RNA was isolated using the Tri-Pure

RNA was isolated using the Tri-Pure RNA extraction kit (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) following the manufacturer’s
instructions. Ten micrograms of total RNA were loaded on each
lane of a 1.5% formaldehyde-agarose gel, electrophoresed, and transferred
to a nylon membrane by capillary suction method (Hybond-N
,
Amersham Pharmacia Biotech, Indianapolis, IN). The membranes were
hybridized by the following probes: 349-bp BamHI-digested fragment of
rat insulin cDNA clone present in pGEM-T vector (gift from Dr.
Toshiyuki Takeuchi, Maebashi, Japan), 450-bp EcoRI-HindIII fragment
of zebrafish insulin cDNA clone present in pBluescript vector (gift from
Dr. Stephen J. Duguay, Chicago, IL), and 1.3-kb BamHI-NotI fragment of
rat flotillin cDNA clone present in pZero-2 vector (gift from Dr. Perry
Bickel, St. Louis, MO). Prehybridization was allowed for 2 h in the buffer
containing 6 standard saline citrate with 50% formamide, 1 Denhardt’s
solution, and 0.5% sodium dodecyl sulfate at 42 C. Hybridization
was carried out under the same conditions with [-
32P]dATP-labeled rat
and zebrafish insulin cDNA fragments for 18 h. The membrane was
washed for 90 min at 65 C in 2 standard saline citrate containing 0.1%
sodium dodecyl sulfate with subsequent three changes of buffer. The
hybridized membrane was exposed to Kodak x-ray film (Eastman
Kodak Co., Rochester, NY) and kept at –80 C for 3 d. RNA molecular
size markers (0.28–6.5 kb) used were purchased from Promega Corp.
(Madison, WI). The digestion of DNA, agarose gel electrophoresis, random
labeling of DNA, and Northern hybridization were performed as
described by Sambrook et al. (

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

RNA ถูกแยกโดยใช้ชุดสกัด RNA Tri-เพียว (โรชโมเลกุลชีวเคมี มานไฮม์ เยอรมนี) ต่อผู้ผลิตคำแนะนำ สิบไมโครกรัมของ RNA ทั้งหมดถูกโหลดในแต่ละเลนเป็น 1.5% agarose ฟอร์มาลดีไฮด์เจล electrophoresed และโอนย้ายการเยื่อไนลอนโดยฝอยการดูด (Hybond NAmersham ฟาร์ไบโอเทค อินเดียนาโพลิส IN) ถูกเยื่อไฮบริด โดยวัดต่อไปนี้: 349-bp BamHI ย่อยสลายส่วนของหนูโคลน cDNA อินซูลินอยู่ในเวกเตอร์ pGEM T (ของขวัญจาก DrFragment 450-bp EcoRI-HindIII Toshiyuki สแมน มะเอะบะชิ ญี่ปุ่น),ของปลาม้าลายอินซูลิน cDNA โคลนอยู่ในเวกเตอร์ pBluescript (ของขวัญจากดร.สตีเฟน J. Duguay, Chicago, IL), และส่วน BamHI NotI 1.3 kb ของหนู flotillin cDNA โคลนอยู่ในเวกเตอร์ pZero-2 (ของที่ระลึกจากดร.เพอร์รี่Bickel เซนต์หลุยส์ MO) Prehybridization ได้รับการอนุญาตสำหรับ h 2 ในบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 6 มาตรฐานเกลือซิเตรต ด้วย 50% formamide, 1 Denhardt ของแก้ปัญหา และ 0.5% โซเดียมซัลเฟต dodecyl ที่ 42 C. Hybridizationดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับ [-หนูชื่อ dATP P 32]และบางส่วนของปลาม้าลายอินซูลิน cDNA สำหรับ 18 h มีเมมเบรนล้างสำหรับ 90 นาทีที่ 65 C ใน 2 มาตรฐานเกลือซิเตรทประกอบด้วย 0.1%โซเดียมซัลเฟต dodecyl กับแปลงที่สามตามมาของบัฟเฟอร์ การเป็นลูกผสมเยื่อษทมัคฟิล์มเอ็กซเรย์ Kodak (อีสท์บริษัทโกดัก โรเชสเตอร์ นิวยอร์ก) และเก็บไว้ที่ –80 C สำหรับ 3 d. RNA โมเลกุลขนาดเครื่องหมาย (0.28 – 6.5 kb) ใช้ซื้อจาก Promega corp(เมดิสัน WI) การย่อยอาหารของดีเอ็นเอ agarose เจลอิ สุ่มติดฉลากดีเอ็นเอ และ hybridization ภาคเหนือดำเนินการเป็นอธิบายโดย Sambrook et al. (

