2.3. DNA extraction, PCR and sequen

2.3. DNA extraction, PCR and sequencing
Total DNA was extracted from the hepatopancreas using a commercial
tissue extraction kit (Qiagen, Germany). DNA was amplified
using PCR primers designed from the alignment of 11
microsporidian SSU rRNA gene sequences at GenBank in such a
manner that the primers were based in highly conserved regions
of the gene but amplified a fragment from a highly variable region.
The primers were MF1 (forward) 50-CCG GAG AGG GAG CCT GAG
A-30 and MR1 (reverse) 50-GAC GGG CGG TGT GTA CAA A-30 , relative
to positions 242–260 and 1165–1183, respectively, of the
small subunit (SSU) rRNA gene of Enterocytozoon bieneusi (Genbank
accession No. AF024657). Based on the 11 sequences used, expected
amplicons would be in the range of approximately 900–
1000 bp. The PCR process was carried out in 50 lm reaction mixtures
containing PCR buffer, 200 mM dNTP, 2 mMMgCl2, 1.25 units
Taq polymerase, 1 mM primers and 1 ll template. Reactions were
followed by 35 cycles of denaturation for 30 s at 94 C, annealing
for 30 s at 55 C, and extension at 72 C for 90 s, followed by a 5-
min final extension at 72 C. An SSU fragment of 1200 bp in length
was amplified and inserted into a TOPO Cloning Kit (Invitrogen,
USA). Plasmids were checked for inclusion of the desired insert
and subsequently purified with NucleoSpin Extract Kit (Qiagen,
Germany). Following hybridization with shrimp genomic DNA,
clones that did not show signals were further processed for DNA
sequence determination (Macrogen, South Korea). The insert from
one of these clones (final length 848 bp minus the primer sequences)
gave high sequence identity to microsporidian rRNA sequences
in the GenBank database

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. DNA สกัด PCR และลำดับดีเอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจาก hepatopancreas ใช้การพาณิชย์ชุดแยกเนื้อเยื่อ (Qiagen เยอรมนี) ดีเอ็นเอถูกขยายใช้ PCR ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาจากการจัดตำแหน่งของ 11microsporidian SSU rRNA ยีนลำดับที่ GenBank เช่นการพื้นที่อนุรักษ์ลักษณะที่ไพรเมอร์ที่มีอยู่สูงของยีนแต่ขยายส่วนภูมิภาคแปรสูงไพรเมอร์ที่ถูก MF1 (ข้างหน้า) 50 CCG ก็อกก็อก AGG CCT ปิดปากA-30 และ MR1 (ย้อนกลับ) 50-GAC GGG CGG TGT GTA CAA-30 ญาติกับตำแหน่ง 242 – 260 และ 1165-1183 ลำดับ การย่อยขนาดเล็ก (SSU) ยีน rRNA ของ Enterocytozoon bieneusi (Genbankทะเบียนหมายเลข AF024657) ตามลำดับที่ 11 ใช้ที่คาดไว้amplicons จะอยู่ในช่วงประมาณ 900 –1000 bp กระบวนการ PCR ได้ดำเนินการใน 50 lm ปฏิกิริยาผสมประกอบด้วยบัฟเฟอร์ PCR, 2 mMMgCl2, 200 mM dNTP, 1.25 หน่วยTaq พอลิเมอเรส ไพรเมอร์ 1 มม.และ 1 ll แม่ ปฏิกิริยาได้ตาม ด้วยรอบ 35 ของ denaturation 30 s ที่ 94 C หลอมสำหรับ 30 วินาทีที่ 55 C นามสกุลที่ 72 C 90 s ตาม ด้วย 5 -นามสกุลสุดท้ายนาทีที่ 72 c ส่วนการ SSU ของ 1200 bp ความยาวขยาย และแทรกลงในภูมิประเทศได้โคลนชุด (Invitrogenสหรัฐอเมริกา) Plasmids ได้ถูกตรวจสอบสำหรับการรวมการแทรกที่ต้องการและบริสุทธิ์มา ด้วย NucleoSpin แยกชุด (Qiagenเยอรมนี) Hybridization ต่อกับดีเอ็นจีโนมของกุ้งโคลนที่ไม่ได้แสดงสัญญาณถูกประมวลผลเพิ่มเติมสำหรับดีเอ็นเอมีการกำหนดลำดับ (Macrogen เกาหลีใต้) แทรกจากโคลนเหล่านี้ (ความยาวสุดท้าย 848 bp ลบลำดับรองพื้น) อย่างใดอย่างหนึ่งให้สูงลำดับรหัสประจำตัว microsporidian rRNA ลำดับในฐานข้อมูลของ GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การสกัดดีเอ็นเอ PCR และลำดับ
รวมดีเอ็นเอที่สกัดจากตับโดยใช้เชิงพาณิชย์
ชุดสกัดเนื้อเยื่อ (Qiagen, เยอรมนี) ดีเอ็นเอถูกขยาย
โดยใช้ไพรเมอร์ PCR ที่ออกแบบมาจากการจัดตำแหน่งของ 11
microsporidian ซุ rRNA ลำดับยีนที่ GenBank ดังกล่าวใน
ลักษณะที่ไพรเมอร์ที่ได้มาจากในพื้นที่ป่าสงวน
ของยีน แต่ขยายชิ้นส่วนจากภูมิภาคตัวแปร.
