Nitric oxide mediates anti-inflamma

Nitric oxide mediates anti-inflammatory action of extracorporeal shock waves 1. Introduction Nitric oxide (NO) is a highly versatile signaling molecule playing a critical role in the nervous, immune and cardiovas-cular systems. No is generated in different cell types by at least three isoforms of NO synthase (NOS) through the conversion of L-arginine and oxygen into L-citrulline. Two enzymes, neuronal NOS (nNOS) and endothelial NOS (eNOS), are constitutively expressed and their enzymatic activity is ca2+ /calmodulin-dependent. These constitutive NOS (cNOS) are responsible for the production of physiological levels of NO involved in events such as vasodilation, angiogenesis, and neurotransmission [1]. The third enzyme is an inducible and Ca2+ -independent isoform of NOS (iNOS), virtually expressed in all cell types after stimulation with LPS and/or with different cytokines, such as interferon-£ (IFN-£), interleukin-1B (IL - 1B), or tumour necrosis factor-@ (TNF-@). Induction of iNOS expression occurs at the transcriptional level and is mediated by the early activation of some nuclear transcriptional factors, including NF-kB [2]. Massive amounts of NO produced by iNOS under pathological conditions (e.g., inflammatory diseases) are potentially harmful, especially when time-spatial regulation of iNOS expression becomes compromised. Shock waves (SW), defined as a sequence of single sonic pulses characterized by high peak pressure (100 MPa), fast pressure rise (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไนตริกออกไซด์ mediates การกระทำแก้อักเสบ extracorporeal กระแทกคลื่น 1 แนะนำไนตริกออกไซด์ (NO) เป็นโมเลกุล signaling สูงอเนกประสงค์เล่นบทบาทสำคัญในระบบประสาท ภูมิคุ้มกัน และ cardiovas cular ไม่ถูกสร้างขึ้นในเซลล์ต่างชนิด โดย isoforms น้อยสามของไม่ synthase (NOS) ผ่านการแปลง L-อาร์จินีนและออกซิเจนเป็น L-citrulline Constitutively จะแสดงสองเอนไซม์ หมายเลข neuronal (nNOS) และชุดหมายเลขที่บุผนังหลอดเลือด (eNOS), และกิจกรรมของเอนไซม์ในระบบคือ ca2 + /calmodulin-dependent ชุดหมายเลขเหล่านี้ขึ้น (cNOS) มีหน้าที่ในการผลิตของสรีรวิทยาระดับไม่เกี่ยวข้องกับเหตุการณ์ เช่น vasodilation, angiogenesis, neurotransmission [1] เอนไซม์ที่สามจะเป็น inducible และ Ca2 + -isoform อิสระของหมายเลข (iNOS), แทบแสดงในเซลล์ทุกชนิดหลังการกระตุ้น ด้วย LPS หรือ กับ cytokines ต่าง ๆ เช่นอินเตอร์เฟียรอน-£ (IFN- £), interleukin-1B (IL - 