2. Materials and methods2.1. Animal

2. Materials and methods
2.1. Animals
Forty-eight (40.5 ± 9.3 g weight and 16 ± 1.1 cm length) specimens
of the sea water teleost European sea bass (Dicentrarchus
labrax), obtained from the local farm (Predomar S.I., Almería,
Spain), were kept in re-circulating seawater aquaria (250 L) in the
Marine Fish Facility at the University of Murcia. The water temperature
was maintained at 20 ± 2
C with a flow rate of 900 L h1
and 28‰ salinity. The photoperiod was of 12 h light: 12 h dark and
fish were fed with a commercial pellet diet (Skretting, Spain) at a
rate of 2% body weight day1. Fish were allowed to acclimatise for
15 days before the start of the experimental trial. All experimental
protocols were approved by the Ethical Committee of the University
of Murcia.
2.2. Preparation of microorganism
S. putrefaciens (Pdp11) was grown in tubes containing trypticase
soya broth (TSB, Sigma) supplemented with 1.5% NaCl (TSBs) at
22
C, which were continuously shook for 18 h. The absorbancewas
measured at 600 nm from 1 ml aliquots of bacteria cell culture
every hour for 9 h, until bacteria had been growing for 24 h.
Simultaneously, it was measured the number of bacterial cells
present per ml of culture medium of such aliquots by plating, in
order to characterise the growth curve of bacterium. Subsequently,
bacterial cell cultures were centrifuged (6000 g, 15 min, 4
C),
washed them in sterile PBS (pH 7.4), counted by plating and
adjusted to the required concentrations.
2.3. Date palm fruit extracts
Date palm fruits were purchased freshly ripened of the Degla
variety in a local supermarket (Murcia, Spain). To extract the watersoluble
material, dried fruits (200 g) were washed using sterile
distilled water, cut them into small-sized pieces, including peel and
pulp, but not seeds, added 500 ml of sterilised distilled water, and
incubated them for 2 h at a room temperature of 22
C. The mixture
was ground by stirring using a Moulinex machine and the supernatant
was collected by centrifugation (2000 rpm, 15 min) and
stored at 4
C until use.
2.4. Experimental diets
The probiotic bacterial cells and the aqueous palm fruit extracts
were added to the commercial diet according to [29]. The concentrations
used in the present work are that used in our previous
studies giving us better results [29,30]. Briefly, the probiotic and
date palm extracts were dissolved, alone and in combination, in the
least possible amount of cod oil, which was then sprayed on the
pellets before feeding the animals. The non-supplemented diet
(control) was sprayed only with cod oil. All the experimental diets
were kept in a light protected environment and stored at 4
C until
use.
2.5. Experimental design
Fish were randomly assigned and divided into four identical
tanks (n ¼ 6) where four groups were established: 1) control, nonsupplemented
diet; 2) Pdp11 diet, control diet supplemented with
S. putrefaciens Pdp11 (109 cfu g1); 3) date palm fruit diet, commercial
diet supplemented with aqueous extracts of date palm
fruits (100 g kg1); 4) mixture diet, commercial diet supplemented
with Pdp11 (109 cfu g1) and extracts of palm fruits (100 g kg1). Six
specimens were sampled from each aquarium following 2 or 4
weeks of feeding, after starving them for 24 h prior to sampling. All
specimens were sacrificed by using an overdose of MS222 (Sandoz).
All experimental protocols were approved by the Ethical Committee
of the University of Murcia.
2.6. Sample collection
Fish were weighed and measured. Blood samples were collected
from the caudal vein with an insulin syringe and the head-kidney
(HK) and the gut were dissected. The blood samples were left to
clot at 4
C for 4 h and later the serum was collected after centrifugation
(10,000 g, 5 min, 4
C) and stored at 80
C until use.
