European Journal of Soil BiologyEva

European Journal of Soil Biology
Evaluating T-RFLP protocols to sensitively analyze the genetic diversity
and community changes of soil alkane degrading bacteria
Methods
2.1. Evaluation of restriction enzymes for alkB T-RFLP
The BLAST database was searched for either complete or partial
alkB gene sequences with Pseudomonas putida P1 alkB (AJ233397)
and Rhodococcus sp. Q15 alkB1 (AF388182) sequences as references
using the blastn Basic Search Alignment Tool [22]. Results were
counterchecked with the blastx protein database search [23] to
account for nucleotide sequences related to the alkane monooxygenase.
Suitable sequences were aligned with BioEdit [24] using
the ClustalW alignment tool [25]. Only sequences having the
binding sites for the experimentally applied alkB primers (see
section PCR-amplification) were included for further restriction
enzyme selection. The retrieved alignment included 83 sequences
and was manually checked and uploaded to the online program
Restriction Enzyme Picker (REPK) Online v.1.2 [26]. The alignment
was checked for restriction sites of the restriction enzymes giving
highest REPK scores and for the correctness of the proposed fragment
length using the NEB cutter V2.0 online search tool [27]. The
enzymes were ranked as proposed by Engebretson and Moyer [28]
according to (i) the number of total terminal restriction fragments
(i.e. richness of T-RFs) with the constraints that the fragment length
ranged between 50 and 550 bp and a minimum discriminating
length difference of at least three basepairs to account for the
resolution power of the capillary electrophoresis, (ii) the percentage
of sequences with no restriction site for the respective enzyme
as well as (iii) the percentage of sequences with T-RFs < 50 bp.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สมุดรายวันยุโรปของชีววิทยาดินโพรโทคอ T RFLP ประเมิน sensitively วิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมและการเปลี่ยนแปลงชุมชนของอัลเคนดินลดแบคทีเรียวิธีการ2.1. การประเมินผลของเอนไซม์จำกัดสำหรับ alkB T-RFLPฐานข้อมูลระเบิดถูกค้นหาทั้งหมด หรือบางส่วนลำดับยีน alkB กับ alkB ลี putida P1 (AJ233397)และ sp. Rhodococcus Q15 alkB1 (AF388182) ลำดับเป็นข้อมูลอ้างอิงใช้ blastn พื้นฐานค้นหาตำแหน่งเครื่องมือ [22] ผลลัพธ์ที่ได้counterchecked กับการ blastx โปรตีนฐานข้อมูลค้นหา [23]บัญชีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เกี่ยวข้องกับ monooxygenase อัลเคนลำดับที่เหมาะสมสอดคล้องกับ BioEdit [24] โดยใช้ClustalW ตำแหน่งเครื่องมือ [25] เฉพาะ ลำดับที่มีการผูกสำหรับไพรเมอร์ alkB experimentally ใช้ (ดูส่วนขยาย PCR) ถูกรวมอยู่ในข้อจำกัดเพิ่มเติมการเลือกเอนไซม์ ดึงข้อมูลตำแหน่งรวม 83 ลำดับได้ด้วยตนเองการตรวจสอบ และอัปโหลดไปยังโปรแกรมออนไลน์เอนไซม์จำกัดตัวเลือก (REPK) ออนไลน์ v.1.2 [26] การจัดตำแหน่งตรวจสอบข้อจำกัดการท่องเที่ยวของเอนไซม์จำกัดให้สูงสุด REPK คะแนนและ ความถูกต้องของส่วนนำเสนอความยาวโดยใช้เครื่องมือค้นหาออนไลน์ V2.0 ของตัด NEB [27] ที่เอนไซม์ถูกจัดอันดับเป็นที่เสนอ โดย Engebretson และ Moyer [28]ตามการกระจายตัว (i) จำนวนรวมเทอร์มินัลจำกัด(เช่นร่ำรวย T RFs) ด้วยข้อจำกัดที่ความยาวของส่วนอยู่ในช่วงระหว่าง 50 และ 550 bp และการเหยียดพวกผิวต่ำความแตกต่างความยาวของ basepairs น้อยสามการพลังงานความละเอียดของเส้นเลือดฝอย electrophoresis, (ii) เปอร์เซ็นต์ลำดับกับไซต์ไม่จำกัดสำหรับเอนไซม์เกี่ยวข้องและ (iii) เปอร์เซ็นต์ของลำดับกับ T-RFs < 50 bp