1B), หรือเนื้องอกการตายเฉพาะส่วนปัจจัย-@ (TNF- @) INOS นิพจน์ของการเหนี่ยวนำเกิดขึ้นที่ระดับ transcriptional และ mediated โดยเปิดช่วงของปัจจัยบางอย่างนิวเคลียร์ transcriptional รวม NF-kB [2] จำนวนขนาดใหญ่ผลิต โดย iNOS ภายใต้เงื่อนไขทางพยาธิวิทยา (เช่น อักเสบโรค) ไม่มีอันตราย โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อระเบียบเวลาปริภูมิของนิพจน์ iNOS จะสมบูรณ์ คลื่นกระแทก (SW), กำหนดเป็นลำดับของพัลส์เสียงเดียวโดยความดันสูงสุดสูง (100 แรง), รวดเร็วเพิ่มขึ้นความดัน (< 10 ns), และสั้น (10 สหรัฐ) วงจร ใช้ โดยมีเครื่องกำเนิดไฟฟ้าที่เหมาะสมไปยังพื้นที่เป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงกับความหนาแน่นของพลังงานในช่วง 0.003 0.890 mJ/mm Extraorporeal คลื่นช็อก (ESW) การรักษาครั้งแรกถูกใช้ในผู้ป่วยในปี 1980 การสลายนิ่ว [3] ในสิบปี เทคนิคนี้ได้ถูกเรียบร้อยแล้วจ้างเป็นการบำบัดแก้อักเสบในจำนวนโรคกระดูก [4] [5] pseudoarthrosis, calcarea tendinitis ของไหล่ epicondylitis [6,7] [8], fasciitis plantar ก๊อก [9], และหลายโรคเอ็นอักเสบ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ESW รักษาจะสามารถก่อให้เกิดการเพิ่มขึ้นของ neoangiogensis ในเอ็น [10] และฟื้นฟูของกล้ามเนื้อและเส้นเอ็นเนื้อเยื่อ [11] เพิ่มเติม genrally การเพิ่มการไหลเวียนของเลือดบริเวณบำบัดทันทีได้ถูกมักตรวจสอบ สังเกตทางคลินิกของการ vasodilatation ทันทีและพบห้องปฏิบัติการของการปรับปรุงของ angiogenesis บริเวณถือ ESW ทันทีให้ขึ้นสมมติฐาน ESW อาจ modulate ผลิตของหมายเลข ประการนี้ เราได้รายงานว่า ไม่มีผลิตไม่ใช่-enzymatically ของ L-อาร์จินีน/ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ผสมกับ ESW แม้ว่าการผลิตนี้ไม่จำเป็นต้องใช้สูงกว่าพลังงาน potencies (0.89 mJ/มม.) กว่าผู้จ้างทางคลินิก [12] เมื่อเร็ว ๆ นี้ เรามีสาธิต ESW ที่มีเข้ากันได้ทางคลินิกพลังงานหนาแน่น สามารถก่อให้เกิดการเพิ่มประสิทธิภาพของเอนไซม์ในระบบไม่มีการผลิตในเซลล์ resting [13] แน่นอน เราได้พบว่า ESW eNOS กิจกรรมที่เพิ่มอย่างรวดเร็ว และไม่มีผลิตใน umbilical มนุษย์เส้นเลือดเซลล์บุผนังหลอดเลือด (HU-VEC) อย่างไรก็ตาม มันเป็นนำออกใช้ต้องเก็บไว้ในจิตใจที่สูงระดับไม่ผลิต โดย iNOS อย่างกว้างขวางระหว่างการอักเสบ และที่ ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ NF-kB ยังเรียกใช้ ดังนั้น การประเมินผล ESW เรียกใช้ NF-kB, iNOS และ NF-kB-ขึ้นอยู่กับยีนอื่น ๆ เป็นพื้นฐานในการประเมินระดับโมเลกุล mechanism(s) ของการกระทำแก้อักเสบสังเกตทางคลินิกของ ESW ในการศึกษาปัจจุบัน เราตรวจสอบผลของ ESW เอ็ม nNOS กิจกรรมตัวเร่งปฏิกิริยา ไม่ผลิต เรียก ใช้ NF-kB, iNOS และ TNF-@นิพจน์ mRNA rat glioma C6 เซลล์ เซลล์เส้นถือเป็นรูปแบบโทรศัพท์มือถือ เพราะมันแสดงขึ้น และ inducible 2 ชุด วัสดุและวิธี 2.1 Reagents ที่ใช้สารเคมีทั้งหมดตลอดการศึกษาปัจจุบันได้จากซิก (มิลาน อิตาลี), 2.2 เซลล์วัฒนธรรมราษฎร์ glioma เซลล์บรรทัด C6 มีอ่างในดุลเบกโกของปรับเปลี่ยนของอีเกิ้ลขนาดกลาง (DMEM ประเทศเบลเยียม Whittaker, Cambrex วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ชีวภาพ) เสริม ด้วย 10% v/v ครรภ์วัวซีรั่ม (FBS ไบโอ Whittaker), 100 ยาเพนนิซิลลิน UI/ml, 100 ml/ยู จี streptomycin, glutamine 2 มม. gentamicin 40ug/ml, humidified บรรยากาศอากาศ 95%, 5% CO2 ที่ 37ºC 2.3 เงื่อนไขการรักษา ESW lithotripter มีแม่เหล็กไฟฟ้า (MODULITH slk ของอุปกรณ์ Storz แพทย์ AG, Switzerrland) ถูกใช้ตลอดการศึกษาปัจจุบัน 3 × 10 เซลล์มีอ่างใน 50 มม.จาน Petri ใน 2 ml และรับ ESW โดยตรงเน้นศูนย์กลางของจานภายใต้ ecograted กับ ESW เน้นศูนย์กลางของแผ่นภายใต้การควบคุมของ ecographic โดยตรง การวัดไม่มี 1.5 × 15 เซลล์ถูกชุบบน coverslips แก้วรับ ESW รักษา หลังจากที่รักษา ESW เซลล์ถูกรักษาไว้ในบรรยากาศ humidified air 95% และ 5% CO ที่ 37 ºC สำหรับเวลาระบุไว้ในแต่ละการทดลอง 2.4 ตะวันตก blotting วิธี C6 เซลล์ (3 × 10) ถูก lysed โดยการแช่แข็งซ้ำ ๆ และ thawing ในบัฟเฟอร์ HEPES 50 mM, dithiothreitol 1 mM ที่มีค่า pH 7.4, inhibitors EDTA และรติเอส 1 มม. หลังจาก centrifugation (16500 ซื้อ g ใน 30 นาทีที่ 4 ºC) เศษฝุ่นถูกล้าง ด้วย lysis บัฟเฟอร์ solubilized กับ CHAPS 20 มม. และ centrifuged (25000 × g ใน 30 นาทีที่ 4 ºC) เป็นส่วนลงตัวของการ cytoplasmatic และเยื่อเศษส่วน (40 ยูจีโปรตีน/เลน) ถูกโหลดไป 7.5% SDS polyacrylamide เจล หลังจาก electrophresis โปรตีนได้คืนในตา-ted กับเมมเบรน PVDF (Immobilon P หยดมาก โรม อิตาลี) และทำการวิเคราะห์คืนในตาตะวันตกโดยใช้แอนติบอดี monoclonal ต้าน eNOS (BD Transduction ปฏิบัติ Frankin ทะเลสาบ NJ สหรัฐอเมริกา) ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างที่ถูกกำหนด โดยวิธีการของแบรดฟอร์ด [14] 2.5 nNOS assay หมายเลขกิจกรรมที่ประเมิน โดยวัดการแปลงของ L - 2,3,4,5- [H] อาร์จินีนใน L - 2,3- [H] citrulline ตามวิธีการอธิบายไว้โดย Colasanti et al. [15] 2.6 เยอรมัน-2DA วิธีการผลิตไม่ถูก assayed ใช้ระบบตรวจสอบเยอรมัน 2DA อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [13] สั้น ๆ 10 อุ่ม diacetate 4,5-diaminofluorescein (เยอรมัน-2DA Alexis-Corp., San Diego, CA, USA) ถูกเพิ่มไปยังเซลล์อ่างฟรีในซีรั่ม และ incubated ที่ 37 ºC สำหรับ 10 นาที หลังจาก washings พร้อม PBS 1.2 มม. CaCl เซลล์ได้คงพร้อม 3% w/v paraformaldehyde ซูโครส 4% w/v และ fluorescence เซลถูก imaged ใช้เลเซอร์ confocal