MATERIALS AND METHODSAlgal strainsT

MATERIALS AND METHODS
Algal strains
The host organism, Stephanopyxis palmeriana (NF-D-SPA-1 strain), was provided by the National Fisheries Research and Development Institute in Korea and verified by sequence analysis of the large-subunit (26S) rDNA D1 / D2 domain and the 18S rDNA gene (Kooistra et al. 2003, Medlin and Kaczmarska 2004, Rynearson et al. 2006). The host was cultured in modified f/2 medium (Guillard 1973) under a 12 L : 12 D cycle of 80-90 μmol photons m-2 s-1 with cool-white fluorescent illumination at 20°C.
Isolation of virus particles
Seawater samples were collected at Jaran bay, Korea, between May and October 2008 and prefiltered through 0.8 μm pore-size polycarbone filters (Nuclepore, Pleasanton, CA, USA). The logarithmic phase cultures of Stephanopyxis palmeriana (Fig. 1B) were challenged with the seawater samples filtered through 0.8 μm pore-size polycarbone filters (Nuclepore) and incubated under the condition mentioned above. Then, to confirm the virus particles, the S. palmeriana cultures were checked with the lysate filtered through 0.2-μm-pore-size Dismic-25cs filter (Advantec, Charlotte, NC, USA) Screening and cloning procedure was almost according to the method of Tarutani et al. (2001). In total, 100 mL of S. palmeriana logarithmic-phase cultures was inoculated with 20 mL of filtered seawater and incubated under the same conditions described above
Growth experiment
Cultures containing 500 mL of exponentially growing host cells were inoculated with 20 mL of lysate containing SpalV at a viral titer of 3.0 × 106 estimated by the most probable number; cell density and virus titer were then respectively measured using light microscopy and the extinction dilution method (Tarutani et al. 2001) every 24 h until 120 h postinoculation (hpi) (Fig. 2). And the host range of SpalV was examined by adding 50 μL of the original pathogen suspension to each 1 mL culture of exponentially growing algal strains listed in Table 1. Each culture was incubated under the culture conditions described above and observed under a light microscope.
Transmission electron microscopy (TEM)
The morphology of SpalV was observed using a TEM. S. palmeriana cultures were inoculated with SpalV, samples (10 mL) were collected at 0, 24, 48, 72, 80, and 92 hpi, and fixed with 1% glutaraldehyde in f/2 for 2 h at 4°C. Cells were harvested by centrifugation at 3,000 rpm for 20 min, and then post-fixed for an additional 1 h with 2% osmium tetroxide at 4°C. Following two rinses with phosphate buffered saline buffer, the pellet was dehydrated in a graded ethanol series (20-100%) and embedded in Poly/Bed 812 resin (Polyscience, Inc., Warrington, PA, USA). Thin sections were stained with 4% uranyl acetate and 3% lead citrate, and observed using a TEM (JEOL JEM-1010; Jeol, Tokyo, Japan) with an acceleration voltage of 60 kV.
The VLPs were also observed in negative staining with 4% uranyl acetate using a transmission electron microscope. Briefly, a drop of purified virus suspension was mounted on a grid for 30 s, and excess water was removed using filter paper. Then, a drop of 4% uranyl acetate was mounted on the grid for 10 s, and removed using filter paper. After the grid was dried, the grids were observed using TEM with the same conditions as above. Particle diameters were estimated using the negatively stained images.
