Purification of wild-type LipBL and

Purification of wild-type LipBL and variants after co-expression with chaperones.
Wild-type LipBL and its variants were coexpressed with the GroEL/GroES chaperone system and cells were disrupted to separate soluble proteins from inclusion bodies, as described above. LipBL and variants carrying a His6-tag were purified from soluble fractions by immobilized metal-affinity chromatography (IMAC) using a gravity-flow Ni-NTA agarose column (Qiagen). Before loading onto the column, the soluble fraction was incubated with 2 mM ATP for 10 min at 37 uC to dissociate recombinant enzyme from chaperone. After removal of non-specifically bound proteins by washing with 100 mM Tris/HCl buffer, pH 8, supplemented with 300 mM NaCl and 40 mM imidazole, LipBL and variants were eluted with the same buffer containing 250 mM imidazole. Elution fractions containing His6-tagged LipBL and variants were diluted 50-fold and concentrated using centrifugal filter units with 10 kDa size-exclusion membranes (Centricon,Millipore) to reduce the concentration of imidazole, which interferes with activity assays. Protein concentrations were determined after purification using Advanced Image Data Analysis (AIDA) 2D software (version 4.18.028) with a calibration curve based on BSA

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บริสุทธิ์ของป่าชนิด LipBL และตัวแปรหลังจากการแสดงร่วมกับครู ป่าชนิด LipBL และตัวแปรที่ถูก coexpressed กับระบบพี่เลี้ยงของ GroEL/GroES และเซลล์ถูกหยุดชะงักในการแยกโปรตีนที่ละลายน้ำจากร่างกายรวม ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น LipBL และตัวแปรต่าง ๆ ในการดำเนินการ His6-แท็กถูกบริสุทธิ์จากเศษส่วนที่ละลายน้ำได้ โดยการถูกตรึงกับโลหะความสัมพันธ์ chromatography (IMAC) โดยใช้คอลัมน์ Ni NTA agarose ไหลแรงโน้มถ่วง (Qiagen) ก่อนที่จะโหลดลงในคอลัมน์ เศษส่วนละลาย incubated มี ATP 2 มม.สำหรับ 10 นาทีที่ 37 uC จะแยกตัวออก recombinant เอนไซม์จากพี่เลี้ยง หลังจากการกำจัดไม่ใช่เฉพาะผูกโปรตีนซักด้วยบัฟเฟอร์ ตรี/HCl 100 mM, pH 8 เสริม ด้วยอิมิดาโซล 40 มม. และ 300 มม. NaCl LipBL และตัวแปรถูก eluted กับบัฟเฟอร์เดียวกันที่ประกอบด้วยอิมิดาโซล 250 มม. ถูกเจือจางชะเศษส่วนที่ประกอบด้วยแท็ก His6 LipBL และสายพันธุ์ 50-fold และเข้มข้นการใช้แรงเหวี่ยงกรองด้วย 10 kDa ขนาดแยกเยื่อหุ้ม (Centricon มิลลิพอร์) เพื่อลดความเข้มข้นของอิมิดาโซล ซึ่งรบกวนกิจกรรม assays กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนหลังจากการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ขั้นสูงภาพข้อมูลวิเคราะห์ (AIDA) ซอฟต์แวร์ 2D (รุ่น 4.18.028) โค้งเทียบอิงจากบีเอสเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ของป่าประเภท LipBL และตัวแปรหลังจากร่วมแสดงออกกับครูใหญ่.