สแกนกล้องจุลทรรศน์ (Axioplan 2, 510 ทต้า Carl Zeiss, Gottingen เยอรมนี) พร้อมกับอาร์กอน (488 nm) คานในการกระตุ้น ความเข้มของเลเซอร์ ชัตเตอร์รูรับแสง และการตั้งค่าแสง/รวมได้เก็บคงที่ให้เปรียบเทียบความเข้มสัมพัทธ์ fluorescence ของเซลล์บำบัดกลุ่ม quantiative ภาพดิจิทัลมา และประมวลผลสำหรับการกำหนด fluorescence ในระดับเซลล์เดียว ใช้โปรแกรมโดเมนสาธารณะ 1.61 รูป NIH (พัฒนา ในสหรัฐอเมริกาแห่งชาติสถาบันของสุขภาพ และมี อินเทอร์เน็ตที่ 2.7 เห็นด้วยกะทดสอบนิวเคลียร์ บางส่วนของเซลล์ C6 ได้เตรียมตามออสบอร์ประกันภัยร้อยเอ็ด al. [16] และดำเนินการวิเคราะห์ EMSA ดังที่อื่น [17] อาร์เอ็นเอเตรียมและเหนือ 2.8 blot วิเคราะห์รวมเซลล์อาร์เอ็นเอที่แยกโดยใช้ Trizol รีเอเจนต์ (Invitrogen ชีวิตเทคโนโลยี คอร์ป คาร์ลส CA) ตัวอย่างของยูจี 40 ของอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกคั่น ด้วย electrophoresis ใน 1% agarose denaturing เจลในบัฟเฟอร์ MOPS และ blotted แล้ว เข้าสู่เมมเบรน Hybond N (เวลาออก Amersham ชาร์ฟอร์นเซนน้อย บักกิงแฮมเชอร์ อังกฤษ) เพื่อควบคุมปริมาณของอาร์เอ็นเอในแต่ละเลน เจมีสีกับโบรไมด์ ethidium ก่อน และ หลังการ blotting วิธีการ อาร์เอ็นเอที่เป็น มี DNA ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับหนู iNOS [15] ชื่อก่อนหน้านี้ โดย DECAprime II ดีเอ็นเอติดฉลากชุด (1.0-2.0 × 109 cpm/ยู จี Ambion, Austin, TX สหรัฐอเมริกา) ความเข้มของ hybridization มี visualized โดย autoradiography และนิพจน์ mRNA ถูก quantified โดยใช้โปรแกรมโดเมนสาธารณะ 1.61 รูป NIH (ที่สหรัฐอเมริกาแห่งชาติสถาบันของสุขภาพ และการพัฒนาบน Intet ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไนตริกออกไซด์ไกล่เกลี่ยดำเนินการป้องกันการอักเสบของคลื่นช็อก extracorporeal 1. บทนำไนตริกออกไซด์ (NO) เป็นโมเลกุลส่งสัญญาณหลากหลายมากมีบทบาทสำคัญในการประสาทระบบภูมิคุ้มกันและ cardiovas-cular ไม่มีถูกสร้างขึ้นในเซลล์ชนิดที่แตกต่างกันอย่างน้อยสามไอโซฟอร์มของเทส NO (NOS) ผ่านการแปลงของ L-arginine และออกซิเจนเข้าไปใน L-citrulline สองเอนไซม์ประสาท NOS (nNOS) และบุผนังหลอดเลือด NOS (eNOS) จะแสดง constitutively และเอนไซม์ของพวกเขาคือ Ca2 + / calmodulin ขึ้นอยู่กับ เหล่านี้เป็นส่วนประกอบ NOS (cNOS) มีความรับผิดชอบในการผลิตของระดับทางสรีรวิทยาของไม่มีส่วนร่วมในกิจกรรมดังกล่าวเป็น vasodilation, เจเนซิสและ neurotransmission [1] เอนไซม์ที่สามคือการกระตุ้นและ Ca2 + ไอโซฟอร์ม -independent ของ NOS (iNOS) แสดงความจริงในเซลล์ชนิดทั้งหมดหลังจากการกระตุ้นด้วย LPS และ / หรือ cytokines ที่แตกต่างกันเช่น interferon- ปอนด์ (IFN- ปอนด์), interleukin-1B (IL - 1B) หรือเนื้องอกเนื้อร้ายปัจจัย @ (TNF- @) การเหนี่ยวนำการแสดงออกของ iNOS เกิดขึ้นในระดับการถอดรหัสและเป็นผู้ไกล่เกลี่ยโดยการเปิดใช้งานเริ่มต้นของบางปัจจัยการถอดรหัสนิวเคลียร์รวมทั้ง NF-kB [2] จำนวนมหาศาลของการผลิตโดยไม่ iNOS ภายใต้เงื่อนไขทางพยาธิวิทยา (เช่นโรคอักเสบ) เป็นอันตรายที่อาจเกิดขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อการควบคุมเวลาในการแสดงออกเชิงพื้นที่ iNOS กลายเป็นที่ถูกบุกรุก คลื่นกระแทก (SW) กำหนดให้เป็นลำดับของพัลส์เสียงเดียวที่โดดเด่นด้วยความดันสูงสูงสุด (100 MPa) ความดันที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว (<10 NS) และวงจรชีวิตสั้น (10 เรา) จะถูกลำเลียงโดยเครื่องกำเนิดไฟฟ้าที่เหมาะสมในการที่เฉพาะเจาะจง พื้นที่เป้าหมายที่มีความหนาแน่นของพลังงานในช่วง 0.003-0.890 mJ / เดือน คลื่นช็อก Extraorporeal (ESW) การรักษาด้วยการถูกนำมาใช้ครั้งแรกในผู้ป่วยในปี 1980 ที่จะเลิกนิ่วในไต [3] ในช่วงสิบปีที่ผ่านเทคนิคนี้ได้รับการว่าจ้างประสบความสำเร็จเป็นยาต้านการอักเสบในจำนวนของโรคกระดูก [4] เช่น pseudoarthrosis [5], tendinitis Calcarea ของไหล่ [6,7] Epicondylitis [8] plantar fasciitis [9] และโรคเส้นเอ็นอักเสบหลาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งการรักษา ESW สามารถที่จะทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของ neoangiogensis ในเส้นเอ็น [10] และฟื้นฟูกล้ามเนื้อเส้นเอ็นและเนื้อเยื่อ [11] เพิ่มเติม genrally เพิ่มขึ้นทันทีในเลือดไหลในพื้นที่ได้รับการรักษาได้รับการปฏิบัติที่พบบ่อย การสังเกตทางคลินิกของภาวะหลอดเลือดขยายทันทีและผลการวิจัยในห้องปฏิบัติการของการเพิ่มประสิทธิภาพของเจเนซิสรอบพื้นที่ ESW ได้รับการรักษาทันทีก่อให้เกิดสมมติฐานที่ว่า ESW อาจปรับเปลี่ยนการผลิตของไม่มี ในส่วนนี้เราได้รายงานว่าไม่มีการผลิตเอนไซม์ที่ไม่ใช่การรักษาของ L-arginine / ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่มีส่วนผสม ESW แม้ว่าการผลิตที่ไม่ต้อง potencies พลังงานที่สูงขึ้น (0.89 mJ / mm) มากกว่าคนงานทางการแพทย์ [12] เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้แสดงให้เห็นว่า ESW ที่ความหนาแน่นของพลังงานที่เข้ากันได้ทางคลินิกมีความสามารถที่จะทำให้เกิดการเพิ่มประสิทธิภาพของการผลิตเอนไซม์ไม่มีในมือถือที่วางอยู่ [13] อันที่จริงเราได้แสดงให้เห็นว่า ESW ได้อย่างรวดเร็วเพิ่มความ eNOS กิจกรรมและการผลิตที่ไม่มีในหลอดเลือดดำสายสะดือมนุษย์เซลล์บุผนังหลอดเลือด (HU-VEC) แต่ก็เป็นสิ่งสำคัญที่จะเก็บไว้ในใจว่าระดับไม่สูงที่ผลิตโดย iNOS ถูกปล่อยออกมาในระหว่างการอักเสบและว่าภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ NF-kB ยังสามารถใช้งานได้ ดังนั้นการประเมินผล ESW ในการกระตุ้น NF-kB, iNOS และการแสดงออกของยีน NF-kB