2. Materials and methods2.1. Chemic

2. Materials and methods
2.1. Chemicals
TBT, 90%, was purchased from Sigma–Aldrich Chemical Co. (USA). Suitable amount of this compound was directly weighed into a brown volume vessel and dissolved in 50 ml acetone–water (1:1) to form a concentration level of 1 mg TBT/ml as the stock solution, in which a little HCl (1.0 mol/L) was added to ensure its stability. This stock solution was sealed and kept at 4 C in a refrigerator until used. Working standard solution (100 lg/ml) was freshly prepared by diluting the stock solution with deionized water before use.

2.2. Test fish and culture conditions
The rare minnow larvae (7 days after hatching, 9.65 ± 0.13 mm, 1.12 ± 0.17 mg) obtained from a local hatchery (Wuhan, China), was raised in a flow-through system with dechlorinated tap water
(pH 7.2–7.6; hardness 44.0–61.0 mg CaCO3/L) at a constant temperature (25 ± 1 C) with a photoperiod of 16:8 h (light:dark) and has been fed with newly hatched brine shrimp (Artemia nauplii) two times daily. Waste and residue were removed daily while the test equipment and chambers were cleaned once a week.

2.3. Experimental design
To investigate the effects of sublethal TBT on physiological and biochemical parameters, larvae (n = 20) were transferred to 50 ml beakers equipped with mild aeration and exposed to several TBT concentrations (100, 400 and 800 ng/L) for a period of 7 days. TBT concentration with 100, 400 and 800 ng/L was used as environmental level, 10% 96 h-LC50 and 20% 96 h-LC50 (the 96 h-
LC50 of TBT on Chinese rare minnow larvae was measured as 3.96 lg/L, unpublished), respectively. Another 20 test fish were raised in clean water for 1 week as the control group. Basic physical
and chemical indices of the water used in the sublethal test were maintained as described for the acclimation period. Each group was duplicated. The beakers were checked twice a day.
The behavioral changes of the healthy fish and the fish exposed to various doses of TBT were photographed with camera and evaluated for behavioral anomalies. The behavioral patterns changes of all tested fish were monitored according to the ASTM (E1711-95) Standard Guide for Measurement of Behavior during Fish Toxicity Tests. During the test, 80% of water was daily changed and replaced by new water containing the corresponding concentration of TBT. At the end of the exposure time, 6 larvae in each group were sampled, immediately frozen and stored at 80 C until further study. As rare minnows larvae were too small, all the biochemical analysis
and gene expressions were from a pool of whole larvae.

2.4. Biochemical assays
2.4.1. RNA/DNA ratio assay
Each sample was weighted and homogenized (1:10 w/v) within Tris–HCl buffer (pH 7.4). Free nucleotides were removed using a series of washes with cold perchloric acid (HClO4). RNA was then hydrolyzed with potassium hydroxide and the hydrolysate was acidified with cold HClO4 to remove the RNA from the DNA and protein. Muscle RNA/DNA ratio was measured using the method
according to Kuropat et al. [10] as modified by Mercaldo-Allen et al. [11].

2.4.2. Na+-K+-ATPase assay
Frozen samples for analysis of Na+-K+-ATPase activity were defrosted and homogenized on ice with 10 volumes of cold 0.86% physiological saline. The homogenate was centrifuged at 3000 rpm at 4 C for 10 min to obtain the supernatant for the enzyme activity assays of Na+-K+-ATPase, which was measured using the commercial kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) according to the manual. Na+-K+-ATPase activity, expressed as lmol Pi liberated/mg protein/h in fish.

2.5. Gene expression
2.5.1. RNA extraction and cDNA preparation
The larvae were washed twice with PBS (pH 7.4) and the total RNA of 10 homogenized larvae was extracted using Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) following the manufacturer’s
instructions. Each set of 10 larvae was pooled for RNA preparation. To remove the possibility of genomic DNA contamination, the RNA was digested by RNase-free DNase I (Promega Madison, WI, USA)
and then purified. The total RNA recovered from the DNase I digestion process was measured at 260 and 280 nm using a spectrophotometer (M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). The 260 nm
reading was used to estimate the concentration of total RNA. The RNA quality in each sample was verified by measuring the 260/280 nm ratios and by 1% agarose-formaldehyde gel electrophoresis
with ethidium bromide staining. The cDNA was synthesized using 2 lg of RNA from each sample mixed with 500 ng of random primer (Takara, Kyoto, Japan) to which was added 10 mM of dNTPs
diethylpyrocarbonate-(DEPC-) treated water to a final volume of 20 ll. The reaction was initiated using M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA) following the manufacturer’s protocols.

