Researchers studying microbiomes ca

Researchers studying microbiomes can do their best to prevent contamination, but a new study reveals widespread, low-level contamination in DNA extraction kits. Reporting in BMC Biology today (November 11), Alan Walker of the University of Aberdeen in the U.K. and colleagues list dozens of contaminating taxa that can swamp out a sample’s true microbial signal, if starting concentrations are low.

“It’s really important to sequence a negative extraction control,” said Patrick Schloss, a microbiome researcher at the University of Michigan who did not participate in this study. “That’s something people should be doing and are not doing.”

Contamination or signal?

The presence of microbial DNA in laboratory reagents is nothing new. Studies have even found bacterial DNA in ultrapure water, and just a few weeks ago researchers pointed out ubiquitous contamination in next generation sequencing runs. In many cases such extraneous DNA may not be an issue, but for highly sensitive deep sequencing of amplified samples, contaminants can start to compete with signal, as Walker’s team found.

Walker’s group made serial dilutions of Salmonella bongori, beginning with 100 million cells and reducing the sample down to 1,000 cells. When the sample of S. bongori was 10,000 cells or fewer, the abundance of DNA from other microbial taxa exceeded 50 percent of the sequences. This happened using four different commercial extraction kits. Bradyrhizobiaceae, Burkholderiaceae, Pseudomonadaceae, and dozens of other bacterial groups were present, although each kit had a different profile.

“The assumption has been they are sterile,” said Walker, adding that, to be fair, DNA extraction kits aren’t marketed as such. “What [researchers] need to do is go back and do some negative controls and with a bit of confidence say, ‘they really are in the samples,’ in cases where maybe there are potentially suspicious results,” he said. Schloss made the point that investigators should not rely on the list Walker’s team produced as a comprehensive catalog of potential contaminants, but be sure to do their own controls given that contamination can vary from batch to batch.

Safeguarding samples

Walker’s paper pointed to a couple of studies in which human diseases have been linked with unexpected microbes. In one, for example, Delphine Lee of the John Wayne Cancer Institute in Santa Monica, California, and colleagues found different microbial profiles in breast tissue from cancer patients and normal controls, namely, different abundances of Methylobacterium radiotolerans and Sphingomonas yanoikuyae. Although Methylobacteriaceae and Shingomonadaceae popped up in some of the DNA extraction kits Walker’s group tested, Lee said that she and her team are very aware of contamination concerns—especially given that her work involves low biomass samples—and that they performed the right controls.

“With low biomass the tiniest little change can be detected,” Lee told The Scientist. In contrast, a fecal sample would have many more microbial cells. “You could sneeze all over it, you’re not going to affect the findings.”

Another study, by Matthew Meyerson of Harvard Medical School and colleagues, identified a novel bacterial species, Bradyrhizobium enterica, in patients with a colitis syndrome. Bradyrhizobium were also detected in Walker’s study, although Meyerson said his team did not detect any DNA from the organism in the reagents used. Additionally, his group performed in situ hybridization on the samples, from which they could see a signal from B. enterica in tissue from patients with colitis but not in controls. Meyerson said contamination is always a possibility, and performing additional cellular assays adds a very strong layer of confidence in the sequencing results.
Schloss has experienced his own problems with reagent contamination. In a study on cystic fibrosis, his team found Pseudomonas DNA present in a commercial kit. Such contamination is particularly problematic given that these bacteria are an important pathogen in the lung, especially among people with cystic fibrosis. “We need to be thoughtful in how we design our experiments [and determine] what types of controls are critical.”