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วารสารยุโรปชีววิทยาดิน
ประเมินโปรโตคอล T-RFLP เพื่อละม่อมวิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรม
และการเปลี่ยนแปลงชุมชนของดินเคนย่อยสลายแบคทีเรีย
วิธี
2.1 การประเมินผลของเอนไซม์ข้อ จำกัด สำหรับ alkB T-RFLP
ฐานข้อมูล BLAST ถูกค้นสำหรับทั้งสมบูรณ์หรือบางส่วน
alkB ลำดับยีนกับ Pseudomonas putida P1 alkB (AJ233397)
และ Rhodococcus SP Q15 alkB1 (AF388182) ลำดับเป็นข้อมูลอ้างอิง
โดยใช้ไทด์พื้นฐานการจัดเครื่องมือค้นหา [22] ผลลัพธ์ที่ได้
counterchecked ด้วยการค้นหาฐานข้อมูลโปรตีน blastx [23] เพื่อ
บัญชีสำหรับลำดับเบสที่เกี่ยวข้องกับเคน monooxygenase.
ลำดับที่เหมาะสมถูกสอดคล้องกับ BioEdit [24] โดยใช้
เครื่องมือการจัดตำแหน่ง ClustalW [25] เฉพาะลำดับมี
เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันสำหรับไพร alkB ทดลองใช้ (ดู
ส่วน PCR-ขยาย) ถูกรวมสำหรับข้อ จำกัด ต่อ
การเลือกเอนไซม์ การจัดตำแหน่งที่ดึงมารวม 83 ลำดับ
และได้รับการตรวจสอบด้วยตนเองและอัปโหลดไปยังโปรแกรมออนไลน์
จำกัด เอนไซม์ Picker (REPK) v.1.2 ออนไลน์ [26] การจัดตำแหน่งที่
ได้รับการตรวจสอบเว็บไซต์ที่ข้อ จำกัด ของเอนไซม์ข้อ จำกัด การให้
คะแนนสูงสุด REPK และความถูกต้องของชิ้นส่วนที่นำเสนอ
ระยะเวลาในการใช้เครื่องตัด NEB V2.0 เครื่องมือค้นหาออนไลน์ [27]
เอนไซม์ที่ได้รับการจัดอันดับให้เป็นที่เสนอโดย Engebretson และ Moyer [28]
ตาม (ก) จำนวนของชิ้นส่วนข้อ จำกัด รวมขั้ว
(เช่นความมีชีวิตชีวาของ T-RFs) ที่มีข้อ จำกัด ที่มีความยาวส่วน
อยู่ระหว่าง 50 และ 550 bp และแบ่งแยกขั้นต่ำ
ความแตกต่างที่มีความยาวไม่น้อยกว่าสามเบสบัญชีสำหรับ
พลังงานความละเอียดของอิเล็กฝอย (ii) อัตราร้อยละ
ของลำดับกับเว็บไซต์ไม่มีข้อ จำกัด สำหรับการทำงานของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง
เช่นเดียวกับ (iii) อัตราร้อยละของลำดับกับ T-RFs <50 bp .

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยุโรปวารสารดินชีววิทยา
ประเมิน t-rflp โปรโตคอลที่จะ sensitively วิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมและโครงสร้างของดินการเปลี่ยนแปลงชุมชน


วิธีการย่อยสลายเชื้อโรค 2.1 . การประเมินผลของเอนไซม์สำหรับ alkb t-rflp
ระเบิดฐานข้อมูลค้นหาให้สมบูรณ์หรือบางส่วน
alkb ยีน ลำดับกับ Pseudomonas enrichment P1 alkb ( aj233397 )
rhodococcus sp . และq15 alkb1 ( af388182 ) ลำดับที่อ้างอิง
ใช้ blastn พื้นฐานเครื่องมือค้นหาแนว [ 22 ] ผลลัพธ์ที่ได้
counterchecked blastx โปรตีนกับฐานข้อมูลการค้นหา [ 23 ]
บัญชีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้าง monooxygenase .
ลำดับเหมาะสม อยู่ชิดกับ bioedit [ 24 ] การใช้เครื่องมือจัด clustalw
[ 25 ] เฉพาะลำดับมี
เว็บไซต์รวมเพื่อใช้ไพรเมอร์ ( เห็นผล alkb
ส่วน PCR ( ) คือต่อไป
เอนไซม์จำกัดการเลือก การดึงแนวร่วมรวม 83 ลำดับ
และด้วยตนเองตรวจสอบและอัปโหลดไปยังโปรแกรมออนไลน์
เอนไซม์ จำกัด ตัวเลือก ( repk ) เกมออนไลน์ v.1.2 [ 26 ] การตรวจสอบข้อ จำกัด เว็บไซต์

ของเอนไซม์ให้คะแนนสูงสุด repk และความถูกต้องของการเสนอส่วน
ความยาวโดยใช้เอ็นตัด v2.0 เครื่องมือค้นหา [ 27 ]
ไอโซอันดับที่เสนอโดย engebretson และมอยเออร์ [ 28 ]
ตาม ( ผม ) จำนวนรวมเทอร์มินัลจำกัดชิ้นส่วน
( เช่นความอุดมสมบูรณ์ของ t-rfs ) ด้วยข้อจำกัดที่ fragment length
อยู่ระหว่าง 50 และ 550 BP และแบ่งแยก
น้อยความแตกต่างของความยาวอย่างน้อยสามพบบัญชีสําหรับ
มติพลังของผู้ชม ( 2 ) ร้อยละ
ของลำดับด้วยไม่มีข้อ จำกัด เว็บไซต์สำหรับ
เอนไซม์เกี่ยวข้อง ตลอดจน ( 3 ) ร้อยละของลำดับด้วย t-rfs < 50 BP .