2.5.2. Quantitative real-time PCR (QPCR)
The QPCR was performed as previously described [12]. Gene names, accession numbers, forward and reverse primer sequences are listed in Table 1. PCR amplification was conducted on a Chrom 4TM detector (BioRad, USA) in sterile, 96-well PCR plates (Applied Biosystems, Foster City, CA). Every sample was analyzed individually and processed in triplicate. On the basis of the previous study, beta-actin (b-actin) expression levels were not significantly changed in different treated groups, and it was chosen as an internal control to normalize the data [13]. After verifying that the amplification efficiencies of the selected genes and b-actin were approximately equal, differences in expression levels were calculated

2.6. Statistics
All statistical analyses were performed with the SPSS (version 13.0; USA). All values were expressed as mean ± SD and analyzed by SPSS for Win 13.0 software. One-way ANOVA following Tukey’s test was used to determine whether results of treatments were significantly different from the control group (p < 0.05). In addition, principal component analysis (PCA) was used to define the most important parameters, which could be used as key factors for individual
variations using Statistic 6.0.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. เคมีภัณฑ์TBT, 90% ถูกซื้อจากซิก-Aldrich เคมีจำกัด (สหรัฐอเมริกา) พอเหมาะของผสมนี้ตรงน้ำหนักลงเรือปริมาณน้ำตาล และละลายใน 50 ml อะซีโตนน้ำ (1:1) เพื่อจัดระดับความเข้มข้น 1 mg TBT/ml เป็นโซลูชันหุ้น ใน HCl ที่น้อย (1.0 โมล/L) ถูกเพิ่มเข้ามาให้ความมั่นคงของงาน วิธีนี้สินค้าคงคลังถูกปิดสนิท และเก็บไว้ที่ 4 C ในตู้เย็นจนกว่าจะใช้ ทำสารละลายมาตรฐาน (100 lg/มล) ได้ซึ่งทำ โดย diluting โซลูชันหุ้น ด้วยน้ำ deionized ก่อนใช้2.2 การทดสอบสภาพปลาและวัฒนธรรมตัวอ่อนของปลาซิวน้อย (7 วันหลังจากฟัก 9.65 ± 0.13 มม. 1.12 ± 0.17 มิลลิกรัม) ได้รับจากโรงเพาะที่ท้องถิ่น (หวู่ฮั่นประเทศจีน ) ขึ้นในระบบไหลผ่านก๊อกน้ำ dechlorinated(pH 7.2-7.6 ความแข็ง 44.0 – 61.0 mg CaCO3/L) ที่อุณหภูมิคง (25 ± 1 C) กับช่วงแสงของ h 16:8 (แสง: มืด) และมีการเลี้ยงกุ้งใหม่ขีดบรรจุกระป๋อง (Artemia nauplii) สองครั้งทุกวัน ขยะและสารตกค้างออกทุกวันในขณะที่อุปกรณ์การทดสอบ และห้องทำความสะอาดสัปดาห์ละหนึ่งครั้ง2.3 การทดลองออกแบบการตรวจสอบผลกระทบของ sublethal TBT สรีรวิทยา และชีวเคมีพารามิเตอร์ ตัวอ่อน (n = 20) ถูกโอนย้ายไป beakers 50 ml พร้อม aeration อ่อน และสัมผัสกับความเข้มข้นของ TBT หลาย (100, 400 และ 800 ng/L) เป็นระยะเวลา 7 วัน ความเข้มข้นของ TBT 100, 400 และ 800 ng/L ที่ใช้เป็นระดับสิ่งแวดล้อม 10% 96 h-LC50 และ h 96 ของ 20%-LC50 (96 h -LC50 ของ TBT ในตัวอ่อนปลาซิวน้อยจีนถูกวัดเป็น 3.96 lg/L ยกเลิกประกาศ), ตามลำดับ อีก 20 ทดสอบปลาขึ้นน้ำสะอาดสำหรับสัปดาห์ที่ 1 เป็นกลุ่มควบคุม พื้นฐานทางกายภาพและดัชนีทางเคมีของน้ำที่ใช้ในการทดสอบ sublethal ถูกรักษาไว้ตามที่อธิบายไว้สำหรับรอบระยะเวลา acclimation แต่ละกลุ่มมีการทำซ้ำ Beakers ถูกตรวจสอบสองวันการเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมสุขภาพปลาและปลาสัมผัสกับปริมาณต่าง ๆ ของ TBT ได้ถ่ายรูปกับกล้อง และประเมินพฤติกรรมความผิด การเปลี่ยนแปลงรูปแบบพฤติกรรมของปลาที่ผ่านการทดสอบทั้งหมดถูกตรวจสอบตามคู่มือมาตรฐาน ASTM (E1711-95) สำหรับวัดพฤติกรรมในระหว่างการทดสอบความเป็นพิษของปลา ในระหว่างการทดสอบ 80% ของน้ำถูกทุกวันเปลี่ยนแปลง และแทนที่ ด้วยน้ำใหม่ที่ประกอบด้วยความเข้มข้นของ TBT ที่เกี่ยวข้อง เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการรับแสง ตัวอ่อน 6 ในแต่ละกลุ่มมีความ ทันทีแช่แข็ง และเก็บไว้ที่ 80 C จนศึกษาต่อ เป็นตัวอ่อน minnows หายากมีขนาดเล็กเกินไป