Total RNA was extracted using TRI-r

Total RNA was extracted using TRI-reagent (Sigma-Aldrich, USA). After that, total RNA was treated by DNase 1 (Sigma-Aldrich, USA) and used for further analysis. For pri-miRNA, study cDNA was prepared using gene-specific primer and Thermoscript reverse transcriptase (Invitrogen, USA) according to Schmittgen et al. [51]. For protein-coding genes analysis, cDNA was prepared, using random primer and MMLV reverse transcriptase (Evrogen, Russia) according to manufacturer's recommendations. Experiment was performed on ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA). Detection of amplification products was carried out using SYBR Green 1 with the presence of ROX reference dye (Evrogen, Russia) in accordance with the manufacturer's protocol. Specificity of amplified products was verified by sequencing as well as melting curve analysis. Quantification was normalized to ubiquitously expressed 2S and snoR442 genes (for pri-miRNAs) and to rp49 and αTub (for protein-coding genes). Calculation of relative expression levels was done, using the equation 2−ddCt. The resulting value of the expression for each sample was determined basing on three biological replicates. Sequences of used primers are shown in electronic supplementary material, table S1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกใช้ TRI-เอเจนต์ (Sigma Aldrich สหรัฐอเมริกา) หลังจากนั้น RNA รวมรักษา โดย DNase 1 (Sigma Aldrich สหรัฐอเมริกา) และใช้สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม สำหรับเที่ยว pri ศึกษา cDNA ถูกเตรียมโดยใช้ไพรเมอร์ของยีนเฉพาะและ Thermoscript ปเทส (Invitrogen, USA) ตาม Schmittgen et al. [51] สำหรับการวิเคราะห์ยีนที่เข้ารหัสโปรตีน cDNA จัดเตรียม ใช้รองพื้นแบบสุ่มและ MMLV ปเทส (Evrogen รัสเซีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทดลองดำเนินการในระบบตรวจสอบลำดับ ABI PRISM 7500 (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ สหรัฐอเมริกา) การตรวจจับผลิตภัณฑ์ขยายดำเนินการใช้ SYBR Green 1 มี ROX เรทย้อม (Evrogen รัสเซีย) ตามโพรโทคอลผู้ผลิต รับการตรวจความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ขยาย โดยการจัดลำดับ เป็นโค้งวิเคราะห์จุดหลอมเหลว นับได้ตามปกติ เพื่อแสดง ubiquitously 2S และยีน snoR442 (สำหรับ pri-miRNAs) และ rp49 และ αTub (สำหรับเข้ารหัสโปรตีนยีน) การคำนวณนิพจน์ญาติระดับทำ ใช้ 2−ddCt สมการ กำหนดค่าผลลัพธ์ของนิพจน์อย่างบนสามชีวภาพ replicates ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้จะแสดงอยู่ในเอกสารอิเล็กทรอนิกส์เสริม ตาราง S1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้น้ำยา TRI-(Sigma-Aldrich, สหรัฐอเมริกา) หลังจากนั้นอาร์เอ็นเอทั้งหมดได้รับการรักษาโดย DNase 1 (Sigma-Aldrich, สหรัฐอเมริกา) และใช้สำหรับการวิเคราะห์ต่อไป สำหรับ PRI-miRNA, ยีนศึกษาได้จัดทำขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจงและ Thermoscript reverse transcriptase (Invitrogen, สหรัฐอเมริกา) ตาม Schmittgen et al, [51] สำหรับโปรตีนเข้ารหัสการวิเคราะห์ยีนยีนถูกจัดทำขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์แบบสุ่มและ MMLV transcriptase ย้อนกลับ (Evrogen, รัสเซีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทดลองดำเนินการใน ABI PRISM ระบบตรวจจับลำดับ 7500 (Applied Biosystems, สหรัฐอเมริกา) การตรวจหาผลิตภัณฑ์ขยายได้ดำเนินการโดยใช้สีเขียว SYBR 1 กับการปรากฏตัวของสีย้อม ROX อ้างอิง (Evrogen, รัสเซีย) สอดคล้องกับโพรโทคอของผู้ผลิต ความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการขยายการตรวจสอบโดยลำดับเช่นเดียวกับการวิเคราะห์โค้งละลาย ปริมาณถูกนัย ubiquitously แสดง 2S และยีน snoR442 (สำหรับ PRI-miRNAs) และ rp49 และαTub (ยีนโปรตีนเข้ารหัส) การคำนวณระดับการแสดงออกของญาติที่ได้กระทำโดยใช้สมการ 2 ddCt ค่าที่เป็นผลลัพธ์ของการแสดงออกของแต่ละตัวอย่างถูกกำหนดเบสสามซ้ำทางชีวภาพ ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้เป็นที่แสดงในวัสดุเสริมอิเล็กทรอนิกส์ตาราง S1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ไตรรีเอเจนต์ ( ซิกม่า Aldrich , USA ) หลังจากนั้น อาร์เอ็นเอทั้งหมดได้รับการรักษาโดยตรวจหา ADNase 1 ( ซิกม่า Aldrich , USA ) และใช้ในการวิเคราะห์ต่อไป เพื่อการสร้าง mirna cDNA ศึกษา , เตรียมใช้ยีนที่เฉพาะเจาะจงและรองพื้น thermoscript reverse transcriptase ( Invitrogen , USA ) ตาม schmittgen et al . [ 51 ] การวิเคราะห์ยีนการเข้ารหัสโปรตีน ดีเอ็นเอถูกเตรียมโดยใช้ primer แบบสุ่มและ mmlv reverse transcriptase ( evrogen รัสเซีย ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทดสอบบน ABI ปริซึม 7500 ลำดับระบบตรวจจับ ( Applied Biosystems สหรัฐอเมริกา ) การตรวจสอบของผลิตภัณฑ์ที่ขยายได้โดยใช้ SYBR กรีน 1 สีอ้างอิงกับการปรากฏตัวของ Rox ( evrogen รัสเซีย ) ตามขั้นตอนของผู้ผลิต เพิ่มความจำเพาะของผลิตภัณฑ์ถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยลำดับเช่นเดียวกับจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้ง คือปกติจะแสดงปริมาณระหว่าง 2s และ snor442 ยีน ( PRI mirnas ) และ rp49 αอ่าง ( สำหรับการเข้ารหัสยีนและโปรตีน ) การคำนวณระดับการแสดงออกญาติเสร็จ โดยใช้สมการ ddct 2 − . ส่งผลให้มูลค่าของการแสดงออกสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกกำหนดโดยสามแบบชีวภาพ ลําดับการใช้ไพรเมอร์จะเป็นวัสดุเสริม อิเล็กทรอนิกส์ ตาราง S1 .