Semi-quantitative PCR was done usin

Semi-quantitative PCR was done using nptII gene primers (nptIIF-5′ATGATGGATACTTTCTCGGCAGG3′ and nptIIR-5′TATGACTGGGCACAACAGACAAT3′). Genomic DNA was isolated from individual transformed callus lines converted into plantlets using DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen. After heating the genomic DNA at 94 °C for 2 min, the reaction proceeded with 30 cycles of 95 °C for 30 s (denaturation), 60 °C for 30 s (annealing) and 72 °C for 30 s (extension). A final elongation step was carried out at 72 °C for 5 min. To rule out the presence of Agrobacterium contamination in transgenic shoots generated after transformation, PCR amplification was carried out with Kan-gene specific primers, lying outside the T-DNA borders, present in the backbone of binary vector ( Fig. 2 and Fig. 4). Primers used for PCR amplification were KanF-5′GCAGAAGGCAATGTCATACC3′ and KanR-5′AGGCTCTTTCACTCCATCG3′). PCR products were separated using agarose gel electrophoresis and visualized under UV light. Transformation frequency was calculated by dividing the number of PCR positive transformants by the total number of callus pieces inoculated with Agrobacterium × 100 as follows:

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำ PCR กึ่งเชิงปริมาณใช้ nptII ยีนไพรเมอร์ (nptIIF-5′ATGATGGATACTTTCTCGGCAGG3′ และ nptIIR-5′TATGACTGGGCACAACAGACAAT3′) แยกต่างหากจากรายการให้แปรรูปแต่ละแปลงใช้ชุดมินิโรงงาน DNeasy, Qiagen plantlets genomic DNA ได้ หลังจากดีเอ็นเอ genomic ที่ 94 ° C สำหรับ 2 นาทีความร้อน ปฏิกิริยาครอบครัวกับวงจร 30 95 องศาเซลเซียสสำหรับ 30 s (denaturation), 60 ° C สำหรับ 30 s (การอบเหนียว) และ 72 ° C สำหรับ 30 s (นามสกุล) ขั้นตอนสุดท้าย elongation ที่ดำเนินที่ 72 ° C สำหรับ 5 นาที การยกเลิกสถานะการปนเปื้อนอโกรแบคทีเรียมในถั่วเหลืองอ่อนที่สร้างขึ้นหลังจากการเปลี่ยนแปลง ขยาย PCR ถูกดำเนินการ ด้วยกาฬยีนเฉพาะไพรเมอร์ นอนนอก T-ดีเอ็นเอเส้นขอบ อยู่ในแกนหลักของเวกเตอร์ฐาน (Fig. 2 และ Fig. 4) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับขยาย PCR ได้ KanF-5′GCAGAAGGCAATGTCATACC3′ และ KanR-5′AGGCTCTTTCACTCCATCG3′) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแบ่งใช้ electrophoresis เจ agarose และ visualized ภายใต้แสง UV การแปลงความถี่ถูกคำนวณ โดยการหารจำนวน PCR บวก transformants ตามจำนวนชิ้นให้ inoculated กับอโกรแบคทีเรียม× 100 เป็นดังนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Semi-PCR เชิงปริมาณที่ได้กระทำโดยใช้ไพรเมอร์ยีน nptII (nptIIF-5'ATGATGGATACTTTCTCGGCAGG3 และ nptIIR-5'TATGACTGGGCACAACAGACAAT3) ดีเอ็นเอที่แยกได้จากบุคคลเปลี่ยนสายแคลลัสแปลงเป็นต้นโดยใช้ DNeasy โรงงานมินิชุด Qiagen หลังจากที่ความร้อนดีเอ็นเอจีโนมที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีปฏิกิริยาดำเนินการกับ 30 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 30 วินาที (denaturation) 60 ° C เป็นเวลา 30 วินาที (หลอม) และ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที (ส่วนขยาย) ขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายได้ดำเนินการที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ที่จะออกกฎการปรากฏตัวของการปนเปื้อน Agrobacterium ในหน่อพันธุ์สร้างขึ้นหลังจากการเปลี่ยนแปลงการขยาย PCR ได้ดำเนินการกับกาญจน์ยีนไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงนอนอยู่นอกพรมแดน T-ดีเอ็นเออยู่ในกระดูกสันหลังของเวกเตอร์ไบนารี (รูป. ที่ 2 และรูปที่ 4. ) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยาย PCR เป็น KanF-5'GCAGAAGGCAATGTCATACC3 และ KanR-5'AGGCTCTTTCACTCCATCG3) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกแยกออกโดยใช้เจลอิ agarose และมองเห็นภายใต้แสงยูวี เปลี่ยนแปลงความถี่ที่คำนวณโดยการหารจำนวน transformants บวก PCR โดยจำนวนรวมของชิ้นแคลลัสที่มีเชื้อ Agrobacterium × 100 ดังนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และกึ่งปริมาณ โดยใช้ nptii ยีน PCR ( MBC MBC atgatggatactttctcggcagg3 nptiif-5 และได้รับ nptiir-5 tatgactgggcacaacagacaat3 School ) ดีเอ็นเอได้จากอาหารแต่ละแปลงสายแปลงเป็นต้น โดยใช้ชุดมินิโรงงาน dneasy เพิ่ม . หลังจากร้อนดีเอ็นเอที่ 94 ° C เป็นเวลา 2 นาที ปฏิกิริยาต่อ 30 รอบ 95 องศา C 30 ( ( s )60 ° C เป็นเวลา 30 วินาที ( อบ ) และ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที ( นามสกุล ) ขั้นตอนสุดท้ายคือการกระทำที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที เพื่อออกกฎที่มีการปนเปื้อนของอะโกรแบคทีเรียมในอุตสาหกรรม ยอดสร้างหลังจากการเปลี่ยนแปลงซึ่งถูกตรวจสอบ ด้วยไพรเมอร์ที่จำเพาะ การเพิ่มปริมาณยีนคันนอนนอก t-dna พรมแดน ปัจจุบันในกระดูกสันหลังของเวกเตอร์ไบนารี ( รูปที่ 2 และรูปที่ 4 )ไพรเมอร์ใช้ PCR แบบมี gcagaaggcaatgtcatacc3 kanf-5 ’และ’’’ kanr-5 aggctctttcactccatcg3 ) ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกแยกด้วยเจลอิเลคโตรโฟรีซีสและมองเห็นภายใต้แสงยูวี ความถี่การแปลงถูกคำนวณโดยการหารจำนวน PCR บวก transformants ด้วยจำนวนแคลลัสเชื้อ Agrobacterium × 100 ชิ้นมีดังนี้