Storage
The effect of storage temperature on SpalV infectivity was examined according to the method of Tomaru et al. (2005). An exponentially growing culture of S. palmeriana was inoculated with the virus and incubated for 7 days. Then the resultant lysate was sequentially passed through 0.8-μm and 0.22-μm filters to remove cell debris. The titer of the fresh lysate estimated using the extinction diluruses
tition
method was 2.6 × 107 infectious units mL-1. Aliquots of the lysate were stored at 20, 15, 4, and -196°C (liquid nitrogen) under light or dark conditions with or without 10 or 20% dimethyl sulfoxide (DMSO) as cryoprotectant, and re-titrated using the extinction dilution method.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการสายพันธุ์ algalโฮสต์มีชีวิต Stephanopyxis palmeriana (ต้องใช้ NF-D-สปา-1), โดยชาติประมง สถาบันวิจัยและพัฒนาในประเทศเกาหลี และตรวจสอบ โดยการวิเคราะห์ของ rDNA ขนาดใหญ่งานย่อย (26S) ง 1 / D2 โดเมนและยีน rDNA 18S (Kooistra et al. 2003, Medlin และ Kaczmarska 2004, Rynearson et al. 2006) โฮสต์ถูกอ่างในแก้ไข f/2 (Guillard 1973) ภายใต้วงจร L 12:12 D 80-90 μmol photons m 2 s-1 มีรัศมีเรืองแสงสีขาวเย็นที่ 20 องศาเซลเซียสแยกอนุภาคไวรัสตัวอย่างน้ำทะเลถูกรวบรวมไว้ที่อ่าว Jaran เกาหลี พฤษภาคมและเดือน 2008 ตุลาคม และ prefiltered ผ่าน μm 0.8 polycarbone ขนาดรูกรอง (Nuclepore, Pleasanton, CA, USA) วัฒนธรรมระยะลอการิทึมของ Stephanopyxis palmeriana (Fig. 1B) ถูกท้าทายกับตัวอย่างน้ำทะเลที่ถูกกรองผ่านกรอง 0.8 μm polycarbone ขนาดรูขุมขน (Nuclepore) และ incubated ภายใต้เงื่อนไขดังกล่าวข้างต้น แล้ว ยืนยันอนุภาคไวรัส S. palmeriana วัฒนธรรมได้ตรวจสอบกับที่ lysate กรองถึง 0.2-μm-รูขุมขนขนาด Dismic-25cs กรอง (Advantec ชาร์ลอตต์ NC, USA) ขั้นตอนการตรวจกรอง และโคลนถูกเกือบตามวิธีของ Tarutani et al. (2001) รวม 100 mL ของ S. palmeriana ลอการิทึมระยะวัฒนธรรม inoculated กับ 20 mL ของน้ำทะเลกรอง และ incubated ภายใต้เงื่อนไขเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้นทดลองการเจริญเติบโตวัฒนธรรมที่ประกอบด้วยขนาด 500 มล.ของโฮสต์เซลล์การเจริญเติบโตเป็นทวีคูณเมื่อได้ inoculated กับ 20 mL ของ SpalV lysate มีที่ titer ไวรัสของ 3.0 × 106 ประเมินเป็นตัวเลขน่าเป็นที่สุด ความหนาแน่นของเซลล์และไวรัส titer ได้แล้วตามลำดับวัดโดยใช้แสง microscopy และวิธีเจือจางสูญพันธุ์ (Tarutani et al. 2001) ทุก 24 ชมจนถึง 120 h postinoculation (hpi) (Fig. 2) และช่วง SpalV โฮสต์ถูกตรวจสอบ โดยการเพิ่ม μL 50 