METHODSStrains and Plasmids. The Sa

METHODS
Strains and Plasmids. The Saccharomyces cerevisiae expressing
yEGFP previously described27 was used, and Micrococcus luteus
(ATCC 4698) was obtained from ATCC. The centromeric expression
vector p4GM-LYZ was constructed as previously described.37 E. coli
strains BW25113 (F-, DE(araD-araB)567, lacZ4787(del)::rrnB-3,
LAM-, rph-1, DE(rhaD-rhaB)568, hsdR514), and JW1631-1 (F-,
DE(araD-araB)567, lacZ4787(del)::rrnB-3, LAM-, rph-1, DE(rhaDrhaB)
568, hsdR514, and ΔydhA788::kan) were purchased from The
Coli Genetic Stock Center at Yale University, Connecticut. ydhA was
previously renamed mliC.38 E. coli T7 Shuffle Express was purchased
from New England Biolabs.
Model Construction and Library Design. Using YASARA
v13.4.21,39 a single molecule from hLYZ structure 1JWR28 was
superimposed on the Ivyc-HEWL cocrystal structure 1GPQ,26 and the
HEWL molecules were then deleted. The resulting hLYZ-Ivyc
complex was energy minimized using the AMBER99 force field.40
Six residues were selected for mutation based on the modeled
interaction between hLYZ and E. coli Ivyc. A ConSurf29 bioinformatics
analysis, using default parameters, scored the hLYZ residues at the
interface between hLYZ and Ivy for evolutionary conservation. Poorly
conserved residues were then examined for interactions with Ivyc.
Residues V2, W34, and G37 have close packed van der Waals contacts
at the binding interface. Residues K33, R41, and R115 have extensive
hydrogen bonding with Ivyc.
Library Construction. A site directed hlyz library, using the NDT
degenerate codon at target sites,30 was constructed from synthetic
oligonucleotides as described in detail elsewhere.37 The external Nand
C-terminal primers included overlap with the EcoRI and XhoI
restriction sites in the p416-GAL1-αMF vector.41 The library was
cloned into the p416-GAL1-αMF vector by yeast gap repair
homologous recombination in the BJ5464::yEGFP S. cerevisiae strain.27
The statistics of library coverage were calculated using the GLUE
algorithm

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการสายพันธุ์และ Plasmids Saccharomyces cerevisiae แสดงyEGFP ก่อนหน้านี้ใช้ described27 และรำ luteus(ATCC 4698) ได้รับจาก ATCC นิพจน์ centromericเวกเตอร์ p4GM LYZ ถูกสร้างขึ้นเป็นก่อนหน้านี้ described.37 E. coliสายพันธุ์ BW25113 (F- DE (araD-อาหรับ) 567, lacZ4787 (del):: rrnB-3LAM-, rph-1, DE (rhaD-rhaB) 568, hsdR514), และ JW1631-1 (F-DE (araD-อาหรับ) 567, lacZ4787 (del):: rrnB-3 ลำ- rph-1, DE(rhaDrhaB)568, hsdR514 และ ΔydhA788::kan) ซื้อจากColi พันธุหุ้นศูนย์มหาวิทยาลัยเยล คอนเนตทิคัต ydhA