2.3. Lymphocyte blastogenesisSpleen

2.3. Lymphocyte blastogenesis
Spleens were minced in RPM1 1640 medium and
lymphocytes isolated in a Ficoll-Hypaque gradient.
Lymphocytes in complete medium (RPM1 1640, 5%
bovine fetal serum, 2 mM L-glutamine and gentamycin
50 mg/l) were seeded at 2 X 10’ cells/well in 96-well
flat-bottomed microtitre plates. Medium alone or
medium with an optimal concentration of Concanavalin
A (ConA) 0.5 P./well (Sigma, St. Louis, MO)
was added and the plates incubated for 120 h at 37°C
at 5% CO, and 95% air. A dose-response curve for
ConA was performed to determine the optimal mitogen
concentration. The optimal response in unweaned
pups was achieved at 5 days of culture. Tritiated thymidine,
0.5 &i/well (specific activity 6.7 &i/mM NEN,
Boston, MA) was added to the culture wells during the
last 18 h of incubation. Samples were tested in triplicate
(Schlesinger et al., 1992).
2.4. IL-l induction
IL-l was induced in adherent spleen cells employing
a modification of the Hiffner-Cavaillon technique
(Haffner-Cavaillon et al., 1990). One-million of spleen
lymphocytes were adhered with complete medium in
24-well culture plates during 2 h at 37°C in 5% CO,-
95% air. Non-adherent cells were removed by PBS
washings and adherent cells were stimulated with 10
pg LPS (Sigma) in complete medium with indomethacin
1 pg/ml (INDO, Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) during 24 h. The percentage of
macrophages in the adherent cell population assessed
by non-specific stearase staining ranged between 70
and 80% in all animal groups. At the end of the
incubation period, adherent cells were washed and
lysed by three freeze-thaw cycles and maintained at
-70°C until assay for IL-l biological activity.
IL-l activity was measured employing a thymocyte
proliferation assay (Nouri et al., 1984). Thymuses of
CH3/He 5-6-week-old mouse were finely minced in
complete RPM1 1640 medium. The final cell preparation
was adjusted to 7 x 10’ cells/well in 96 wells
microtitre plates (flat bottomed) in complete medium
with 10e5 M 2-mercaptoethanol and ConA (0.08 kg).
100 ~1 of a 1:lO dilution of the adherent spleen cell
lysate was added to this culture system and incubated
for 3 days at 37°C in 5% CO,-95% air. Proliferation
was assessed by measuring the incorporation of 0.5 PCi
of tritiated thymidine/well during 18 h pulse and expressed
as mean cpm of triplicate wells using standard
liquid scintillation techniques

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. lymphocyte blastogenesisSpleens ถูกสับใน RPM1 1640 และlymphocytes ที่แยกต่างหากในไล่ Ficoll HypaqueLymphocytes ในสมบูรณ์ปานกลาง (RPM1 1640, 5%เซรั่มครรภ์วัว 2 มม. L glutamine และ gentamycin50 mg/l) ถูก seeded ที่ 2 X 10' เซลล์/ดีใน 96-ดีแผ่น flat-bottomed microtitre สื่อเพียงอย่างเดียว หรือขนาดกลาง มีความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ Concanavalin(ConA) P. 0.5/บ่อ (ซิก St. Louis, MO)เพิ่ม และแผ่น incubated สำหรับ h 120 ที่ 37° Cที่ 5% CO และอากาศ 95% เส้นโค้งตอบรับยาสำหรับทำการกำหนด mitogen สุด ConAความเข้มข้น การตอบสนองที่ดีที่สุดใน unweanedpups สำเร็จใน 5 วันของวัฒนธรรม Tritiated thymidine0.5 และฉัน/ดี (กิจกรรม 6.7 และ ฉัน/mM ฆราวาสBoston, MA) ถูกเพิ่มเข้าไปบ่อวัฒนธรรมระหว่างการh 18 ล่าสุดของคณะทันตแพทยศาสตร์ ตัวอย่างทดสอบใน triplicate(Schlesinger et al., 1992)2.4. IL l การเหนี่ยวนำIL l ถูกทำให้เกิดเซลล์ม้ามนฤมลใช้การปรับเปลี่ยนเทคนิค Hiffner-Cavaillon(Haffner Cavaillon et al., 1990) หนึ่ง - ล้านของม้ามlymphocytes ถูกปฏิบัติตาม ด้วยสื่อสมบูรณ์ในวัฒนธรรมดี 24 แผ่นระหว่าง h 2 ที่ 37° C 5% CO, -อากาศ 95% เซลล์ไม่มี adherent ออก โดย PBSwashings และนฤมลเซลล์ที่ถูกกระตุ้น ด้วย 10pg LPS (ซิกมา) ในสื่อสมบูรณ์ด้วย indomethacin1 pg/ml (อินโด ซิกเคมี Co. เซนต์Louis, MO) ในช่วง 24 ชม เปอร์เซ็นต์ของบังเอิญในประชากรเซลล์นฤมลประเมินโดยเจาะจง stearase ย้อมสีแสก ๆ ระหว่าง 70และ 80% ในกลุ่มของสัตว์ทั้งหมด เมื่อสิ้นสุดการคณะทันตแพทยศาสตร์รอบระยะเวลา adherent เซลล์ถูกล้าง และlysed โดยสามรอบ thaw แช่แข็ง และเก็บรักษาที่-70° C จนถึงทดสอบในกิจกรรมชีวภาพ IL lIL l กิจกรรมที่วัดใช้เป็น thymocyteทดสอบการงอก (Nouri et al., 1984) Thymuses ของCH3 / เมาส์ 5-6-สัปดาห์เก่าเขาประณีตถูกสับในสมบูรณ์ปานกลาง RPM1 1640 การเตรียมเซลล์สุดท้ายมีการปรับปรุงการ 7 x 10' เซลล์/ดีในบ่อ 96microtitre แผ่น (แบนยนที่) ในสมบูรณ์10e5 M 2 mercaptoethanol และ ConA (0.08 ตามลำดับกก.)100 ~ 1 ของ 1: หล่อ เจือจางเซลล์ม้ามนฤมลlysate เพิ่มระบบนี้ และ incubatedสำหรับ 3 วันที่ 37° C 5% CO, -95% อากาศ การแพร่หลายถูกประเมิน โดยการวัดในการประสานของ 0.5 PCithymidine tritiated/ดี ระหว่างชีพจร 18 h และแสดงเป็น cpm เฉลี่ยของบ่อที่ใช้มาตรฐาน triplicateเทคนิค scintillation เหลว