วิเคราะห์การชีวเคมีและนิพจน์ยีนได้จากสระว่ายน้ำของตัวอ่อนทั้งหมด 2.4. ชีวเคมี assays2.4.1 วิเคราะห์อัตราส่วนอาร์เอ็นเอเอ็นเอแต่ละอย่างถูกถ่วงน้ำหนัก และ homogenized เป็นกลุ่ม (1:10 w/v) ภายในตรี – HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.4) นิวคลีโอไทด์อิสระที่เอาชุดของ washes ด้วย perchloric เย็นกรด (HClO4) อาร์เอ็นเอแล้วถูก hydrolyzed กับโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ และด้วยการถูก acidified กับ HClO4 เย็นการเอาอาร์เอ็นเอจากดีเอ็นเอและโปรตีน อัตราส่วนกล้ามเนื้อ/ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอถูกวัดโดยใช้วิธีตาม Kuropat et al. [10] แก้ไขโดยอัลเลน Mercaldo et al. [11]2.4.2. Na + -K + -ATPase วิเคราะห์แช่ตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ของ Na + -K + -ATPase กิจกรรม defrosted และ homogenized เป็นกลุ่มบนน้ำแข็งกับน้ำเกลือเย็น 0.86% physiological ลจำนวน 10 Homogenate ถูก centrifuged ที่ 3000 รอบต่อนาทีที่ 4 C ใน 10 นาทีรับ supernatant สำหรับเอนไซม์ assays กิจกรรมของ Na + -K + -ATPase ซึ่งถูกวัดโดยใช้การค้าชนิดติดตั้งอิสระ (สถาบัน Bioengineering Jiancheng จิง นานกิง จีน) ตามคู่มือ การ Na + -K + -ATPase กิจกรรม แสดงเป็น lmol ปี่ liberated/มิลลิกรัม โปรตีน/h ในปลา2.5 การแสดงออกของยีน2.5.1 เตรียมสกัดและ cDNA อาร์เอ็นเอตัวอ่อนจะถูกล้าง ด้วย PBS (pH 7.4) สองครั้ง และอาร์เอ็นเอทั้งหมดของตัวอ่อน homogenized เป็นกลุ่ม 10 ถูกสกัดโดยใช้ Trizol รีเอเจนต์ (Invitrogen คาร์ลส CA, USA) ของผู้ผลิตต่อไปนี้คำแนะนำ แต่ละชุดของตัวอ่อน 10 ถูกทางถูกพูสำหรับเตรียมอาร์เอ็นเอ การเอาออกของ genomic DNA ปน อาร์เอ็นเอถูกต้อง โดยปราศจาก RNase DNase ฉัน (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา)และบริสุทธิ์แล้ว อาร์เอ็นเอทั้งหมดกู้คืนจากการ DNase ผมย่อยอาหารกระบวนการที่วัดได้ 260 และ 280 nm โดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่าง (M2 อุปกรณ์โมเลกุล Sunnyvale, CA, USA) 260 nmอ่านถูกใช้ในการประเมินความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอทั้งหมด อาร์เอ็นเอมีคุณภาพในแต่ละตัวอย่างถูกตรวจสอบ โดยวัดอัตรา 260/280 nm และ electrophoresis เจลฟอร์มาลดีไฮด์ 1% agaroseด้วย ethidium โบรไมด์ย้อมสี มีสังเคราะห์ cDNA ใช้ lg 2 ของอาร์เอ็นเอจากตัวอย่างแต่ละผสมกับ 500 ng สุ่มพื้น (Takara เกียวโต ญี่ปุ่น) ซึ่งถูกเพิ่ม 10 มม.ของ dNTPsdiethylpyrocarbonate-(DEPC-) รักษาน้ำให้มีปริมาตรสุดท้ายของ 20 จะ ปฏิกิริยาเริ่มใช้ M MLV กลับ Transcriptase (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา) ต่อโปรโตคอลของบริษัทผู้ผลิต2.5.2 การเชิงปริมาณแบบ real-time PCR (QPCR)มีดำเนินการ QPCR การอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [12] ยีนชื่อ ทะเบียนเลข ไปข้างหน้า และย้อนกลับลำดับแสดงไว้ในตารางที่ 1 รองพื้น วิธีการ Chrom 4TM จับ (BioRad สหรัฐอเมริกา) ในกระบอก 96-ดี PCR แผ่น (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ขยาย PCR ทุกอย่างถูกแยกวิเคราะห์ และประมวลผลใน triplicate โดยการศึกษาก่อนหน้านี้ ระดับนิพจน์เบต้าแอกติน (บีแอกติน) มีไม่มากการเปลี่ยนแปลงในกลุ่มบำบัด และจะถูกเลือกเป็นตัวควบคุมภายในเพื่อลดขนาดข้อมูล [13] หลังจากตรวจสอบว่า ประสิทธิภาพการขยายยีนเลือกและแอกติน b ได้เท่ากันโดยประมาณ มีคำนวณความแตกต่างในระดับของนิพจน์2.6. สถิติสถิติวิเคราะห์ทั้งหมดได้ดำเนินการกับโปรแกรม (เวอร์ชัน 13.0 สหรัฐอเมริกา) ค่าทั้งหมดถูกแสดงหมายถึง ± SD และวิเคราะห์ โดยโปรแกรมซอฟต์แวร์ชนะ 13.0 วิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวต่อการทดสอบของ Tukey ถูกใช้เพื่อกำหนดว่า ผลลัพธ์ของการรักษาได้อย่างมีนัยสำคัญแตกต่างจากกลุ่มควบคุม (p < 0.05) นอกจากนี้ วิเคราะห์ส่วนประกอบหลัก (PCA) ถูกใช้เพื่อกำหนดพารามิเตอร์สำคัญ ซึ่งสามารถใช้เป็นปัจจัยสำคัญสำหรับแต่ละบุคคลความแตกต่างโดยใช้สถิติ 6.0

