2.2.3. Mitochondrial isolationMitoc

2.2.3. Mitochondrial isolation


Mitochondria were isolated from bovine cardiac muscles according
to Smith (1967), with minor modifications.

Minced tissue devoid of
fat and connective tissue (30 g)waswashed twicewith 250mMsucrose
and suspended in 60 mL of mitochondria isolation buffer [250 mM
sucrose, 10mMHEPES, 1mMEGTA, and 0.1% BSA, pH 7.2].

The suspension
was stirred slowly and hydrolyzed with protease (protease/tissue,
0.5mg/g of tissue) for 20min; the pH wasmaintained between 7.0 and
7.2.

After proteolytic digestion, the suspension was diluted to 300 mL
with mitochondria isolation buffer and homogenized using a Kontes
Duall grinder (Vineland, New Jersey) followed by a Wheaton Potter-
Elvehjem grinder (Millville, NJ, USA).

The homogenate was centrifuged
at 1200 ×g for 20 min with a Sorvall refrigerated RC-5B centrifuge
(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA, USA), and the resulting supernatant
was again centrifuged at 26,000 ×g for 15 min.

Mitochondrial
pellets were washed twice and suspended in mitochondria suspension
buffer (250 mM sucrose, 10 mM HEPES, pH 7.2). All steps were performed
at 0–4 °C.

Mitochondrial protein content was determined
using a bicinchoninic acid protein assay.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2.3 การ mitochondrial แยกMitochondria ถูกแยกต่างหากจากกล้ามเนื้อหัวใจวัวตามกับ Smith (ค.ศ. 1967), มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เนื้อเยื่อสับไร้ไขมันและเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (30 กรัม) waswashed twicewith 250mMsucroseและระงับใน 60 mL ของ mitochondria แยกบัฟเฟอร์ [250 มม.ซูโครส 10mMHEPES, 1mMEGTA และ 0.1% บีเอสเอ pH 7.2] การระงับกวนช้า และ hydrolyzed กับรติเอส (เยื่อรติเอส0.5 มิลลิกรัม/กรัมของเนื้อเยื่อ) สำหรับ 20 นาที wasmaintained ค่า pH ระหว่าง 7.0 และ7.2 หลังจากย่อยอาหาร proteolytic การระงับได้ผสมไป 300 มล.มี mitochondria แยกบัฟเฟอร์ homogenized เป็นกลุ่มโดยใช้การ Kontesบด Duall (Vineland นิวเจอร์ซีย์) ตามด้วย Wheaton พอตเตอร์-Elvehjem โม่ (Millville, NJ สหรัฐอเมริกา) Homogenate ถูก centrifugedที่ 1200 × g สำหรับ 20 นาทีกับการ Sorvall รเออร์ RC 5B เครื่องหมุนเหวี่ยง(เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ Waltham, MA, USA), และ supernatant ผลลัพธ์นอกจากนี้มีอีก centrifuged ที่ 26,000 × g สำหรับ 15 นาที Mitochondrialขี้ล้างสองครั้ง และหยุดใน mitochondria ระงับบัฟเฟอร์ (ซูโครส 250 มม. 10 มม. HEPES, pH 7.2) ดำเนินขั้นตอนทั้งหมดที่ 0 – 4 องศาเซลเซียส กำหนด mitochondrial โปรตีนใช้การวิเคราะห์โปรตีนกรด bicinchoninic

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2.3 แยกยลMitochondria ถูกแยกออกจากกล้ามเนื้อหัวใจวัวตามสมิ ธ (1967) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย. สับเนื้อเยื่อไร้ไขมันและเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (30 กรัม) waswashed twicewith 250mMsucrose และแขวนลอยใน 60 มิลลิลิตรของ mitochondria บัฟเฟอร์แยก [250 มิลลิซูโครส 10mMHEPES . 1mMEGTA และ 0.1% บีเอสเอพีเอช 7.2] ระงับถูกกวนอย่างช้า ๆ และไฮโดรไลซ์ด้วยเอนไซม์โปรติเอ (protease / เนื้อเยื่อ0.5mg / กรัมของเนื้อเยื่อ) สำหรับ 20min; ค่า pH wasmaintained ระหว่าง 7.0 และ7.2. หลังจากการย่อยโปรตีน, ระงับถูกเจือจางถึง 300 มิลลิลิตรกับ mitochondria บัฟเฟอร์แยกและหดหายใช้ Kontes บด Duall (ไวน์แลนด์, นิวเจอร์ซีย์) ตามมาด้วย Wheaton Potter- บด Elvehjem (Millville, นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา ). homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1200 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีกับ Sorvall centrifuge แช่เย็น RC-5B (Thermo Fisher Scientific, เคมบริดจ์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) และสารละลายที่เกิดขึ้นได้รับการหมุนเหวี่ยงอีกครั้งที่ 26,000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาที. ยลเม็ด ถูกล้างสองครั้งและแขวนลอยใน mitochondria ระงับบัฟเฟอร์ (250 มิลลิซูโครส 10 มม HEPES ค่า pH 7.2) ขั้นตอนทั้งหมดถูกดำเนินการที่ 0-4 ° C. ปริมาณโปรตีนยลถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบโปรตีนกรด bicinchoninic

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2.3 . การแยก


ไมโตคอนเดรียที่แยกได้จาก วัว หัวใจ กล้ามเนื้อ ตาม
สมิธ ( 1967 ) , มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย


สับเนื้อเยื่อไร้ไขมันและเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน ( 30 กรัม ) waswashed twicewith 250mmsucrose
อยู่ใน 60 ml ของ mitochondria แยกบัฟเฟอร์ [ 250 mm
ซูโครส 10mmhepes 1mmegta และ 0.1% , BSA , pH 7.2 ]


แขนถูกกวนช้าและย่อยด้วยเอนไซม์โปรติเอส ( protease /
0.5mg/g เนื้อเยื่อเนื้อเยื่อ ) สำหรับ 20 นาที ; พีเอช 7.0 และ 7.2 wasmaintained ระหว่าง
.

หลังจากการย่อยโปรตีน , การเจือจาง 300 ml
กับ mitochondria และบัฟเฟอร์แยกบดโดยใช้เครื่องบด duall kontes
( ไวน์แลนด์ , นิวเจอร์ซีย์ ) ตามด้วย Wheaton พอตเตอร์ -
elvehjem โม่ ( Millersburg , NJ , USA )

โดยแยกเป็นระดับ
1200 × G 20 นาทีกับ sorvall refrigerated centrifuge rc-5b
( เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , วอลแทม , MA , USA ) และผลสูง
อีกครั้งที่ระดับ 26 , 000 × G 15 นาที


ขี้ซักสองครั้ง และมีการหยุดชั่วคราวใน mitochondria ระงับ
บัฟเฟอร์ ( 250 มม. ซูโครส 10 มิลฮีเปส , pH 7.2 ) ทุกขั้นตอนมีการปฏิบัติ
0 – 4 ° C .

การใช้โปรตีนตั้งใจ
bicinchoninic กรดโปรตีน ตามลำดับ