Lysates prepared from RAW264.7 cell

Lysates prepared from RAW264.7 cells were treated as indicated
and extracted using the previously described buffers and
method (Palaga et al., 2008). The protein concentration was measured
using the BCATM protein assay kit (PIERCE, USA) according to
the manufacturer’s instruction. One hundred and fifty micrograms
of proteins from each condition were subjected to the removal
of lipid, nucleic acids, salts and other contaminants using a 2D
clean-up kit(Bio-Rad, USA). The cleared solutions were loaded onto
IPG strips, pH 4–7 (GE Healthcare Bio-Sciences, UK), and subjected
to 2D-GE using PROTEAN® IEF and PROTEIN® II xi Cell (Bio-Rad,
USA). After electrophoresis, the phosphoproteins in the gels were
stained using Pro-Q® Diamond phosphoprotein gel stain (Invitrogen,
UK) according to the manufacturer’s instructions. Fluorescent
signals were visualized using Phosphorimager Typhoon TrioTM (GE
Healthcare). After Pro-Q® Diamond staining, the gels were stained
with Coomassie blue R-250 (Bio-Rad, USA) for total protein detection
and visualized using an ImageScannerTM II (GE Healthcare).
The intensity of the phosphoproteins and total proteins in the
2D-GE gel were analyzed using an ImageMasterTM 2D Platinum
v7.0. The in-gel digestion procedure was performed as described
by Shevchenko et al. (2007), and the tryptic peptides were analyzed
using an HRESIMS nano-LC (EASY-nLCII, Bruker Daltonics,
Germany)-MS/MS (microTOF-QII, Bruker Daltonics, Germany). The
results from LC–MS/MS were subjected to a database search using
an online Mascot database, and the outputs of these results were
compared between conditions and cross-checked using the isoelectric
focusing point and molecular weight of the excised spots

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

lysates เตรียมจากเซลล์ RAW264.7
ได้รับการรักษาตามที่ระบุและสกัดโดยใช้บัฟเฟอร์ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้และวิธีการ
(Palaga et al., 2008) ความเข้มข้นของโปรตีนที่วัดโดยใช้การทดสอบโปรตีน BCATM ชุด (PIERCE สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หนึ่งร้อยห้าสิบไมโครกรัมของโปรตีนจากแต่ละเงื่อนไขถูกยัดเยียดให้การกำจัดไขมันกรดนิวคลีอิกและเกลือสารปนเปื้อนอื่นๆ โดยใช้ 2D ชุดทำความสะอาด (Bio-Rad สหรัฐอเมริกา) โซลูชั่นเคลียร์ถูกโหลดลงบนแถบ IPG พีเอช 4-7 (GE Healthcare Bio-วิทยาศาสตร์สหราชอาณาจักร) และอยู่ภายใต้การ2D-GE ใช้PROTEAN® IEF และPROTEIN®ครั้งที่สองจินเซลล์ (Bio-Rad, สหรัฐอเมริกา) หลังจากที่อิ, phosphoproteins ในเจลถูกย้อมโดยใช้Pro-Q®เพชร phosphoprotein คราบเจล (Invitrogen, สหราชอาณาจักร) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ฟลูออเรสัญญาณถูกมองเห็นโดยใช้ Phosphorimager ไต้ฝุ่น TrioTM (GE ดูแลสุขภาพ) หลังจากที่ Pro-Q®ย้อมสีเพชรเจลมีการย้อมด้วยสีฟ้าCoomassie R-250 (Bio-Rad สหรัฐอเมริกา) สำหรับการตรวจหาโปรตีนรวมและมองเห็นการใช้ImageScannerTM ii (GE Healthcare). ความเข้มของ phosphoproteins และโปรตีนรวมในที่เจล 2D-GE วิเคราะห์โดยใช้แพลทินั่ 2D ImageMasterTM v7.0 ขั้นตอนการย่อยอาหารในเจลที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดย Shevchenko, et al (2007) และเปปไทด์ tryptic วิเคราะห์โดยใช้นาโนHRESIMS-LC (EASY-nLCII, Bruker Daltonics, เยอรมนี) -MS / MS (microTOF-QII, Bruker Daltonics, เยอรมนี) ผลลัพธ์ที่ได้จาก LC-MS / MS ถูกยัดเยียดให้ค้นหาฐานข้อมูลโดยใช้ฐานข้อมูลออนไลน์มิ่งขวัญและผลของผลลัพธ์เหล่านี้ได้รับการเปรียบเทียบระหว่างเงื่อนไขและข้ามการตรวจสอบโดยใช้Isoelectric มุ่งเน้นจุดและน้ำหนักโมเลกุลของจุดตัด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

lysates ที่เตรียมจาก raw264.7 เซลล์จะถูกพบและสกัดการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

) และบัฟเฟอร์ ( palaga et al . , 2008 ) ระดับโปรตีนวัด
ใช้ bcatm โปรตีน 3 ชุด ( เพียร์ซ , USA ) ตาม
สอนของผู้ผลิต หนึ่งร้อยห้าสิบไมโครกรัม
โปรตีนจากแต่ละภาพจะถูกเอาออก
ของไขมันกรดนิวคลีอิก , เกลือและสารปนเปื้อนอื่น ๆโดยใช้ 2D
ล้าง Kit ( สหรัฐอเมริกาไบแรด ) การล้างโซลูชั่นถูกโหลดลงบน
IPG แถบพีเอช 4 – 7 ( สหราชอาณาจักร GE Healthcare วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ) และภายใต้
เพื่อ 2d-ge ใช้บทสรุป®ซึ่งเปลี่ยนแปลงได้มาก และโปรตีน® II ซีเซลล์ ( ไบแรด
, USA ) หลังจากอิเล็ก , phosphoproteins ในเจลเป็น
เปื้อนใช้ pro-q ®เพชรเจลคราบ ( Invitrogen
, ฟอสโฟโปรตีนอังกฤษ ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สัญญาณฟลูออเรสเซนต์
ถูกมองเห็นใช้ phosphorimager พายุไต้ฝุ่น triotm ( GE
Healthcare ) หลังจาก pro-q ®เพชรการย้อมสีเจลใช้ย้อม
กับเหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้า r-250 ( USA ไบแรด ) โดยการใช้โปรตีนและมองเห็น
imagescannertm II ( GE Healthcare ) .
ความเข้มของ phosphoproteins และโปรตีนรวมใน
เจล 2d-ge วิเคราะห์โดยใช้ imagemastertm 2D แพลทินัม
v7.0 . ในกระบวนการย่อยอาหาร เจลได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้
โดย Shevchenko et al . ( 2007 ) และเปปไทด์อาหารวิเคราะห์
ใช้ hresims นาโน LC ( ง่าย nlcii บรูกเกอร์ ดอลโทนิก
, , เยอรมนี ) - MS / MS ( microtof qii บรูกเกอร์ ดอลโทนิก , เยอรมนี )
ผล LC MS / MS ซึ่งถูกใช้เป็นฐานข้อมูลการค้นหา
ฐานข้อมูลสำหรับออนไลน์และผลของผลลัพธ์เหล่านี้
เปรียบเทียบระหว่างสภาพและข้ามตรวจสอบโดยใช้ไอโซอิเล็กทริก
เน้นจุดและน้ำหนักโมเลกุลของตัดจุด