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

นักวิจัยศึกษา microbiomes ทำดีที่สุดเพื่อป้องกันการปนเปื้อน แต่การศึกษาใหม่พบปนเปื้อนแพร่หลาย ระดับต่ำในชุดสกัดดีเอ็นเอ รายงานในวิชาชีววิทยา BMC วันนี้ (11 พฤศจิกายน), Alan Walker ของมหาวิทยาลัยอเบอร์ดีนสหราชอาณาจักรและร่วมรายการของขยะ taxa ที่บึงสามารถออกตัวอย่างเป็นจริงจุลินทรีย์สัญญาณ ถ้าความเข้มข้นเริ่มต้นต่ำสุดที่"ก็จริง ๆ ต้องลำดับควบคุมแยกลบ กล่าวว่า Patrick ลอทท์ นักวิจัย microbiome ที่มหาวิทยาลัยมิชิแกนที่ไม่ได้มีส่วนร่วมในการศึกษานี้ "ที่เป็นสิ่งที่ควรทำ และไม่ได้ทำ"ปนเปื้อนหรือสัญญาณของดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ในห้องปฏิบัติการ reagents มีอะไรใหม่ การศึกษาได้พบดีเอ็นเอจากแบคทีเรียแม้กระทั่งน้ำ ultrapure และเพียงไม่กี่สัปดาห์ที่ผ่านมานักวิจัยชี้ให้เห็นการปนเปื้อนแพร่หลายในลำดับเบสทำรุ่นต่อไป ในหลายกรณี เช่นดีเอ็นเอที่ไม่เกี่ยวข้องไม่อาจมีปัญหา แต่สำหรับการจัดลำดับลึกมีความไวสูงอย่างเอาต์ สารปนเปื้อนสามารถเริ่มต้นการแข่งขันเป็นทีมของ Walker พบกับสัญญาณกลุ่มของวอล์คเกอร์ทำ dilutions ประจำของสาย bongori เริ่มต้นที่ 100 ล้านเซลล์ และลดตัวอย่างลงไป 1000 เซลล์ เมื่อตัวอย่างของ S. bongori 10000 เซลล์หรือน้อยกว่า ความอุดมสมบูรณ์ของดีเอ็นเอจาก taxa อื่น ๆ จุลินทรีย์เกิน 50 เปอร์เซ็นต์ของลำดับที่ เกิดขึ้นโดยใช้สี่แยกพาณิชย์ต่าง ๆ ชุด Bradyrhizobiaceae, Burkholderiaceae, Pseudomonadaceae และจำนวนมากของกลุ่มเชื้อแบคทีเรียอื่น ๆ ได้ปัจจุบัน ถึงแม้ว่าแต่ละชุดมีค่าแตกต่างกัน"อัสสัมชัญที่ได้รับจะผ่านการฆ่าเชื้อ กล่าวว่า วอล์คเกอร์ ว่า มีความเป็นธรรม ชุดสกัดดีเอ็นเอไม่ได้เด็ดขาดเช่นการเพิ่ม "อะไร [นักวิจัย] ต้องทำคือ กลับไป และบางลบควบคุมกับบิตของความเชื่อมั่นพูด 'จริง ๆ อยู่ในตัวอย่าง ในกรณีที่อาจมีผลอาจสงสัย, " เขากล่าวว่า จุดที่นักสืบไม่ได้ควรใช้ในรายของวอล์คเกอร์ทีมผลิตเป็นแค็ตตาล็อกที่ครอบคลุมของสารปนเปื้อนที่อาจเกิดขึ้น แต่ให้แน่ใจว่าการควบคุมตนเองที่ปนเปื้อนสามารถเปลี่ยนจากชุดชุดลอทท์ได้ตัวอย่างปกป้องWalker’s paper pointed to a couple of studies in which human diseases have been linked with unexpected microbes. In one, for example, Delphine Lee of the John Wayne Cancer Institute in Santa Monica, California, and colleagues found different microbial profiles in breast tissue from cancer patients and normal controls, namely, different abundances of Methylobacterium radiotolerans and Sphingomonas yanoikuyae. Although Methylobacteriaceae and Shingomonadaceae popped up in some of the DNA extraction kits Walker’s group tested, Lee said that she and her team are very aware of contamination concerns—especially given that her work involves low biomass samples—and that they performed the right controls.“With low biomass the tiniest little change can be detected,” Lee told The Scientist. In contrast, a fecal sample would have many more microbial cells. “You could sneeze all over it, you’re not going to affect the findings.”Another study, by Matthew Meyerson of Harvard Medical School and colleagues, identified a novel bacterial species, Bradyrhizobium enterica, in patients with a colitis syndrome. Bradyrhizobium were also detected in Walker’s study, although Meyerson said his team did not detect any DNA from the organism in the reagents used. Additionally, his group performed in situ hybridization on the samples, from which they could see a signal from B. enterica in tissue from patients with colitis but not in controls. Meyerson said contamination is always a possibility, and performing additional cellular assays adds a very strong layer of confidence in the sequencing results.Schloss has experienced his own problems with reagent contamination. In a study on cystic fibrosis, his team found Pseudomonas DNA present in a commercial kit. Such contamination is particularly problematic given that these bacteria are an important pathogen in the lung, especially among people with cystic fibrosis. “We need to be thoughtful in how we design our experiments [and determine] what types of controls are critical.”