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมี
TBT 90% ได้รับการสั่งซื้อจาก บริษัท Sigma-Aldrich เคมี จำกัด (USA) ปริมาณที่เหมาะสมของสารนี้ได้รับการชั่งน้ำหนักโดยตรงในเรือปริมาณน้ำตาลและเลือนหายไปใน 50 มลอะซิโตนน้ำ (1: 1) กับระดับความเข้มข้น 1 มิลลิกรัม TBT / ml เป็นโซลูชั่นหุ้นซึ่งน้อย HCl (1.0 mol / ลิตร) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้มั่นใจเสถียรภาพของ วิธีการแก้ปัญหาสต็อกนี้ถูกปิดผนึกและเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสในตู้เย็นจนกว่าจะใช้ การทำงานแก้ปัญหามาตรฐาน (100 LG / ml) ได้ถูกจัดทำสดใหม่โดยผสมสารละลายด้วยน้ำกลั่นปราศจากไอออนก่อนการใช้งาน. 2.2 ปลาทดสอบและเงื่อนไขในการเพาะเลี้ยงตัวอ่อนสร้อยหายาก (7 วันหลังจากฟักไข่, 9.65 ± 0.13 มม 1.12 ± 0.17 มก.) ที่ได้รับจากโรงเพาะฟักท้องถิ่น (หวู่ฮั่น, จีน) ถูกเลี้ยงดูมาในระบบไหลผ่านด้วยน้ำประปา dechlorinated (pH 7.2-7.6; แข็ง 44.0-61.0 mg CaCO3 / ลิตร) ที่อุณหภูมิคงที่ (25 ± 1 C) ที่มีแสง 16: 8 ชั่วโมง (แสง: เข้ม) และได้รับการเลี้ยงด้วยไรน้ำเค็มที่เพิ่งฟัก (อาร์ทีเมีย) สองครั้งต่อวัน ของเสียและสารตกค้างที่ถูกถอดออกทุกวันในขณะที่การทดสอบอุปกรณ์และห้องผู้พิพากษาได้รับการทำความสะอาดสัปดาห์ละครั้ง. 2.3 การออกแบบการทดลองเพื่อศึกษาผลกระทบของการ sublethal TBT พารามิเตอร์ทางสรีรวิทยาและชีวเคมีตัวอ่อน (n = 20) ถูกย้ายไป 50 มลบีกเกอร์พร้อมกับอากาศที่รุนแรงและสัมผัสกับความเข้มข้น TBT หลายคน (100, 400 และ 800 นาโนกรัม / ลิตร) สำหรับรอบระยะเวลา 7 วัน ความเข้มข้น TBT 100, 400 และ 800 ng / L ถูกใช้เป็นระดับสิ่งแวดล้อม 10% 96 h-LC50 และ 20% 96 h-LC50 (96 H- LC50 ของ TBT ตัวอ่อนสร้อยหายากจีนวัดเป็น 3.96 LG / ลิตร , ที่ไม่ได้เผยแพร่) ตามลำดับ อีกปลาทดสอบ 20 ถูกยกขึ้นในน้ำสะอาด 1 สัปดาห์เป็นกลุ่มควบคุม พื้นฐานทางกายภาพดัชนีและทางเคมีของน้ำที่ใช้ในการทดสอบ sublethal ถูกเก็บรักษาตามที่อธิบายไว้สำหรับการปรับสภาพ แต่ละกลุ่มจะได้รับการซ้ำ บีกเกอร์ได้รับการตรวจสอบวันละสองครั้ง. การเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมของปลาที่มีสุขภาพดีและปลาสัมผัสกับปริมาณต่าง ๆ ของ TBT ถูกถ่ายภาพด้วยกล้องและประเมินผลความผิดปกติทางพฤติกรรม การเปลี่ยนแปลงรูปแบบพฤติกรรมของปลาที่ผ่านการทดสอบทั้งหมดถูกตรวจสอบตามมาตรฐาน ASTM (E1711-95) คู่มือมาตรฐานสำหรับการวัดพฤติกรรมในระหว่างการทดสอบเป็นพิษต่อปลา ในระหว่างการทดสอบ 80% ของน้ำมีการเปลี่ยนแปลงในชีวิตประจำวันและถูกแทนที่ด้วยน้ำใหม่ที่มีความเข้มข้นที่สอดคล้องกันของ TBT ในตอนท้ายของเวลาการเปิดรับ 6 ตัวอ่อนในแต่ละกลุ่มตัวอย่างถูกแช่แข็งทันทีและเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียสจนการศึกษาต่อไป ในฐานะที่เป็นตัวอ่อนของปลาที่หายากมีขนาดเล็กเกินไปทั้งหมดการวิเคราะห์ทางชีวเคมีและการแสดงออกของยีนที่มาจากสระว่ายน้ำของตัวอ่อนทั้งหมด. 2.4 การตรวจทางชีวเคมี2.4.1 อาร์เอ็นเอ / ทดสอบอัตราส่วนดีเอ็นเอตัวอย่างแต่ละคนได้ถ่วงน้ำหนักและหดหาย (01:10 w / v) ภายในบัฟเฟอร์ Tris-HCl (pH 7.4) นิวคลีโอฟรีถูกถอดออกโดยใช้ชุดล้างด้วยกรดเปอร์คลอริกเย็น (HClO4) RNA ถูกไฮโดรไลซ์แล้วด้วยไฮดรอกไซโพแทสเซียมและไฮโดรไลถูกกรดกับ HClO4 เย็นเพื่อเอา ​​RNA จาก DNA และโปรตีน กล้ามเนื้อ RNA / อัตราส่วนดีเอ็นเอถูกวัดโดยใช้วิธีการตาม Kuropat และคณะ [10] ในขณะที่การแก้ไขโดย Mercaldo-อัลเลนและคณะ [11]. 