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 เม็ดเลือดขาว blastogenesis
ม้ามถูกสับใน RPM1 1640 ขนาดกลางและ
เซลล์เม็ดเลือดขาวที่แยกได้ในการไล่ระดับสี Ficoll-Hypaque.
เซลล์เม็ดเลือดขาวในสื่อฉบับสมบูรณ์ (RPM1 1640, 5%
ซีรั่มของทารกในครรภ์วัว 2 มิลลิ L-glutamine และ Gentamycin
50 mg / l) เป็นเมล็ดที่ 2 X 10 'เซลล์ / ดีใน 96 หลุม
ที่ราบต่ำแผ่น microtitre ปานกลางคนเดียวหรือ
ขนาดกลางที่มีความเข้มข้นที่เหมาะสมของ Concanavalin
(Cona) 0.5 P. / ดี (Sigma, เซนต์หลุยส์)
ถูกบันทึกและแผ่นบ่มเป็นเวลา 120 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
ที่ CO 5% และ 95% ของอากาศ . เส้นโค้งปริมาณการตอบสนองสำหรับ
Cona ได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบ mitogen ดีที่สุด
เข้มข้น การตอบสนองที่ดีที่สุดใน unweaned
ลูกก็ประสบความสำเร็จใน 5 วันของวัฒนธรรม thymidine Tritiated,
0.5 และ I / ดี (กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจง 6.7 & I / มิลลิ NEN,
Boston, MA) ถูกบันทึกอยู่ในบ่อเพาะเลี้ยงในช่วง
ที่ผ่านมา 18 ชั่วโมงของการบ่ม ตัวอย่างถูกทดสอบในเพิ่มขึ้นสามเท่า
(ชเลซิงเจอร์ et al., 1992).
2.4 เหนี่ยวนำ IL-L
IL-L ถูกชักนำในเซลล์ม้ามสาวกจ้าง
ปรับเปลี่ยนเทคนิค Hiffner-Cavaillon
(Haffner-Cavaillon et al., 1990) หนึ่งล้านของม้าม
เซลล์เม็ดเลือดขาวที่ถูกยึดติดกับสื่อที่สมบูรณ์ใน
แผ่นวัฒนธรรม 24 หลุมระหว่างวันที่ 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน CO 5% -
95% อากาศ เซลล์ปลอดสานุศิษย์ถูกถอดออกโดยพีบีเอส
และเซลล์ซักพรรคพวกถูกกระตุ้นด้วย 10
PG LPS (Sigma) ในสื่อที่สมบูรณ์แบบด้วย indomethacin
1 พิโคกรัม / ml (INDO ซิก Chemical Co. , เซนต์
หลุยส์, MO) ระหว่างวันที่ 24 ชั่วโมง ร้อยละของ
ประชากรขนาดใหญ่ในเซลล์สานุศิษย์ประเมิน
โดยการย้อมสี stearase ไม่ใช่เฉพาะในช่วงระหว่าง 70
และ 80% อยู่ในกลุ่มสัตว์ทั้งหมด ในตอนท้ายของ
ระยะเวลาการบ่มเซลล์พรรคพวกถูกล้างและ
lysed โดยสามรอบแช่แข็งละลายและการบำรุงรักษาที่
-70 ° C จนตรวจหากิจกรรมทางชีวภาพ IL-L.
กิจกรรม IL-L วัดจ้าง thymocyte
ทดสอบการงอก (ดนูและ al., 1984) Thymuses ของ
CH3 / เขาเมาส์ 5-6 สัปดาห์เก่าถูกสับละเอียดใน
RPM1 สมบูรณ์ 1640 กลาง การเตรียมเซลล์สุดท้าย
ได้รับการปรับให้ 7 x 10 'เซลล์ / ดีใน 96 หลุม
แผ่น microtitre (จุดต่ำสุดแบน) ในสื่อที่สมบูรณ์
กับ 10e5 M 2-mercaptoethanol และ Cona (0.08 กก.)
100 ~ 1 จาก 1: LO เจือจาง เซลล์ม้ามสาวก
lysate ถูกบันทึกอยู่ในระบบวัฒนธรรมนี้และบ่ม
เป็นเวลา 3 วันที่ 37 ° C ใน 5% CO, -95% อากาศ ขยาย
ได้รับการประเมินโดยการวัดการรวมตัวของไอ 0.5
ของ thymidine tritiated / ดีในช่วงชีพจร 18 ชั่วโมงและแสดง
เป็นค่าเฉลี่ยต่อนาทีสำหรับหลุมเพิ่มขึ้นสามเท่าโดยใช้มาตรฐาน
เทคนิคประกายของเหลว