ของระงับการศึกษาเดิมวัฒนธรรม 1 mL แต่ละสายพันธุ์ algal ที่แสดงในตารางที่ 1 การเจริญเติบโตขยายตัวอย่างมาก แต่ละวัฒนธรรมมี incubated ภายใต้เงื่อนไขวัฒนธรรมข้าง และสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสงส่งอิเล็กตรอน microscopy (ยการ)สัณฐานวิทยาของ SpalV ถูกตรวจสอบการใช้การยการ วัฒนธรรม S. palmeriana มี inoculated กับ SpalV ตัวอย่าง (10 มล.) ได้รวบรวมไว้ ที่ 0, 24, 48, 72, 80, 92 hpi และถาวรกับ 1% glutaraldehyde ใน f/2 สำหรับ h 2 ที่ 4 องศาเซลเซียส เซลล์ได้เก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ 3000 rpm สำหรับ 20 นาที แล้ว หลังถาวรสำหรับ h 1 เพิ่มเติมการ มีเทโตรไซด์ออสเมียม 2% ที่ 4 องศาเซลเซียส ต่อ rinses 2 กับฟอสเฟต buffered saline บัฟเฟอร์ เม็ดถูกอบแห้งในชุดมีการจัดระดับเอทานอล (20-100%) และฝังอยู่ในยางโพลี/เตียง 812 (Polyscience, Inc., Warrington, PA สหรัฐอเมริกา) ส่วนบางสี acetate uranyl 4% และ 3% รอซิเตรต และสังเกตการใช้ยการ (JEOL JEM 1010 Jeol โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) ด้วยความแรงเร่ง 60 kVVLPs ยังสุภัคย้อมสีลบด้วย 4% uranyl acetate ใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนส่ง สั้น ๆ หยดระงับไวรัสบริสุทธิ์ถูกติดตั้งบนตาราง 30 s และเกินน้ำถูกเอาออกโดยใช้กระดาษกรอง แล้ว หยด 4% uranyl acetate ถูกติดตั้งให้บนตารางสำหรับ 10 s และเอาใช้กระดาษกรอง หลังจากที่ตารางถูกแห้ง กริดถูกสังเกตยการด้วยเงื่อนไขเดียวกันกับข้างบน อนุภาคสมมาตรถูกประเมินโดยใช้ภาพในเชิงลบทิ้งคราบจัดเก็บข้อมูลผลของอุณหภูมิในการเก็บ SpalV infectivity ถูกตรวจสอบตามวิธีการของโทมารุ et al. (2005) วัฒนธรรมการสร้างการเติบโตของ S. palmeriana inoculated ไวรัส และ incubated 7 วัน แล้วลำดับ resultant lysate ที่ผ่านให้ 0.8-μm และ μm $ 0.22 กรองเอาเศษเซลล์ Titer ของสด lysate ประเมินใช้ diluruses ดับtition2.6 × 107 หน่วยโรคติดเชื้อ mL-1 วิธีได้ Aliquots ของ lysate ที่ถูกเก็บไว้ที่ 20, 15, 4 และ-196 ° C (ไนโตรเจนเหลว) ภายใต้สภาพแสง หรือมืด หรือ ไม่ 10 หรือ 20% dimethyl sulfoxide (DMSO) เป็น cryoprotectant และใหม่ titrated ใช้วิธีเจือจางสูญพันธุ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการสาหร่ายสายพันธุ์สิ่งมีชีวิตเจ้าภาพStephanopyxis palmeriana (NF-D-SPA-1 สายพันธุ์) ได้จัดไว้ให้โดยการวิจัยประมงแห่งชาติสถาบันวิจัยและพัฒนาในประเทศเกาหลีและตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ลำดับของหน่วยย่อยขนาดใหญ่ (26S) rDNA D1 / โดเมน D2 และยีน 18S rDNA (Kooistra et al. 2003 Medlin และ Kaczmarska 2004 Rynearson et al. 2006) เป็นเจ้าภาพเลี้ยงในการแก้ไข f / 2 ขนาดกลาง (Guillard 1973) ภายใต้ 12 L:. 