Fragments of HK and gut were stored in TRIzol Reagent (Invitrogen)
at 80
C for gene expression analysis. Other HK samples were cut
into small fragments and transferred to 8 ml of sRPMI [RPMI-1640
culture medium (Gibco) supplemented with 0.35% sodium chloride,
2% foetal calf serum (FCS, Gibco),100 i.u. ml1 penicillin (Flow)
and 100 mg ml1 streptomycin (Flow)] [31]. Cell suspensions were
obtained by forcing fragments of the organ through a nylon mesh

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. สัตว์สี่สิบแปด (40.5 ± 9.3 กรัมน้ำหนักและความยาว 1.1 ซม. 16 ±) ตัวอย่างของทะเลน้ำ teleost ยุโรปทะเลเบส (Dicentrarchuslabrax), ได้จากฟาร์มท้องถิ่น (Predomar S.I., Almeríaประเทศสเปน), ถูกเก็บไว้ในการหมุนเวียนน้ำทะเลอควาเรีย (250 L) ในการปลาทะเลที่อำนวยความสะดวกที่มหาวิทยาลัยมูร์เซีย อุณหภูมิของน้ำถูกเก็บรักษาไว้ที่ 20 ± 2 C ด้วยอัตราการไหลของ 900 L h 1และความเค็ม 28‰ ชั่วโมงถูกแสง 12 h: 12 h มืด และปลาที่เลี้ยง ด้วยอาหารเม็ดเพื่อการพาณิชย์ (Skretting สเปน) ที่มีอัตรา 2% ร่างกายน้ำหนักวันที่ 1 ปลาที่ได้รับอนุญาตให้ acclimatise สำหรับ15 วันก่อนเริ่มการทดลองทดลอง ทดลองทั้งหมดโปรโตคอลที่ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยของมูร์เซีย2.2. การเตรียมการของจุลินทรีย์S. putrefaciens (Pdp11) ถูกปลูกในท่อที่ประกอบด้วย trypticaseเหลืองน้ำซุป (TSB, Sigma) เสริม ด้วย 1.5% NaCl (TSBs) ที่22 C ซึ่งต่อเนื่องส่ายสำหรับ 18 h Absorbancewas การวัดที่ 600 nm จาก 1 ml aliquots วัฒนธรรมเซลล์แบคทีเรียทุกชั่วโมงสำหรับ 9 h จนกว่าแบคทีเรียมีการเติบโต 24 ชั่วโมงพร้อมกัน เป็นวัดจำนวนเซลล์แบคทีเรียนำเสนอต่อมิลลิลิตรของสื่อวัฒนธรรมของ aliquots ดังกล่าว โดยชุบเพื่อทำการวัดลักษณะกราฟการเติบโตของแบคทีเรีย ต่อมาวัฒนธรรมเซลล์แบคทีเรียได้จาก (6000 กรัม 15 นาที 4 C),ล้างพวกเขาใน PBS เป็นหมัน (pH 7.4), ตรวจนับ โดยชุบ และปรับความเข้มข้นที่จำ2.3 วันปาล์มสารสกัดจากผลไม้ซื้ออินทผลัมผลไม้สุกสดของ Deglaความหลากหลายในซูเปอร์มาร์เก็ตท้องถิ่น (มูร์เซีย สเปน) การแยกการ watersolubleวัสดุ ผลไม้แห้ง (200 กรัม) ถูกซัดใช้ผ่านการฆ่าเชื้อกลั่นน้ำ ตัดเป็นขนาดเล็กชิ้น รวมทั้งเปลือก และเยื่อกระดาษ แต่ไม่เมล็ด เพิ่ม 500 มล.ผ่านการฆ่าเชื้อน้ำกลั่น และได้รับการกกให้ 2 ชม.