ขึ้นอยู่กับเป็นพื้นฐานในการประเมินกลไกในระดับโมเลกุล (s) ของข้อสังเกตทางคลินิกดำเนินการป้องกันการอักเสบของ ESW ในการศึกษาปัจจุบันเราตรวจสอบผลกระทบของ ESW ในการปรับของกิจกรรม nNOS เร่งปฏิกิริยาการผลิตไม่มีการเปิดใช้งาน NF-kB และ iNOS และ TNF- @ แสดงออกในหนู glioma เซลล์ C6, เซลล์นำมาเป็นรูปแบบโทรศัพท์มือถือเพราะ มันเป็นการแสดงออกทั้งส่วนประกอบและ inducible NOS 2. วัสดุและวิธีการ 2.1 การวิเคราะห์สารเคมีที่ใช้ตลอดการศึกษาในปัจจุบันมาจากซิก (มิลาน, อิตาลี) นอกจากที่ระบุไว้ 2.2 เซลล์วัฒนธรรมเซลล์ glioma หนูสาย C6 เป็นที่เลี้ยงใน Dulbecco ของการปรับเปลี่ยนขนาดกลางของนกอินทรี (DMEM; ไบโอ Whittaker, Cambrex ชีวภาพวิทยาศาสตร์, เบลเยียม) เสริมด้วย 10% ปริมาตร / ปริมาตรซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS; ไบโอ Whittaker) 100 UI / ยาปฏิชีวนะมล. 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร streptomycin, glutamine 2mm, 40ug / ml gentamicin ในบรรยากาศความชื้นของอากาศ 95%, 5% CO2 ที่37ºC 2.3 เงื่อนไข ESW รักษา lithotripter แม่เหล็กไฟฟ้า (MODULITH SLK อุปกรณ์ Storz AG แพทย์ Switzerrland) ถูกนำมาใช้ตลอดการศึกษาปัจจุบัน 3 × 10 เซลล์ที่ถูกเลี้ยงใน 50 มิลลิเมตรจานเลี้ยงเชื้อใน 2 มิลลิลิตรขนาดกลางและรับการรักษาด้วย ESW โดยตรงมุ่งเน้นไปที่ศูนย์ของแผ่นภายใต้ ecograted กับ ESW โดยตรงมุ่งเน้นไปที่ศูนย์ของแผ่นภายใต้การควบคุม ecographic เพื่อที่จะวัดการผลิต NO 1.5 × 15 เซลล์ถูกชุบใน coverslips แก้วหนึ่งวันก่อนการรักษา ESW หลังจากการรักษา ESW เซลล์ได้รับการดูแลในชั้นบรรยากาศความชื้นของอากาศ 95% บวก 5% CO ที่ 37 องศาเซลเซียสในช่วงเวลาที่ระบุไว้ในแต่ละการทดลอง 2.4 เซลล์ C6 ซับตะวันตก (3 × 10) ถูก lysed โดยการแช่แข็งและละลายซ้ำแล้วซ้ำอีกใน 50 มิลลิบัฟเฟอร์ HEPES ค่า pH 7.4 ที่มี dithiothreitol มิลลิ 1 EDTA 1 มิลลิและน้ำย่อย หลังจากการหมุนเหวี่ยง (16,500 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส) เศษส่วนอนุภาคถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์สลาย, ละลาย 20 มิลลิ CHAPS และหมุนเหวี่ยง (25,000 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส) aliquot ของ cytoplasmatic และเศษส่วนเมมเบรน ( 40 ไมโครกรัมโปรตีน / เลน) ถูกโหลดไป 7.​​5% เจลอะคริเลตระบบ SDS- หลังจาก electrophresis โปรตีนถูกลบ-ted เพื่อ PVDF เมมเบรน (Immobilon P, คสปา, โรม, อิตาลี) และการวิเคราะห์ดวงตะวันได้รับการดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน eNOS (BD Transduction ห้องปฏิบัติการ, Frankin ทะเลสาบ, NJ, สหรัฐอเมริกา) ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างถูกกำหนดโดยวิธีการของแบรดฟอ [14] 2.5 nNOS ทดสอบกิจกรรม NOS