ถูกเปลี่ยนชื่อ mliC.38 coli E. T7 สลับ Express ที่ซื้อก่อนหน้านี้จากนิวอิงแลนด์ Biolabsแบบก่อสร้างและออกแบบไลบรารี ใช้ YASARAv13.4.21, 39 ถูกโมเลกุลเดียวจาก hLYZ โครงสร้าง 1JWR28วางซ้อนอยู่บน 1GPQ Ivyc HEWL cocrystal โครงสร้าง 26 และโมเลกุล HEWL ถูกลบแล้ว ผลลัพธ์ hLYZ Ivycซับซ้อนถูกพลังงานลดใช้ field.40 แรง AMBER99ตกหกถูกเลือกสำหรับใช้ในการสร้างแบบจำลองการกลายพันธุ์โต้ตอบระหว่าง hLYZ และ Ivyc E. coli ConSurf29 bioinformaticsตก hLYZ ที่ทำการวิเคราะห์ การใช้พารามิเตอร์เริ่มต้น การอินเตอร์เฟซระหว่าง hLYZ และไอวี่สำหรับอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการ ไม่ดีนำตกได้แล้วตรวจสอบการโต้ตอบกับ Ivycตก V2, W34 และ G37 ได้ปิดบรรจุ van der Waals ติดต่อในอินเทอร์เฟซรวม ตก K33, R41, R115 มีมากมายไฮโดรเจนยึดกับ Ivycก่อสร้างไลบรารี ไลบรารีโดยตรง hlyz ไซต์ ผู้ใช้รหัสพันธุกรรม degenerate ที่ไซต์เป้าหมาย 30 ถูกสร้างจากหนังสังเคราะห์oligonucleotides ตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียด elsewhere.37 Nand ภายนอกไพรเมอร์ C-เทอร์มินัลรวมซ้อน ด้วย EcoRI และ XhoIมีไซต์ p416-GAL1-αMF vector.41 รีจำกัดโคลนเป็นเวกเตอร์ p416-GAL1-αMF โดยซ่อมแซมช่องว่างของยีสต์homologous recombination ในการ BJ5464::yEGFP S. cerevisiae strain.27สถิติของความครอบคลุมของไลบรารีถูกคำนวณโดยใช้กาวอัลกอริทึม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธี
สายพันธุ์และพลาสมิด Saccharomyces cerevisiae แสดง
yEGFP described27 ก่อนหน้านี้ถูกนำมาใช้และ Micrococcus luteus
(ATCC 4698) ที่ได้รับจาก ATCC การแสดงออก centromeric
เวกเตอร์ p4GM-LYZ ถูกสร้างไว้ก่อนหน้านี้ described.37 เชื้อ E. coli
สายพันธุ์ BW25113 (F-, เดลาแวร์ (Arad อาหรับ) 567, lacZ4787 (เดล) :: rrnB-3,
LAM-, RPH-1, DE ( rhad-Rhab) 568, hsdR514) และ JW1631-1 (F-,
DE (Arad อาหรับ) 567, lacZ4787 (เดล) :: rrnB-3, LAM-, RPH-1, DE (rhaDrhaB)
568, hsdR514, และΔydhA788 :: กาญจน์) ที่ซื้อมาจาก
ไลพันธุกรรมศูนย์สต็อกที่มหาวิทยาลัยเยลเนตทิคัต Ydha ก็
เปลี่ยนชื่อก่อนหน้านี้ mliC.38 เชื้อ E. coli T7 สลับด่วนถูกซื้อ
มาจากนิวอิงแลนด์ Biolabs.
การก่อสร้างแบบจำลองและการออกแบบห้องสมุด ใช้ YASARA
v13.4.21,39 โมเลกุลเดี่ยวจาก 1JWR28 โครงสร้าง hLYZ ถูก
ซ้อนทับบน Ivyc-HEWL โครงสร้าง cocrystal 1GPQ, 26 และ
โมเลกุล HEWL ถูกลบแล้ว ผล hLYZ-Ivyc
ซับซ้อนได้รับพลังงานลดการใช้กำลัง AMBER99 field.40
หกตกค้างถูกเลือกสำหรับการกลายพันธุ์ขึ้นอยู่กับรูปแบบ
การปฏิสัมพันธ์ระหว่าง hLYZ และเชื้อ E. coli Ivyc รส ConSurf29
การวิเคราะห์โดยใช้พารามิเตอร์เริ่มต้นทำแต้มตกค้าง hLYZ ที่
เชื่อมต่อระหว่าง hLYZ และไอวี่เพื่อการอนุรักษ์วิวัฒนาการ ไม่ดี
ตกค้างป่าสงวนถูกตรวจสอบแล้วสำหรับการสื่อสารกับ Ivyc.
ตกค้าง V2, W34 และ G37 ได้บรรจุใกล้แวนเดอร์วาลส์รายชื่อ
ที่อินเตอร์เฟซที่มีผลผูกพัน ตกค้าง K33, R41 และ R115 มีกว้างขวาง
พันธะไฮโดรเจนกับ Ivyc.
