบก็ประสบความสำเร็จโดยใช้
ความเข้มข้นที่รู้จักกันดีของ P-NA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กิจกรรมแคสเปส 3-like
p19 cells trypsinized และล้างใน PBS .
หลังจากการล้างเซลล์มีความเข้มข้นของสารที่
300 กรัม 3 นาทีและนำทิ้ง .
เม็ดถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ที่มีการสลาย
ขนาด 100 มม. , 0.1% ส่วน Chaps , 1 มม. , 0.1 mM EDTA
50 , มิลฮีเปส pH 7.4 . ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ในที่เย็นเพื่อ
20 นาที ตามด้วย ปริมาณโปรตีนผ่าน
BCA ชุด assay ( 23227 ; เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ) งั้น , 25 μกรัมสารสกัดโปรตีนในเซลล์ aliquoted ใช้บัฟเฟอร์ ( 100 mM NaCl 0.1 %
, Chaps , 1 mM DTT 0.1 mM EDTA 10 %
, กลีเซอรอล , 50 มิลฮีเปส pH 7.4 ) เสริมด้วย
μ M 100 การศึกษาลักษณะพื้นผิว AC devd PNA ( 235400 ;
เมอร์คมิลลิพอร์ ดาร์มชตัท , , เยอรมนี ) )
2 ชั่วโมง 37 º Cกิจกรรมแคสเปส 3-like คือเข้าถึง
ต่อไปนี้การตรวจสอบของที่มีสี p-nitroaniline
( PNA ) หลังจากการแยกออกจากข้อความตั้งต้น
AC devd PNA . ปรับแต่งได้โดยใช้วิธีที่ทราบค่าความเข้มข้นของ p-na
.