3. Results3.1. PCR amplification of

3. Results
3.1. PCR amplification of the egg white allergen cDNA
The mRNA isolated from chicken oviduct were used to PCR
amplify egg white allergens Gal d 1, 2 and 4 using one-step PCR
method. For Gal d 3, a long-range PCR, that utilises the traditional
two-step method, was used. The PCR gel results showed a band for
Gal d 1 at 800 bp (expected 630 bp), Gal d 2 between 800–2000 bp
(expected 1158 bp), Gal d 3 at 2000 bp (expected 2115) and Gal d
4 at above 400 bp (expected 441) (Fig. 1). The long-range PCR conducted
for Gal d 3 produced a brighter band when used without
Q-solution (Fig. 1).
3.2. Cloning and expression of recombinant egg white allergens
The amplified PCR products were then digested by restriction
enzymes and ligated into pTrcHisA vector that adds a 6xHis
tag to the expressed proteins. The vector-insert constructs were
transformed into Express I
q chemically competent E. coli cells and
expression induced with IPTG. Expression was conducted for 6 h
and samples were collected every 1-h to determine the optimum
expression time for each allergen. The collected samples were pelleted,
lysed and the soluble and insoluble fractions were run on
SDS gels for analysis. These gels were then western blotted, incubated
with detection antibody and visualised with a chromogenic
substrate. For Gal d 1 and 2, the western blot analysis showed
that the proteins are found in both soluble and insoluble fractions
with an optimum expression time of 2 h. Gal d 2 shows increase
in expression every hour, at the same time showing an increase
of breakdown of the protein. Gal d 3 and 4 showed expression
only in the insoluble fraction, with an optimum expression time
of 2 h. Gal d 3 showed breaking down of the protein throughout the
expression period, while Gal d 4 showed a decrease in the amount
of protein after 2 h and increasing again in 5–6 h (Fig. 2).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์3.1. ปลักของ cDNA สารก่อภูมิแพ้ไข่ขาวMRNA ที่แยกได้จากไก่ oviduct ใช้ PCRขยายสารก่อภูมิแพ้ไข่ขาว Gal d 1, 2 และ 4 โดยใช้ PCR ขั้นตอนเดียววิธีการ สำหรับ Gal d 3, PCR แบบระยะไกล ที่ประโยชน์ที่ดั้งเดิมใช้วิธีการสองขั้นตอน ผลเจ PCR การแสดงวงดนตรีสำหรับGal d 1 ใน 800 bp (คาดว่า 630 bp), Gal d 2 ระหว่าง 