12 D วงจรของไมโครโมลโฟตอน 80-90 เมตร-2 s-1 ที่มีไฟส่องสว่างเรืองแสงเย็นสีขาวที่ 20 ° C แยกอนุภาคไวรัสน้ำทะเลเก็บตัวอย่างที่ Jaran อ่าวเกาหลีระหว่างเดือนพฤษภาคมและตุลาคม 2008 และผ่าน prefiltered 0.8 ไมโครเมตรรูขุมขนขนาดกรอง polycarbone (Nuclepore, เพล, CA, USA) วัฒนธรรมเฟสลอการิทึมของ Stephanopyxis palmeriana (รูป. 1B) ถูกท้าทายกับตัวอย่างน้ำทะเลกรองผ่าน 0.8 ไมโครเมตรรูขุมขนขนาดกรอง polycarbone (Nuclepore) และบ่มภายใต้เงื่อนไขดังกล่าวข้างต้น จากนั้นเพื่อยืนยันอนุภาคไวรัสวัฒนธรรม palmeriana เอสได้รับการตรวจสอบกับ lysate กรองผ่าน 0.2 ไมครอนรูขุมขนขนาด Dismic-25cs กรอง (Advantec, Charlotte, NC, USA) ขั้นตอนการคัดกรองและโคลนเกือบตามวิธีการ ของ Tarutani et al, (2001) โดยรวมแล้ว 100 มลเอส palmeriana วัฒนธรรมลอการิทึมเฟสได้รับเชื้อด้วย 20 มลของน้ำทะเลที่ผ่านการกรองและบ่มภายใต้เงื่อนไขเดียวกันที่อธิบายข้างต้นการทดสอบการเจริญเติบโตของวัฒนธรรมที่มี500 มิลลิลิตรชี้แจงการเจริญเติบโตของเซลล์โฮสต์ถูกเชื้อ 20 มิลลิลิตร lysate มี SpalV ที่ titer ไวรัส 3.0 × 106 ประมาณจากจำนวนน่าจะเป็นที่สุดนั้น ความหนาแน่นของเซลล์และ titer ไวรัสจากนั้นก็วัดตามลำดับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงและวิธีการลดสัดส่วนการสูญพันธุ์ (Tarutani et al. 2001) ทุก 24 ชั่วโมงจนถึง 120 ชั่วโมง postinoculation (HPI) (รูป. 2) และช่วงโฮสต์ของ SpalV ถูกตรวจสอบโดยการเพิ่ม 50 ไมโครลิตรของการระงับเชื้อโรคเดิมให้กับแต่ละวัฒนธรรมมิลลิลิตร 1 ของการเจริญเติบโตชี้แจงสายพันธุ์สาหร่ายที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 แต่ละวัฒนธรรมถูกบ่มภายใต้เงื่อนไขที่กล่าวไว้ข้างต้นวัฒนธรรมและสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์. ส่ง กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (TEM) สัณฐานวิทยาของ SpalV ที่ได้รับการตั้งข้อสังเกตการใช้ TEM เอสวัฒนธรรม palmeriana ถูกเชื้อด้วย SpalV ตัวอย่าง (10 มิลลิลิตร) ถูกเก็บที่ 0, 24, 48, 72, 80, และ 92 HPI และแก้ไขด้วย glutaraldehyde 1% f / 2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 3,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีและจากนั้นโพสต์คงที่สำหรับอีก 1 ชั่วโมงกับ 2% ออสเมียม tetroxide ที่ 4 ° C ต่อไปนี้สอง rinses กับฟอสเฟตบัฟเฟอร์บัฟเฟอร์น้ำเกลือเป็นเม็ดแห้งในซีรีส์เอทานอลอย่างช้า ๆ (20-100%) และฝังตัวอยู่ในโพลี / ที่พัก 812 เรซิน (PolyScience, Inc วอร์ริง, PA, สหรัฐอเมริกา) บางส่วนถูกย้อมด้วยสี 4% acetate uranyl และซิเตรตนำ 3% และตั้งข้อสังเกตการใช้ TEM. (JEOL JEM-1010; Jeol โตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ที่มีแรงดันไฟฟ้าเร่งความเร็ว 60 กิโลโวลต์VLPs ถูกตั้งข้อสังเกตในการย้อมสีลบกับ 4 % acetate uranyl ใช้อิเล็กตรอนส่งกล้องจุลทรรศน์ สั้น ๆ , การลดลงของการระงับไวรัสบริสุทธิ์ถูกติดตั้งบนตารางสำหรับ 30 วินาทีและน้ำส่วนเกินจะถูกลบออกโดยใช้กระดาษกรอง จากนั้นลดลงจากอะซิเตท uranyl 4% ได้รับการติดตั้งอยู่บนตารางเวลา 10 วินาทีและลบออกโดยใช้กระดาษกรอง หลังจากตารางแห้ง, กริดถูกตั้งข้อสังเกตการใช้ TEM มีเงื่อนไขเดียวกับข้างต้น อนุภาคขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณโดยใช้ภาพสีในเชิงลบ. จัดเก็บผลของอุณหภูมิการเก็บรักษาในการติดเชื้อ SpalV ถูกตรวจสอบตามวิธีการของ Tomaru et al, (2005) วัฒนธรรมเติบโตชี้แจงของเอส palmeriana ได้รับเชื้อไวรัสและบ่มเป็นเวลา 7 วัน แล้ว lysate ผลก็ผ่านไปได้ตามลำดับผ่าน 0.8 ไมครอนและตัวกรอง 0.22 ไมครอนเพื่อเอาเศษเซลล์ titer ของ lysate สดคำนวณโดยใช้วิธีการสูญเสีย diluruses tition วิธีคือ 2.6 × 107 หน่วยติดเชื้อ mL-1 aliquots ของ lysate ถูกเก็บไว้ที่ 20, 15, 4 และ -196 ° C (ไนโตรเจนเหลว) ภายใต้แสงหรือมืดมีหรือไม่มี 10 หรือ 20% dimethyl sulfoxide (DMSO) เป็น cryoprotectant และปรับขนาดอีกครั้งโดยใช้การลดสัดส่วนการสูญพันธุ์ วิธี.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ

สายพันธุ์สาหร่าย เป็นสิ่งมีชีวิต stephanopyxis palmeriana ( nf-d-spa-1 เมื่อย ) จัดโดยสถาบันวิจัยและพัฒนาประมงแห่งชาติเกาหลี และตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ลำดับของใบใหญ่ ( 26 ) rDNA D1 / D2 โดเมนและ 18S rDNA ยีน ( kooistra et al . ในปี 2003 และ 2004 rynearson Medlin kaczmarska , et al . 2006 )เจ้าภาพเลี้ยงในแก้ไข F / 2 ) ( guillard 1973 ) ภายใต้ 12 L : 12 D วงจร 80-90 μ mol โฟตอนด้วยเย็นสีขาวเรืองแสงส่องสว่างที่สุด 20 ° C .

น้ำทะเลแยกไวรัสอนุภาคตัวอย่างอ่าว จรัล เกาหลี ระหว่างเดือนพฤษภาคมและตุลาคม 2008 และ prefiltered ผ่าน 0.8 μเมตร ขนาดรู polycarbone กรอง ( nuclepore Pleasanton CA , USA )ในวัฒนธรรมของ stephanopyxis palmeriana ลอการิทึม ) ( รูปที่ 1A ) ถูกท้าทายด้วยน้ำทะเลตัวอย่างกรองผ่านμ 0.8 M ขนาดรูพรุน polycarbone กรอง ( nuclepore ) โดยภายใต้เงื่อนไขที่กล่าวข้างต้น จากนั้นยืนยันอนุภาคไวรัส , S . palmeriana วัฒนธรรมที่ถูกตรวจสอบได้ด้วย lysate กรองผ่านตัวกรอง ( 0.2 - μ m-pore-size dismic-25cs ADVANTEC ชาร์ล็อตNC , USA ) และขั้นตอนการคัดกรองยีนเกือบตามวิธีการของ tarutani et al . ( 2001 ) รวม 100 ml . palmeriana ลอการิทึมของวัฒนธรรมเป็นเชื้อระยะ 20 มิลลิลิตร กรองน้ำทะเลโดยภายใต้เงื่อนไขเดียวกันที่อธิบายข้างต้น