2.4.2 นา + -K + -ATPase ทดสอบตัวอย่างแช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์ของนา + -K + -ATPase กิจกรรมถูกละลายและหดหายบนน้ำแข็งที่มี 10 เล่มเย็น 0.86% น้ำเกลือทางสรีรวิทยา homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อให้ได้สารละลายสำหรับการตรวจเอนไซม์ของนา + -K + -ATPase ซึ่งได้รับการวัดโดยใช้ชุดการค้า (จิงเฉิวิศวกรรมชีวภาพสถาบันหนานจิง, จีน) ตาม คู่มือ นา + -K + -ATPase กิจกรรมแสดงเป็น lmol Pi เสรี / มิลลิกรัมโปรตีน / ชั่วโมงในปลา. 2.5 การแสดงออกของยีน2.5.1 การสกัดอาร์เอ็นเอและการเตรียม cDNA ตัวอ่อนถูกล้างครั้งที่สองกับพีบีเอส (pH 7.4) และอาร์เอ็นเอทั้งหมด 10 ตัวอ่อนหดหายถูกสกัดโดยใช้ Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ต่อไปนี้ของผู้ผลิตคำแนะนำ ชุดของ 10 ตัวอ่อนแต่ละคนได้รวบรวมการจัดทำอาร์เอ็นเอ ในการลบความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนดีเอ็นเออาร์เอ็นเอที่ถูกย่อยโดย DNase RNase ฟรีฉัน (Promega Madison, WI, USA) และจากนั้นบริสุทธิ์ อาร์เอ็นเอทั้งหมดหายไปจากกระบวนการย่อยอาหาร DNase ฉันวัดที่ 260 และ 280 นาโนเมตรโดยใช้สเปก (M2, อุปกรณ์โมเลกุลซันนีเวล, CA, USA) นาโนเมตร 260 อ่านถูกใช้ในการประเมินความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอทั้งหมด อาร์เอ็นเอที่มีคุณภาพในแต่ละตัวอย่างถูกตรวจสอบโดยการวัดอัตราส่วน 260/280 นาโนเมตรและ 1% agarose gel electrophoresis เมื่อฟอร์มาลดีไฮด์ด้วย ethidium bromide การย้อมสี cDNA ถูกสังเคราะห์โดยใช้ LG 2 ของอาร์เอ็นเอจากแต่ละตัวอย่างผสมกับ 500 ng ของไพรเมอร์แบบสุ่ม (Takara, เกียวโต, ญี่ปุ่น) ที่ถูกเพิ่มเข้ามา 10 มมของ dNTPs diethylpyrocarbonate- (DEPC-) ได้รับการรักษาน้ำปริมาณสุดท้ายของ 20 LL ปฏิกิริยาที่ริเริ่มใช้ M-MLV transcriptase ปลายทาง (Promega เมดิสันวิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) ดังต่อไปนี้โปรโตคอลของผู้ผลิต. 2.5.2 เชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qPCR) qPCR ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [12] ชื่อยีนหมายเลขภาคยานุวัติไปข้างหน้าและย้อนกลับลำดับไพรเมอร์มีการระบุไว้ในตารางที่ 1 ขยาย PCR ได้ดำเนินการในการตรวจจับ 4TM Chrom (BioRad สหรัฐอเมริกา) ในการฆ่าเชื้อ, 96 หลุมแผ่น PCR (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี้, แคลิฟอร์เนีย) ตัวอย่างทุกคนได้รับการวิเคราะห์เป็นรายบุคคลและประมวลผลในเพิ่มขึ้นสามเท่า บนพื้นฐานของการศึกษาก่อนหน้านี้เบต้าโปรตีน (B-โปรตีน) ระดับการแสดงออกที่ไม่ได้มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มได้รับการปฏิบัติที่แตกต่างกันและมันก็ถูกเลือกให้เป็นระบบการควบคุมภายในที่จะปรับข้อมูล [13] หลังจากตรวจสอบแล้วว่ามีประสิทธิภาพการขยายของยีนที่เลือกและ B-โปรตีนเท่ากับประมาณความแตกต่างในระดับการแสดงออกจะถูกคำนวณ2.6 สถิติทั้งหมดวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการด้วยโปรแกรม SPSS (รุ่น 13.0; USA) ค่าทั้งหมดถูกแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD และวิเคราะห์โดยโปรแกรม SPSS for Win 13.0 ซอฟแวร์ One-way ANOVA ต่อไปนี้การทดสอบของ Tukey ถูกใช้ในการตรวจสอบว่าผลของการรักษาที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจากกลุ่มควบคุม (p <0.05) นอกจากนี้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ถูกนำมาใช้ในการกำหนดค่าพารามิเตอร์ที่สำคัญที่สุดซึ่งสามารถนำมาใช้เป็นปัจจัยที่สำคัญสำหรับแต่ละรูปแบบโดยใช้สถิติ 6.0