ก่อสร้างห้องสมุด เว็บไซต์กำกับห้องสมุด hlyz ใช้ NDT
codon เลวที่เว็บไซต์เป้าหมายที่ 30 ถูกสร้างขึ้นจากการสังเคราะห์
oligonucleotides ตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียด elsewhere.37 ภายนอก Nand
ไพร C-สถานีรวมถึงการทับซ้อนกับ EcoRI และ XhoI
เว็บไซต์ข้อ จำกัด ในการ p416-GAL1- αMF vector.41 ห้องสมุดถูก
โคลนเข้า p416-GAL1-αMFเวกเตอร์โดยการซ่อมแซมช่องว่างยีสต์
รวมตัวกันอีกคล้ายคลึงกันใน BJ5464 :: yEGFP S. cerevisiae strain.27
สถิติของความคุ้มครองห้องสมุดจะถูกคำนวณโดยใช้กาว
อัลกอริทึม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีการ
สายพันธุ์และพลาส . โดย Saccharomyces cerevisiae การแสดง
yegfp ก่อนหน้านี้ described27 ถูกใช้และ Micrococcus luteus
( ATCC 4698 ) ได้จาก ATCC . การ centromeric เวกเตอร์การแสดงออก
p4gm ลิซ ที่ถูกสร้างขึ้นโดย described.37 E . coli สายพันธุ์ bw25113
( F - เดอ ( Arad อาหรับ ) 325 , lacz4787 ( เดล ) : : rrnb-3
ลำ , - rph-1 de ( rhad rhab ) เอย , hsdr514 ) และ jw1631-1 ( F -
เดอ ( Arad อาหรับ ) 325 , lacz4787 ( เดล ) : : rrnb-3 ลำ - , rph-1 de ( rhadrhab )
เอย , hsdr514 และΔ ydha788 : : คัน ) ซื้อจากเชื้อพันธุกรรมหุ้น
ศูนย์ที่มหาวิทยาลัยเยล , Connecticut . ydha คือ
ก่อนหน้านี้เปลี่ยนชื่อ mlic.38 E . coli สับเปลี่ยนด่วน * * 3 เป็นซื้อจากประเทศอังกฤษ biolabs
.
รูปแบบการก่อสร้างและห้องสมุดออกแบบ ใช้ v13.4.21 yasara
,39 เป็นโมเลกุลเดี่ยว จาก 1jwr28 โครงสร้าง hlyz คือ
ซ้อนทับบน ivyc hewl cocrystal โครงสร้าง 1gpq , 26 และ
hewl โมเลกุลแล้วลบ ผล hlyz ivyc
ซับซ้อนพลังงานลดการใช้ amber99 สนามพลัง 40
6 ตกค้างได้คัดเลือกการกลายพันธุ์ตามแบบจำลองปฏิสัมพันธ์ระหว่าง hlyz และ E . coli
ivyc . เป็น consurf29 รสน
การวิเคราะห์การใช้ค่าพารามิเตอร์ค่าเริ่มต้นได้ hlyz ตกค้างที่
ติดต่อระหว่าง hlyz ไอวี่เพื่อการอนุรักษ์และวิวัฒนาการ งานอนุรักษ์ดินแล้ว
ตรวจสอบการปฏิสัมพันธ์กับ ivyc .
ตกค้าง V2 , w34 และ g37 ได้ปิดบริการแวนเดอวาลส์ติดต่อ
ที่อินเตอร์เฟซที่มีผลผูกพัน k33 r41 ตกค้าง , และ r115 มีไฮโดรเจนเชื่อมกับ ivyc อย่างละเอียด

ก่อสร้างห้องสมุดเว็บไซต์ห้องสมุด hlyz กำกับการ NDT
ทราม codon ที่เว็บไซต์เป้าหมาย 30 ถูกสร้างจากโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์
ตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียด elsewhere.37
และภายนอกโดยรวมซึ่งทับซ้อนกับ EcoRI และ xhoi
จำกัดเว็บไซต์ใน p416-gal1 - α MF vector.41 ห้องสมุดเป็น
โคลนใน p416-gal1 - เวกเตอร์αโดยศ. ยีสต์
ซ่อมแซมช่องว่างการเปรียบเทียบใน bj5464 : : yegfp S . cerevisiae สายพันธุ์ . 27
สถิติที่ครอบคลุมห้องสมุดคำนวณโดยใช้กาว
ขั้นตอนวิธี