800-2000 bp(คาดว่า 1158 bp), Gal d 3 2000 bp (คาดการณ์ 2115) และ Gal d4 ที่เหนือ 400 bp (คาด 441) (รูปที่ 1) การ PCR ระยะดำเนินการสำหรับ Gal d 3 ผลิตวงสว่างเมื่อไม่ใช้โซลูชัน Q (1 รูป)3.2. การโคลน และการแสดงของ recombinant ไข่ขาวสารก่อภูมิแพ้ผลิตภัณฑ์ PCR ขยายแล้วถูกย่อย โดยจำกัดเอนไซม์ และควบเป็นเวกเตอร์ pTrcHisA ที่เพิ่ม 6xHisแท็กจะแสดงโปรตีน สร้างเวกเตอร์แทรกได้กลายเป็น Express ผมq อำนาจทางเคมีไลเซลล์ และนิพจน์ที่เกิด ด้วย IPTG ดำเนินการนิพจน์สำหรับ 6 hและตัวอย่างถูกเก็บมาทุก 1 ชม.เพื่อตรวจสอบที่เหมาะสมเวลานิพจน์สำหรับแต่ละสารก่อภูมิแพ้ ตัวอย่างที่รวบรวมได้สัตว์lysed และส่วนละลาย และไม่ละลายน้ำถูกเรียกใช้บนSDS เจลสำหรับการวิเคราะห์ เจเหล่านี้ได้แล้วตะวันตก blotted ได้รับการกกด้วยการตรวจหาแอนติบอดี และ visualised ด้วยที่ chromogenicพื้นผิว สำหรับ Gal d 1 และ 2 การวิเคราะห์รอยเปื้อนที่ตะวันตกได้แสดงว่า โปรตีนที่พบในส่วนละลายน้ำ และไม่ละลายน้ำด้วยเวลาการแสดงออกที่เหมาะสม 2 h. Gal d 2 แสดงเพิ่มขึ้นในนิพจน์ที่ทุกชั่วโมง ในเวลาเดียวกันแสดงการเพิ่มขึ้นของการสลายของโปรตีน Gal d 3 และ 4 แสดงนิพจน์ในสัดส่วนไม่ละลายน้ำ เวลาการแสดงออกที่เหมาะสมเท่านั้นของ 2 h. Gal d 3 พบแบ่งโปรตีนตลอดการแสดงรอบระยะเวลา ขณะ Gal d 4 แสดงการลดลงของจำนวนโปรตีนหลังจาก 2 ชม.และเพิ่มขึ้นอีกใน 5-6 ชม. (2 รูป)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการทดลอง
3.1 ขยาย PCR ของสารก่อภูมิแพ้ไข่สีขาว cDNA
mRNA ที่แยกได้จากท่อนำไข่ไก่ถูกนำมาใช้ PCR
ขยายไข่สีขาวสารก่อภูมิแพ้ Gal D 1, 2 และ 4 โดยใช้ขั้นตอนเดียว-PCR
วิธี สำหรับสาว D 3 เป็นระยะยาววิธี PCR ที่ใช้แบบดั้งเดิม
วิธีการขั้นตอนสองถูกนำมาใช้ ผลการเจล PCR พบว่ามีวง
สาว D 1 ที่ 800 BP (คาดว่า 630 bp) Gal D 2 ระหว่าง 800-2000 BP
(คาดว่า BP 1158) สาว D 3 2000 BP (คาด 2115) และ Gal D
4 ในข้างต้น 400 BP (คาดว่า 441) (รูปที่ 1). ยาวช่วง PCR ดำเนินการ
สำหรับสาว D 3 ผลิตเป็นวงดนตรีที่สดใสเมื่อนำมาใช้โดยไม่ต้อง
Q-วิธีการแก้ปัญหา (รูปที่ 1)..
3.2 การโคลนและการแสดงออกของไข่ขาว recombinant สารก่อภูมิแพ้
ผลิตภัณฑ์ PCR ขยายถูกย่อยแล้วโดยข้อ จำกัด
เอนไซม์และผูกเข้า pTrcHisA เวกเตอร์ที่เพิ่ม 6xHis
แท็กกับโปรตีนแสดง โครงสร้างแบบเวกเตอร์แทรกถูก
เปลี่ยนเป็นเอ็กซ์เพรสฉัน
Q อำนาจทางเคมี E. coli เซลล์และ
การแสดงออกของการเหนี่ยวนำด้วย IPTG แสดงออกได้ดำเนินการ 6 ชั่วโมง
และเก็บตัวอย่างทุก 1 ชั่วโมงเพื่อตรวจสอบที่ดีที่สุด
เวลาการแสดงออกของแต่ละสารก่อภูมิแพ้ กลุ่มตัวอย่างที่เก็บรวบรวมได้รับเม็ด,
lysed และเศษส่วนที่ละลายน้ำและไม่ละลายน้ำวิ่งบน