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สารเคมี
8 , 90 % ซื้อจากซิกม่า – อัลดริชเคมี . ( USA ) ปริมาณที่เหมาะสมของสารประกอบนี้โดยตรงลงในเรือและน้ำหนัก 50 มิลลิลิตร ปริมาณน้ำตาลที่ละลายในอะซิโตน - น้ำ ( 1 : 1 ) รูปแบบระดับความเข้มข้น 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรขณะที่หุ้น 8 โซลูชั่นซึ่งในกรดไฮโดรคลอริกน้อย ( 1.0 mol / L ) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้มั่นใจเสถียรภาพของหุ้นนี้เป็นโซลูชั่นที่ปิดผนึกและเก็บไว้ที่ 4  C ในตู้เย็นจนใช้ ทํางานโซลูชั่นมาตรฐาน ( 100 ) / ml ) คือสดใหม่ ปรุงโดยผสมหุ้นโซลูชั่นคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำก่อนที่จะใช้ .

. . ปลาทดสอบและสภาพวัฒนธรรม
ตัวอ่อนสร้อยหายาก ( 7 วัน หลังจากฟัก± 9.65 มม. , 0.13 , 1.12 ± 0.17 มิลลิกรัม ) ที่ได้จากโรงเพาะฟักท้องถิ่น ( ประเทศจีน )ถูกเลี้ยงในระบบ flow-through กับ dechlorinated น้ำประปา
( pH 7.2 - 7.6 ; ความแข็ง 44.0 61.0 mg / l ( CaCO3 ) ที่อุณหภูมิคงที่ ( 25 ± 1  C ) ที่มีต่อ 16 : 8 H ( สว่าง : มืด ) และถูกเลี้ยงด้วยฟักใหม่กุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่ง ( อาร์ทีเมีย nauplii ) 2 ครั้ง ทุกวัน . ของเสียและสารตกค้างออกทุกวัน ในขณะที่การทดสอบอุปกรณ์และห้องสะอาดสัปดาห์ละครั้ง