ป่าชนิด LipBL และตัวแปรของมันถูก coexpressed ด้วย / groes ระบบพี่เลี้ยง GroEL และเซลล์กระจัดกระจายในการแยกโปรตีนที่ละลายน้ำจากร่างกายรวมตามที่กล่าวไว้ข้างต้น LipBL และตัวแปรแบก His6 แท็กถูกบริสุทธิ์จากเศษส่วนที่ละลายน้ำได้โดยโครมาตรึงโลหะความสัมพันธ์ (IMAC) โดยใช้แรงโน้มถ่วงไหล Ni-NTA คอลัมน์ agarose (Qiagen) ก่อนที่จะโหลดลงในคอลัมน์ส่วนที่ละลายน้ำได้ถูกบ่มกับ 2 mm เอทีพีเป็นเวลา 10 นาทีที่ 37 UC ที่จะแยกตัวออกเอนไซม์ recombinant จากพี่เลี้ยง หลังจากที่กำจัดของโปรตีนที่ไม่ใช่เฉพาะผูกพันตามล้างด้วย 100 มิลลิเมตร Tris / HCl บัฟเฟอร์ค่า pH 8 ได้เสริมด้วย NaCl 300 มิลลิเมตรและ 40 มิลลิเมตร imidazole, LipBL และตัวแปรถูกชะด้วยบัฟเฟอร์เดียวกันที่มี 250 มิลลิ imidazole เศษส่วน elution มี His6 ติดแท็ก LipBL และตัวแปรเจือจาง 50 เท่าและเข้มข้นใช้หน่วยกรองแรงเหวี่ยงที่มี 10 กิโลดาลตันเยื่อขนาดยกเว้น (Centricon, อร์ค) เพื่อลดความเข้มข้นของ imidazole ซึ่งเป็นอุปสรรคกับการวิเคราะห์กิจกรรม ความเข้มข้นของโปรตีนได้รับการพิจารณาหลังจากที่บริสุทธิ์โดยใช้ซอฟแวร์ขั้นสูงภาพวิเคราะห์ข้อมูล (AIDA) 2D (รุ่น 4.18.028) กับเส้นโค้งการสอบเทียบบนพื้นฐานของบีเอสเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ lipbl ความเหมือนกับสายพันธุ์หลังจาก Co การแสดงออกกับผู้ดูแล .lipbl ชนิดป่าและตัวแปรของจำนวน coexpressed กับโกรล / groes คนคุมระบบ และเซลล์มีการหยุดชะงักเพื่อแยกโปรตีนที่ละลายน้ำได้จากการรวมร่างของตามที่อธิบายไว้ข้างต้น lipbl และสายพันธุ์ที่ถือ his6 แท็กมีความบริสุทธิ์จากละลาย เศษส่วน โดยตรึงโลหะขี้รังแค ( iMac ) โดยใช้แรงโน้มถ่วงไหล NTA , นิคอลัมน์ ( เพิ่ม ) ก่อนการโหลดลงบนคอลัมน์ส่วนที่ละลายน้ำ ) กับ 2 mm เอทีพี 10 นาทีที่ 37 เป็นต้นเพื่อแยกโปรตีนเอนไซม์ จากพี่ใหญ่ หลังจากเอาของไม่เฉพาะผูกพันโปรตีน โดยล้างกับ 100 มม. โดย / HCl บัฟเฟอร์ พีเอช 8 เติม 300 mM NaCl อิมิดาโซลและ 40 มม. และมีตัวอย่าง lipbl สายพันธุ์เดียวกันกับบัฟเฟอร์ที่มีอิมิดาโซล 250 มิลลิเมตร ใช้เศษส่วนที่มี his6 แท็ก lipbl และตัวแปรลด 50 พับและเข้มข้นโดยใช้หน่วยกรองแรงเหวี่ยงขนาด 10 กิโลดาลตันส่วนเยื่อ ( centricon มิลลิ , ) เพื่อลดความเข้มข้นของจิบะ มาโมรุ ซึ่งรบกวนทดสอบกิจกรรม ความเข้มข้นของโปรตีนพบว่าหลังจากฟอกโดยใช้ข้อมูลภาพการวิเคราะห์ขั้นสูง ( Aida ) 2D ซอฟต์แวร์ ( รุ่น 4.18.028 ) เป็นรูปโค้งตามของบีเอสเอ