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 โดย blastogenesis
ม้ามถูกสับใน rpm1 1640 ขนาดกลาง และถูกแยกใน ficoll

hypaque ลาด . เม็ดเลือดขาวในสื่อสมบูรณ์ ( rpm1 1640 5 %
เซรั่มของทารกในครรภ์ และ Glutamine 2 มม. และเจนตามัยซิน
50 มก. / ล. ) เป็นเมล็ดที่ 2 x 10 ' เซลล์ / ดีใน 96 ดี
microtitre แบน bottomed แผ่น กลางคนเดียว หรือกับความเข้มข้นที่เหมาะสมของสื่อ

( ถูก cona ) 0 P/ ดี ( Sigma , St . Louis , MO )
เพิ่มและจาน บ่มที่ 37 ° C 120 H
5 % CO และ 95% อากาศ ความคิดเห็นที่โค้ง
cona ทำการศึกษาความเข้มข้นที่เหมาะสมปรากฎ
. การตอบสนองที่เหมาะสมใน unweaned
ลูกหมาอยู่ได้ 5 วัน ของวัฒนธรรม tritiated เพียง 0.5 &
/ ดี ( เฉพาะกิจกรรม 6.7 &ผม / อืมเณร
, Boston , MA ) คือเพิ่มวัฒนธรรมเวลส์ในระหว่าง
เมื่อ 18 ชั่วโมงของการบ่ม ตัวอย่างทดสอบทั้งสามใบ
( Schlesinger et al . , 1992 ) .
2.4 . il-l
il-l เหนี่ยวนำเซลล์ม้ามโดยสานุศิษย์
การเปลี่ยนแปลงของคาเวล์ลง hiffner เทคนิค
( ฮอฟเนอร์คาเวล์ลง et al . , 1990 ) หนึ่งล้านของม้ามเม็ดเลือดขาวถูกยึดติดกับสื่อสมบูรณ์

24 แผ่นดีในวัฒนธรรมระหว่าง 2 H ที่ 37 ° C ใน 5% CO , -
95% อากาศไม่ติดเซลล์ออกโดย PBS
washings สานุศิษย์เซลล์ได้รับการกระตุ้นและ 10
- สเปรย์หล่อลื่น ( Sigma ) ในอาหารที่สมบูรณ์กับอินโด
1 pg / ml ( อินโด , Sigma Chemical Co . , St .
Louis , MO ) ตลอด 24 ชั่วโมง ร้อยละ
macrophages ในพลพรรคเซลล์ประชากรประเมิน
โดยเฉพาะ stearase . อยู่ระหว่าง 70 และ 80 %
ในกลุ่มสัตว์ทั้งหมด ในตอนท้ายของ
ระยะเวลาพลพรรคเซลล์มีการล้างและละลาย
lysed สามรอบ และรักษาที่ 70 ° C )
- จน สำหรับกิจกรรมทางชีวภาพ il-l กิจกรรม
il-l วัดใช้ไทมอไซต์
proliferation assay ( นูริ et al . , 1984 ) thymuses ของ
CH3 / เขา 5-6-week-old เมาส์ถูกสับละเอียดที่สมบูรณ์ใน
rpm1 1640 ) สุดท้ายเตรียมปรับเซลล์
7 x 10 ' เซลล์ / ในบ่อ
96microtitre แผ่น ( แบน bottomed )
) M และสมบูรณ์ด้วยอย่างเดียว 10e5 cona ( 0.08 กิโลกรัม ) .
100 ~ 1 1 โล ( ของพลพรรคเซลล์ม้าม
lysate ถูกเพิ่มเข้าไปในระบบวัฒนธรรมและบ่ม
3 วัน ที่ 37 ° C ใน 5% CO , - 95% อากาศ การประเมินโดยการวัดการ

ของ tritiated เพียง 0.5 PCI / ตอน 18 H
ชีพจรและแสดงหมายความว่า CPM ของเวลส์ทำสำเนาสามฉบับ โดยใช้เทคนิคแสงมาตรฐาน
ของเหลว