2.3
การออกแบบการทดลองเพื่อศึกษาผลของ TBT การพารามิเตอร์ทางสรีรวิทยาและชีวเคมี ตัวอ่อน ( n = 20 ) โอน 50 ml ถ้วยพร้อมกับอากาศที่ไม่รุนแรงและสัมผัสกับความเข้มข้น 8 หลาย ( 100 , 400 และ 800 กรัม / ลิตร ) เป็นเวลา 7 วัน 8 ความเข้มข้น 100 , 400 และ 800 กรัม / ลิตรใช้เป็นระดับสิ่งแวดล้อม , 10% และ 20% h-lc50 96 h-lc50 96 ( 96 H -
) ของ TBT ในจีนหายาก วัดสร้อยตัวอ่อนเป็น 3.96 LG / L , พิมพ์ ) ตามลำดับ อีก 20 ทดสอบปลาถูกเลี้ยงในน้ำสะอาด 1 สัปดาห์ ในขณะที่กลุ่มควบคุม พื้นฐานทางกายภาพและทางเคมีของน้ำ
ดัชนีที่ใช้ในการทดสอบพิษถูกเก็บรักษาไว้ตามที่อธิบายไว้ในช่วงเวลา acclimation . แต่ละกลุ่มมีซ้ำกัน ในบีกเกอร์ได้ตรวจสอบสองวัน .
การเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมของปลามีสุขภาพดี และปลาสัมผัสกับปริมาณต่างๆของ TBT ได้ถ่ายภาพด้วยกล้องและประเมินความผิดปกติทางพฤติกรรม รูปแบบการเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมของปลาถูกทดสอบตามมาตรฐาน ASTM ( e1711-95 ) มาตรฐานที่แนะนำสำหรับการวัดพฤติกรรมในการทดสอบความเป็นพิษของปลา ระหว่างสอบ80% ของน้ำทุกวัน เปลี่ยนและแทนที่ด้วยใหม่น้ำที่มีความเข้มข้นที่สอดคล้องกันของ TBT . ในตอนท้ายของเวลาในแต่ละกลุ่ม จำนวน 6 ตัวอ่อนแช่แข็งและเก็บไว้ที่  ทันที 80  C จนกระทั่งการศึกษาต่อไป หายากปลาตัวเล็กๆ ตัวอ่อนมีขนาดเล็กเกินไป , การวิเคราะห์ทางชีวเคมีและการแสดงออกของยีน
จากสระทั้งตัวอ่อน