เป็นที่คาดกันโดยการวัดการเปลี่ยนแปลงของ L-2,3,4,5- [H] arginine ไป L-2,3- [H] citrulline ตามวิธีการอธิบายโดย Colasanti et al. [15 ] 2.6 วิธีการ DAF-2DA การผลิตไม่ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ระบบการตรวจสอบ DAF-2DA ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [13] สั้น ๆ , 10-UM 4,5 diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA. อเล็กซิสคอร์ป, San Diego, CA, USA) ถูกบันทึกอยู่ในเซลล์เพาะเลี้ยงในสื่อฟรีเซรั่มและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที หลังจากซักกับพีบีเอสบวก 1.2 มิลลิแคลเซียมคลอไรด์เซลล์ได้รับการแก้ไขด้วย 3% w / v paraformaldehyde บวก 4% w / v ซูโครสและเรืองแสงได้รับโทรศัพท์มือถือถ่ายภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ confocal เลเซอร์สแกน (Axioplan 2 LSM 510, Carl Zeiss, Gottingen, เยอรมนี) พร้อมกับอาร์กอน (488 นาโนเมตร) คานกระตุ้น ความเข้มของเลเซอร์ชัตเตอร์รูรับแสงและการสัมผัส / การตั้งค่าที่ถูกเก็บไว้บูรณาการอย่างต่อเนื่องเพื่อช่วยให้การเปรียบเทียบ quantiative ของความเข้มแสงสัมพัทธ์ของเซลล์ระหว่างกลุ่มที่ได้รับการรักษา ภาพที่ได้มาแบบดิจิทัลและประมวลผลสำหรับการกำหนดเรืองแสงในระดับเซลล์เดียวโดยใช้โดเมนสาธารณะ NIH ภาพที่ 1.61 โปรแกรม (พัฒนาที่สหรัฐสถาบันสุขภาพแห่งชาติและมีอยู่บนอินเทอร์เน็ตที่ 2.7 Electrophoretic เคลื่อนไหวทดสอบการเปลี่ยนแปลงสารสกัดจากนิวเคลียร์ของเซลล์ C6 ได้จัดทำ ตามออสบอร์ et al. [16] และการวิเคราะห์ EMSA ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น [17]. 2.8 เตรียมอาร์เอ็นเอและภาคเหนือวิเคราะห์ blot รวมอาร์เอ็นเอของเซลล์ที่แยกได้โดยใช้น้ำยา Trizol (Invitrogen ชีวิตเทคโนโลยีคอร์ป, คาร์ลส, แคลิฟอร์เนีย). ตัวอย่าง 40 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกจากกันโดย electrophoresis บน 1% agarose เจล denaturing ใน MOPS buffer แล้วเปื้อนบนเมมเบรน Hybond N (Amersham ชีววิทยาศาสตร์เล็ก Chalfont เหมือนเดิมสหราชอาณาจักร). เพื่อที่จะควบคุมปริมาณของอาร์เอ็นเอในแต่ละช่องทาง เจลที่ถูกย้อมด้วย ethidium bromide ก่อนและหลังการ blotting RNA ของไฮบริดที่มีดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงสำหรับหนู iNOS [15] ที่มีข้อความก่อนหน้านี้โดยวิธีการของดีเอ็นเอ DECAprime ครั้งที่สองติดฉลาก Kit (1.0-2.0 × 109 CPM / ไมโครกรัม. Ambion, ออสติน, TX, USA) ความเข้มของการผสมข้ามพันธุ์ได้รับการมองเห็นโดย autoradiography และการแสดงออกของ mRNA ถูกวัดโดยใช้โดเมนสาธารณะ NIH ภาพที่ 1.61 โปรแกรม (พัฒนาที่สหรัฐสถาบันสุขภาพแห่งชาติและให้บริการตามที่ Intet

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.The times you meter kaleidoscope.