ทดลองการเจริญเติบโตวัฒนธรรมที่มี 500 มิลลิลิตร ชี้แจงการโฮสต์เซลล์ปลูกเชื้อ 20 มิลลิลิตร lysate ที่มี spalv ที่ระดับไวรัส 3.0 × 106 ประมาณโดยหมายเลขที่น่าจะเป็นมากที่สุด ; ความหนาแน่นเซลล์และไวรัสชนิดแล้วตามลำดับการวัดโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงและการสูญพันธุ์ในวิธี tarutani et al . 2001 ) ทุก 24 ชั่วโมง จนเริ่ม 120 H ( HPI ) ( รูปที่ 2 )และโฮสต์ของช่วง spalv ถูกตรวจสอบโดยเพิ่ม 50 μลิตรระงับเชื้อโรคเดิมละ 1 มิลลิลิตรเพาะสาหร่ายสายพันธุ์เติบโตชี้แจงที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 แต่ละวัฒนธรรมก็บ่มภายใต้สภาพการเลี้ยงที่อธิบายข้างต้น และตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด ( TEM )

spalv สัณฐานวิทยาพบว่าใช้โปรแกรมอุณหภูมิ sวัฒนธรรม palmeriana ปลูกเชื้อด้วย spalv ตัวอย่าง ( 10 ml ) จำนวน 0 , 24 , 48 , 72 , 80 และ HPI 92 และถาวรกับ 1 % glutaraldehyde ใน F / 2 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศา เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการเหวี่ยงแยกที่ 3 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีและจากนั้นแก้ไขให้โพสต์ อีก 1 ชั่วโมงกับ 2% ออสเมียม tetroxide ที่อุณหภูมิ 4 องศา ตามด้วยเกลือฟอสเฟตสอง rinses ในบัฟเฟอร์เม็ดเป็นอบแห้งในระดับเอทานอลซีรีส์ ( 2-10 % ) และในเตียง โพลีเรซิ่น / 812 ฝังตัว ( polyscience , อิงค์ , วอร์ริงตัน , PA , USA ) ส่วนบางถูกย้อมด้วยเตตยูเรนิล 4 % และซิเตรทตะกั่ว 3 % และสังเกตการใช้ TEM ( จอล jem-1010 ; จอล , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ด้วยการเร่งความเร็วแรงดัน 60 กิโล .
ที่พบใน vlps ลบย้อมด้วยเตตยูเรนิล 4 % โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน . สั้น , หยดบริสุทธิ์ระงับไวรัสติดตั้งบนตารางสำหรับ 30 วินาที และน้ำส่วนเกินจะถูกลบออกโดยใช้กระดาษกรอง แล้วลดลงร้อยละยูเรนิลอะซิเตตติดตั้งบนตาราง 10 , และลบโดยใช้กระดาษกรอง หลังจากตารางก็แห้งกริดได้ใช้เต็มๆ ด้วยเงื่อนไขเดียวกันกับข้างต้น ขนาดอนุภาคประมาณใช้ลบคราบ

ภาพ เก็บผลของอุณหภูมิการเก็บรักษาต่อการติดเชื้อ spalv ทดสอบตามวิธีการของ tomaru et al . ( 2005 ) การเติบโตของวัฒนธรรมของ palmeriana ชี้แจงเป็นเชื้อจากไวรัสและบ่มเป็นเวลา 7 วันแล้วผลก็เป็น lysate ผ่าน 0.8 - μ M และ 0.22 - ตัวกรองμ M เอาเศษเซลล์ ไตเตอร์ของ lysate สดวิธีการสูญพันธุ์ diluruses

วิธีการ tition 2.6 × 107 ( หน่วยที่แน่นอน . เฉยๆของ lysate เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 , 15 , 4และ - 196 องศา C ( ไนโตรเจนเหลว ) ภายใต้แสงหรือมืด หรือไม่ 10 หรือ 20 % เต๊ะ ( DMSO ) เช่น น้ำยา และจะใช้วิธีเจือจางตลอดเวลานั่นเอง .