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นักวิจัยศึกษา microbiomes สามารถทำของพวกเขาที่ดีที่สุดเพื่อป้องกันการปนเปื้อน แต่การศึกษาใหม่แสดงให้เห็นอย่างกว้างขวาง การปนเปื้อนน้อยในชุดสกัดดีเอ็นเอ รายงานในวันนี้ ( 11 พ.ย. ) BMC ชีววิทยา อลันวอล์คเกอร์ของมหาวิทยาลัยอเบอร์ดีนในสหราชอาณาจักรและเพื่อนร่วมงานนับสิบของรายการที่สามารถปนเปื้อนและหนองออกจากตัวอย่างจริงของสัญญาณ ถ้าเริ่มจากความเข้มข้นต่ำ

" มันสำคัญจริงๆที่จะลำดับการควบคุมการสกัดลบ " แพทริค ปราสาท , ไมโครไบโ นักวิจัยที่มหาวิทยาลัยมิชิแกนซึ่งไม่ได้มีส่วนร่วมในการศึกษา " นั่นเป็นสิ่งที่ควรทำ และไม่ทำ "

การปนเปื้อนหรือสัญญาณ

มีจุลินทรีย์ สารเคมีในห้องปฏิบัติการดีเอ็นเอในมีอะไรใหม่การศึกษายังพบแบคทีเรียในน้ำที่บริสุทธิ์มาก ดีเอ็นเอ และเพียงไม่กี่สัปดาห์ที่ผ่านมานักวิจัยชี้ให้เห็นข้อมูลที่ปนเปื้อนในรันลำดับรุ่นต่อไป ในบางกรณีการดีเอ็นเอหลายคนอาจไม่เป็นปัญหา แต่การลำดับลึกความไวสูงของอัตราตัวอย่างสารปนเปื้อนสามารถเริ่มต้นที่จะแข่งขันกับสัญญาณ เช่น วอล์กเกอร์ พบทีม

กลุ่มวอล์คเกอร์ทำให้อนุกรมเจือจางเชื้อ bongori เริ่มต้นด้วยเงิน 100 ล้านเซลล์ และลดจำนวนลงถึง 1 , 000 เซลล์ เมื่อตัวอย่างของ S . bongori คือ 10 , 000 เซลล์หรือน้อยกว่า ความอุดมสมบูรณ์ของดีเอ็นเอจากจุลินทรีย์และอื่น ๆ เกิน 50 เปอร์เซ็นต์ของผู้ นี้เกิดขึ้นโดยใช้สี่ชุดสกัดการค้าที่แตกต่างกัน bradyrhizobiaceae burkholderiaceae pseudomonadaceae , , ,และนับสิบของกลุ่มแบคทีเรียอื่น ๆที่เป็นปัจจุบัน แม้ว่าแต่ละชุดมีรายละเอียดแตกต่าง

" อัสสัมชัญ ได้รับพวกเขาจะเป็นหมัน " วอล์คเกอร์ , เพิ่ม , ยุติธรรม , ชุดสกัดดีเอ็นเอไม่ได้เด็ดขาด เช่น " อะไร [ นักวิจัย ] ต้องทำคือกลับไปทำการควบคุมบางเชิงลบและมีบิตของความเชื่อมั่นว่า พวกเขาอยู่ในตัวอย่างจริงๆในคดีที่อาจจะมีผลอาจสงสัย " เขากล่าว ไม่ทำจุดนั้นนักวิจัยไม่ควรพึ่งพาทีมงานรายการ วอร์คเกอร์ ผลิตรายการที่ครอบคลุมของสารปนเปื้อนที่อาจเกิดขึ้น แต่ให้แน่ใจว่าได้ทำการควบคุมของตัวเองที่ได้รับการปนเปื้อนจะแตกต่างจากชุดชุด