ไพรเมอร์เป็น MF1 ( ไปข้างหน้า) 50-GAG CCG AGG GAG CCT GAG
A-30 และ MR1 (ย้อนกลับ) 50 GAC GGG CGG TGT GTA CAA A-30 ญาติ
ให้ดำรงตำแหน่ง 242-260 และ 1165-1183 ตามลำดับของ
หน่วยย่อยขนาดเล็ก (ซุ) ยีน rRNA ของ Enterocytozoon bieneusi (Genbank
เลข AF024657) ขึ้นอยู่กับลำดับ 11 ใช้คาดว่า
amplicons จะอยู่ในช่วงประมาณ 900-
1000 bp กระบวนการ PCR ได้ดำเนินการใน 50 LM ผสมปฏิกิริยา
ที่มีบัฟเฟอร์ PCR 200 มิลลิ dNTP 2 mMMgCl2 1.25 หน่วย
Taq โพลิเมอร์ 1 มิลลิเมตรและมีไพรเมอร์ 1 LL แม่แบบ ปฏิกิริยาถูก
ตามด้วย 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติเป็นเวลา 30 วินาทีที่ 94? C, การอบ
เป็นเวลา 30 วินาทีที่ 55 องศาเซลเซียสและนามสกุลที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 วินาทีตามด้วย 5-
ขยายสุดท้ายนาทีที่ 72 องศาเซลเซียส แฟรกเมนต์ซุ 1200 BP ยาว
ถูกขยายและแทรกเข้าไปใน TOPO โคลน Kit (Invitrogen,
USA) พลาสมิดถูกตรวจสอบสำหรับการรวมของแทรกที่ต้องการ
และทำให้บริสุทธิ์ด้วยสารสกัดจากชุด NucleoSpin ภายหลัง (Qiagen,
เยอรมนี) ต่อไปนี้การผสมข้ามพันธุ์กับกุ้งดีเอ็นเอ,
โคลนที่ไม่ได้แสดงสัญญาณที่ถูกประมวลผลต่อไปสำหรับดีเอ็นเอ
การกำหนดลำดับ (Macrogen, เกาหลีใต้) แทรกจาก
หนึ่งในโคลนเหล่านี้ (สุดท้ายความยาว 848 bp ลบลำดับไพรเมอร์)
ให้ลำดับบัตรสูงลำดับ rRNA microsporidian
ในฐานข้อมูลของ GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การสกัด DNA sequencing PCR และดีเอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากกุ้งที่ใช้ในเชิงพาณิชย์ชุดสกัดเนื้อเยื่อ ( QIAGEN , เยอรมัน ) ดีเอ็นเอ คือ อัตราการใช้ PCR ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาจากการ 11ไมโครสปอริเดียนซื่อ rRNA ลำดับยีนที่พบในเช่นโดยลักษณะที่ใช้ในบริเวณอนุรักษ์สูงของยีน แต่ขยายส่วนจากตัวแปรสูงภูมิภาคไพรเมอร์ถูก mf1 ( ต่อ ) 50-ccg มุข agg มุข CCT แก๊กและ a-30 mr1 ( ย้อนกลับ ) 50-gac GGG CGG TGT GTA caa a-30 ญาติตำแหน่ง– 1 – 260 242 และได้ตามลำดับของใบเล็ก ( ซื่อ ) rRNA ยีน enterocytozoon bieneusi ( ขนาดของเข้า ไม่ af024657 ) ตามลําดับ คาด 11 ใช้amplicons จะอยู่ในช่วงประมาณ 900 –1 , 000 BP . กระบวนการ PCR พบว่าในการผสม 50 โดยที่มี PCR buffer , 200 มม. dntp 2 mmmgcl2 1.25 หน่วยแทคใช้ไพรเมอร์ 1 มม. และ 1 จะแม่แบบ ปฏิกิริยาคือตามด้วย 35 รอบ ( 30 s ที่ 94 องศาเซลเซียส อบอ่อน30 S 55 C , และส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 วินาที ตามด้วย 5 -นาที 72 C สุดท้ายขยายเป็นซื่อเบส 1200 BP ในความยาวคืออัตรา และแทรกลงในสถานที่ชุด ( Invitrogen โคลน ,สหรัฐอเมริกา ) พลาสมิดถูกตรวจสอบสำหรับการรวมของที่ต้องการแทรกและต่อมาให้บริสุทธิ์ด้วยสารสกัดจาก nucleospin ( เพิ่มชุด ,เยอรมนี ) ต่อไปนี้ hybridization กับดีเอ็นเอกุ้งโคลนที่ไม่ได้แสดงสัญญาณได้ประมวลผลดีเอ็นเอการกำหนดลำดับ ( macrogen , เกาหลีใต้ ) แทรกจากหนึ่งของโคลนเหล่านี้ ( สุดท้ายความยาว 848 BP ลบรองพื้นลำดับ )ให้ตัวตนดับสูงไมโครสปอริเดียน rRNA ลำดับขนาดฐานข้อมูลใน