เจล SDS สำหรับการวิเคราะห์ เจลเหล่านี้แล้วตะวันตกเปื้อนบ่ม
มีการตรวจสอบและการมองเห็นแอนติบอดีที่มีการแยก
สารตั้งต้น สำหรับสาว D 1 และ 2 การวิเคราะห์ดวงตะวันแสดงให้เห็น
ว่าโปรตีนที่พบทั้งในเศษส่วนที่ละลายน้ำและไม่ละลายน้ำ
ที่มีเวลาการแสดงออกที่เหมาะสมของ 2 ชั่วโมง Gal D 2 แสดงให้เห็นเพิ่มขึ้น
ในการแสดงออกของทุกชั่วโมงในเวลาเดียวกันแสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้น
ของการสลายของโปรตีน Gal D 3 และ 4 แสดงให้เห็นว่าการแสดงออก
เฉพาะในส่วนที่ไม่ละลายน้ำที่มีเวลาการแสดงออกที่ดีที่สุด
ของ 2 ชั่วโมง Gal D 3 แสดงให้เห็นว่าหมดสภาพของโปรตีนตลอด
ระยะเวลาการแสดงออกในขณะที่สาว D 4 แสดงให้เห็นว่าการลดลงของจำนวนเงินที่
ของโปรตีนหลังจาก 2 ชั่วโมงและเพิ่มขึ้นอีกครั้งใน 5-6 ชั่วโมง (รูปที่. 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . ผลลัพธ์3.1 . เพื่อเพิ่มปริมาณสารก่อภูมิแพ้ cDNA ไข่ขาวmRNA ที่แยกได้จากไก่เพื่อใช้ตรวจท่อนำไข่ขยายไข่ขาว allergens สาว D 1 , 2 และ 4 Real-Time PCR โดยใช้วิธี สำหรับสาว D 3 , PCR ระยะไกล ที่ใช้แบบดั้งเดิมวิธีที่ 2 ใช้ ผลเจล PCR พบวงดนตรีสำหรับสาว D 1 ใน 800 คู่เบส ( คาดว่าหุ้น BP ) , สาว D 2 ระหว่าง 800 – 2000 BP( คาดว่าอย่าง BP ) , สาว D 3 ที่ 2000 BP ( คาดว่า 1489 ) และสาวดี4 ที่เหนือ 400 BP ( คาดว่า 441 ) ( รูปที่ 1 ) ระยะยาวเพื่อดำเนินการสำหรับสาว D 3 ผลิต วง ยิ่งเมื่อใช้ โดยไม่มีq-solution ( รูปที่ 1 )3.2 . การโคลนและการแสดงออกของโปรตีนไข่สีขาว สารก่อภูมิแพ้การขยาย PCR แล้วย่อยจำกัดผลิตภัณฑ์เอนไซม์และผูกเป็น ptrchisa เวกเตอร์ที่เพิ่ม 6xhisแท็กที่จะแสดงโปรตีน เวกเตอร์แทรกโครงสร้างคือเปลี่ยนเป็นบริการฉันถามทางเซลล์ E . coli และเชี่ยวชาญการแสดงออกกระตุ้นด้วยโปรตีน . การแสดงออกเป็น 6 Hและ ทำการเก็บตัวอย่างทุก 1-h เพื่อตรวจสอบที่เหมาะสมแสดงเวลาสำหรับแต่ละสารก่อภูมิแพ้ . จำนวนเม็ดที่รวบรวม ,lysed และละลายน้ำได้และใช้เศษส่วนเจลเฉพาะสำหรับการวิเคราะห์ เจลเหล่านี้แล้วตะวันตกเปื้อนบ่มกับการมองเห็นด้วยการสนทนาผ่านข้อความโต้ตอบแบบทันทีและแอนติบอดีพื้นผิว สำหรับสาว D 1 และ 2 การวิเคราะห์ Western blot แสดงโปรตีนที่พบในส่วนที่ไม่ละลายน้ำ และทั้งกับการแสดงออกที่เหมาะสมของเวลา 2 ชั่วโมง สาว D 2 แสดงเพิ่มในการแสดงออกทุกชั่วโมง ในเวลาเดียวกันแสดงเพิ่มการสลายของโปรตีน สาว D 3 และ 4 แสดงสีหน้าเฉพาะในส่วนที่ไม่ละลายน้ำ มีการแสดงออกที่เหมาะสมเวลา2 . สาว D 3 แสดงการแบ่งของโปรตีนตลอดระยะเวลาการแสดง ในขณะที่สาว D 4 พบว่าลดลงในจํานวนของโปรตีนหลังจาก 2 ชั่วโมง และเพิ่มอีก 5 – 6 H ( รูปที่ 2 )