การตัวอย่างกระดาษวอล์กเกอร์ ชี้ไปยังคู่ของการศึกษาซึ่งในโรคของมนุษย์ที่ได้รับการเชื่อมโยงกับโรคที่ไม่คาดคิด หนึ่งในตัวอย่างเช่นเดลฟีน ลี ของ จอห์น เวย์น สถาบันมะเร็งใน Santa Monica , California และเพื่อนร่วมงานพบโปรไฟล์ของจุลินทรีย์ต่าง ๆในเนื้อเยื่อเต้านมจากผู้ป่วยโรคมะเร็งและการควบคุมแบบปกติ คือmethylobacterium abundances ต่าง radiotolerans รึเปล่า sphingomonas และ yanoikuyae . และแม้ว่า methylobacteriaceae shingomonadaceae ขึ้นมาในบางส่วนของการสกัดดีเอ็นเอชุดวอล์คเกอร์ของกลุ่มทดสอบ ลี กล่าวว่าเธอและทีมงานของเธอมีมากตระหนักถึงการปนเปื้อนของความกังวลโดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ได้รับงานของเธอเกี่ยวข้องกับตัวอย่างที่ใช้ชีวมวลต่ำและการควบคุมที่เหมาะสม .

" กับการเปลี่ยนแปลงเล็ก ๆน้อย ๆที่มีมวลชีวภาพน้อยที่สุดสามารถตรวจพบ " ลีบอกให้นักวิทยาศาสตร์ ในทางตรงกันข้ามตัวอย่างอุจจาระจะมีมากขึ้นจากเซลล์ " นายจะจามตลอดเลย คุณจะต้องไม่ส่งผลกระทบต่อผล "

ศึกษาอื่น โดยแมทธิวไมเออร์สันและเพื่อนร่วมงานของโรงเรียนแพทย์ฮาร์วาร์ดระบุนวนิยายแบคทีเรียชนิด enterica ถั่วเหลือง ,ในผู้ป่วยที่มีอาการซินโดรม ถั่วเหลืองยังตรวจพบในการศึกษาวอล์คเกอร์ , แม้ว่าไมเออร์สันกล่าวว่าทีมของเขาไม่ได้ตรวจพบดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตในสารเคมีที่ใช้ นอกจากนี้ กลุ่มของเขาแสดงใน situ hybridization กับตัวอย่างจากที่พวกเขาได้เห็นสัญญาณจาก B enterica ในเนื้อเยื่อจากผู้ป่วยที่มีอาการ แต่ไม่ได้อยู่ในการควบคุมไมเออร์สันกล่าวว่า การปนเปื้อนอยู่เสมอมีความเป็นไปได้ และการใช้โทรศัพท์มือถือเพิ่มเติม เพิ่มเลเยอร์ที่แข็งแกร่งมากของความเชื่อมั่นในการจัดลำดับผลลัพธ์ .
ชล มีประสบการณ์ปัญหาของเขาเอง ด้วยการเกิดปฏิกิริยา ในการศึกษาเกี่ยวกับโรคซิสติกไฟโบรซิส ทีมของเขาพบดีเอ็นเอของปัจจุบันในชุดพาณิชย์การปนเปื้อนดังกล่าว โดยเฉพาะปัญหาระบุว่าแบคทีเรียเหล่านี้เป็นเชื้อโรคที่สำคัญในปอด โดยเฉพาะในผู้ที่มี cystic fibrosis . " เราต้องรอบคอบในวิธีที่เราออกแบบ [ การทดลองของเราและตรวจสอบ ] ชนิดของการควบคุมเป็นสำคัญ "