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

อาร์เอ็นเอที่แยกได้โดยใช้ชุด Tri-บริสุทธิ์สกัดอาร์เอ็นเอ (Roche
โมเลกุลชีวเคมี, Mannheim, เยอรมนี) ดังต่อไปนี้ผู้ผลิต
คำแนะนำ สิบไมโครกรัม RNA ทั้งหมดถูกโหลดในแต่ละ
ช่องทางของเจลดีไฮด์-agarose 1.5% electrophoresed และโอน
ไปยังเมมเบรนไนลอนโดยวิธีการดูดเส้นเลือดฝอย (Hybond-N ?,
Amersham Pharmacia ไบโอเทค, อินเดียแนโพลิ) เยื่อถูก
ไฮบริดโดยยานสำรวจต่อไปนี้: 349-BP ชิ้นส่วน BamHI ย่อยของ
หนูอินซูลิน cDNA โคลนอยู่ใน pGEM-T เวกเตอร์ (ของที่ระลึกจากดร.
โทชิยูกิทาเคอุจิเมบาชิ, ญี่ปุ่น) 450-BP-EcoRI HindIII ชิ้นส่วน
ของอินซูลิน zebrafish cDNA โคลนอยู่ใน pBluescript เวกเตอร์ (ของขวัญจาก
ชิ้นส่วนดร. สตีเฟ่นเจ Duguay, Chicago, IL) และ 1.3 KB BamHI-Noti ของ
หนู flotillin cDNA โคลนอยู่ใน PZero-2 เวกเตอร์ (ของที่ระลึกจากดร. เพอร์
บิซเคลเซนต์ Louis, มิสซูรี) Prehybridization ได้รับอนุญาตเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในบัฟเฟอร์
ที่มี 6 citrate มาตรฐานน้ำเกลือ 50% formamide 1 Denhardt ของ
การแก้ปัญหาและ 0.5% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตที่ 42 องศาเซลเซียสการผสมพันธุ์
ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับ [? -
32P] dATP ติดฉลาก หนู
และยีนอินซูลิน zebrafish เศษสำหรับ 18 ชั่วโมง เมมเบรนได้รับการ
ล้าง 90 นาทีที่ 65 ซีในน้ำเกลือ 2 ซิเตรตที่มีมาตรฐาน 0.1%
โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตที่มีตามมาสามการเปลี่ยนแปลงของบัฟเฟอร์
เมมเบรนไฮบริดได้สัมผัสกับ Kodak ฟิล์มเอ็กซ์เรย์ (อีสต์แมน
โกดัก จำกัด โรเชสเตอร์, นิวยอร์ก) และเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 D RNA โมเลกุล
เครื่องหมายขนาด (0.28-6.5 KB) ที่ใช้ซื้อมาจาก Promega คอร์ป
(Madison, WI) การย่อยของดีเอ็นเอ electrophoresis agarose เจล, สุ่ม
การติดฉลากของดีเอ็นเอและการผสมพันธุ์ภาคเหนือได้รับการดำเนินการตามที่
อธิบายโดย Sambrook et al, (

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อาร์เอ็นเอแยกโดยใช้ไตรบริสุทธิ์สกัด RNA ชุด ( โรชโมเลกุลอัลลิซิน Mannheim , เยอรมนี ) ต่อไปนี้ของผู้ผลิตคําแนะนํา 10 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกโหลดในแต่ละเลนของ 1.5% ฟอร์มาลดีไฮด์เจล electrophoresed และโอน ,เป็นไนล่อนเยื่อโดยวิธี ( hybond-n capillary suction ,ที่มุ่งมั่นของเรา Indianapolis ใน ) เมมเบรนคือดีเอ็นเอโพรบโดยต่อไปนี้ : 349 BP BamHI ย่อยส่วนของหนูอินซูลิน cDNA โคลนอยู่ในเวกเตอร์ pgem-t ( ของขวัญจากดร.โทชิยูกิ ทาเคอุจิ ลีเบรอ , ญี่ปุ่น ) , 450 bp EcoRI fragment -การโคลนยีนอินซูลินปัจจุบันปลาม้าลายในเวกเตอร์ ) ( ของขวัญจากดร. สตีเฟน เจ ดูไกว , ชิคาโก , อิลลินอยส์ ) และ 1.3-kb จำเพาะ BamHI เก็บไว้ตรงไหนก็ได้ของหนู flotillin cDNA โคลนอยู่ในเวกเตอร์ pzero-2 ( ของขวัญจากดร. เพอร์รี่บิกเกิล , St . Louis , MO ) prehybridization ได้รับอนุญาตเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 6 มาตรฐานเกลือซิเตรตกับ 50% Formamide 1 denhardt คือโซลูชั่นและ 0.5 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตที่ 42 องศา Cได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับ [ -32p ] datp ติดป้ายว่าหนูปลาม้าลายและชิ้นส่วนสำหรับอินซูลินยีน 18 ชั่วโมงเมมเบรนล้าง 90 นาทีที่ 65 C 2 มาตรฐานเกลือซิเทรตที่ประกอบด้วย 0.1%โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตที่ตามมาสามการเปลี่ยนแปลงของบัฟเฟอร์ ที่3 แผ่นถูกฟิล์มเอกซเรย์ ( Eastman Kodakโกดัก บริษัท โรเชสเตอร์ นิวยอร์ก ) และเก็บไว้ที่ - 80 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 วัน อาร์เอ็นเอโมเลกุลเครื่องหมาย ( 0.28 ) ขนาด 6.5 กิโลไบต์ ) ที่ใช้ซื้อมาจาก promega คอร์ป( Madison , WI ) การย่อย DNA , เจลอิเลคโตรโฟรีซีสแบบสุ่มการติดฉลากดีเอ็นเอลูกผสม มีการปฏิบัติ และภาคเหนืออธิบายโดย sambrook et al . (