ที่อุณหภูมิห้อง 22 เซลเซียส ส่วนผสมเป็นพื้นดิน โดยใช้เครื่อง Moulinex และ supernatant กวนรวบรวม โดยการหมุนเหวี่ยง (2000 รอบต่อนาที 15 นาที) และเก็บไว้ที่ 4 C จนกว่าจะใช้2.4 การทดลองอาหารเซลล์แบคทีเรียโปรไบโอติกและสารสกัดผลไม้ปาล์มอควีถูกเพิ่มไปยังอาหารเชิงพาณิชย์ตาม [29] ความเข้มข้นใช้ในการทำงานปัจจุบันมีที่ใช้ในของเราก่อนหน้านี้ศึกษาที่ให้ผลลัพธ์ที่ดีกว่า [29,30] สั้น ๆ โปรไบโอติก และวันปาล์มสารสกัดถูกละลาย เพียงลำพัง และ ร่วม ในการน้ำมัน cod ซึ่งถูกพ่นจากนั้นในจำนวนน้อยได้เม็ดก่อนอาหารสัตว์ อาหารเสริมไม่ใช่(ตัวควบคุม) ถูกพ่น ด้วยน้ำมัน cod อาหารทดลองทั้งหมดเก็บไว้ในสภาพแวดล้อมป้องกันแสง และเก็บไว้ที่ C 4 จนถึงการใช้งาน2.5. ทดลองออกแบบปลาถูกสุ่มกำหนด และแบ่งออกเป็นสี่เหมือนกันรถถัง (n ¼ 6) ที่ก่อตั้งกลุ่มที่สี่: 1) การควบคุม nonsupplementedอาหาร 2) อาหาร Pdp11 ควบคุมอาหารเสริมด้วยS. putrefaciens Pdp11 (109 cfu g 1); 3) อินทผลัมผลไม้อาหาร พาณิชย์อาหารเสริม ด้วยสารสกัดจากสารละลายวันปาล์มผลไม้ (100 กรัมกก. 1); 4) ส่วนผสมอาหาร ธุรกิจอาหารเสริมกับ Pdp11 (109 cfu g 1) และสารสกัดจากผลปาล์ม (100 กรัมกก. 1) หกอย่างได้ตัวอย่างจากพิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำแต่ละต่อไป 2 หรือ 4สัปดาห์ของการให้อาหาร หลังจากที่หิวโหยเหล่านั้นสำหรับ 24 ชมก่อนสุ่มตัวอย่าง ทั้งหมดตัวอย่างขณะเดียว โดยการใช้ยาเกินขนาดเป็นของ MS222 (Sandoz)โปรโตคอลการทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของมูร์เซียของมหาวิทยาลัย2.6. เก็บตัวอย่างปลาถูกชั่งน้ำหนัก และวัด ตัวอย่างเลือดที่ถูกเก็บรวบรวมจากหลอดเลือดดำด้วยเข็มฉีดยาอินซูลินการและไตหัวครีบ(HK) และลำไส้ถูก dissected ตัวอย่างเลือดที่ถูกทิ้งให้ภาวะ 4 c เป็นเวลา 4 ชั่วโมง และภายหลังเก็บซีรั่มหลังการหมุนเหวี่ยง(10,000 g, 5 นาที 4 C) และเก็บไว้ที่ 80 C จนใช้ชิ้นส่วนของ HK และลำไส้ถูกเก็บอยู่ใน TRIzol เอเจนต์ (Invitrogen)ที่ 80 C สำหรับวิเคราะห์การแสดงออกของยีน ตัวอย่าง HK อื่น ๆ ถูกตัดเป็นชิ้น ๆ เล็ก ๆ และโอนย้ายไป sRPMI [RPMI 1640 8 mlสื่อวัฒนธรรม (Gibco) เสริม ด้วย 0.35% โซเดียมคลอไรด์เซรั่ม 2% บ่อย ๆ น่อง (FCS, Gibco), 100 i.u. ml 1 ยาเพนนิซิลลิน (ไหล)และ streptomycin ml 1 100 มก. (ไหล)] [31] สารแขวนลอยเซลล์ได้ได้ โดยการบังคับให้ชิ้นส่วนของอวัยวะใช้ตาข่ายไนล่อน