2.4 . ชีวเคมี )
เครื่องมือกำจัดเพื่อย้าย .อาร์เอ็นเอดีเอ็นเอ (
/ อัตราส่วนแต่ละตัวอย่างถ่วงน้ำหนักและบด ( 1 : 10 W / V ) ภายในบริษัท และ HCl บัฟเฟอร์ pH 7.4 ) เบสฟรีถูกถอดออกใช้ชุดล้างด้วยกรด perchloric เย็น ( hclo4 ) RNA เป็นไฮโดรไลซ์ด้วยโซดาไฟ โพแทสเซียมและไฮโดรไลเซทคือปรับเย็น hclo4 เอา RNA จากดีเอ็นเอและโปรตีน อัตราส่วนประสิทธิภาพ / ดีเอ็นเอกล้ามเนื้อถูกวัดโดยใช้วิธี
ตาม kuropat et al . [ 10 ] แก้ไขโดย mercaldo Allen et al . [ 11 ] .

2.4.2 . นา - เค - ATPase assay
แช่แข็งตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ na - กิจกรรม ? K - ละลายน้ำแข็งบดและใน 10 เล่ม เย็น 0.86 % สรีรวิทยา น้ำเกลือ โดยแยกเป็นระดับที่ 3 , 000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 4  C เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อให้ได้นำเพื่อกิจกรรมตรวจเอนไซม์ ATPase ของ na - เค - ,ซึ่งวัดได้โดยใช้ชุดพาณิชย์ ( จิง jiancheng ชีววิศวกรรมสถาบัน Nanjing , China ) ตามคู่มือ นา - K ATPase กิจกรรม แสดงเป็น lmol ไพอิสระ / mg protein / H ในปลา

2.5 การแสดงออกของยีน
ดาวน์โหลด . สกัด RNA และการเตรียม cDNA ตัวอ่อนที่ถูกล้าง
สองครั้งกับ PBS ( pH 74 ) และอาร์เอ็นเอทั้งหมด 10 โฮโมตัวอ่อนถูกสกัดโดยใช้ trizol Reagent ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA ) ตามคำแนะนำของ
ผู้ผลิต แต่ละชุดของ 10 และมีรวมเพื่อเตรียม RNA เพื่อขจัดความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนดีเอ็นเอ , อาร์เอ็นเอถูกย่อยโดยตรวจหา ADNase เลสฟรี ( promega Madison , WI , USA )
และบริสุทธิ์ยีนทั้งหมดหายจากกระบวนการย่อยตรวจหา ADNase ผมวัดที่ 260 และ 280 nm โดยใช้ Spectrophotometer ( M2 โมเลกุล , อุปกรณ์ , Sunnyvale , CA , USA ) ที่ 260 nm
อ่านถูกใช้ในการประเมินความเข้มข้นของ RNA ทั้งหมด ยีนที่มีคุณภาพในแต่ละตัวอย่างถูกยืนยันโดยการวัด 260 / 280 nm อัตราส่วนและร้อยละ 1 หรือ ฟอร์มาลดีไฮด์เจล
กับคู่ bromide stainingวิธีสังเคราะห์โดยใช้ 2 LG ของ RNA จากแต่ละตัวอย่างผสมกับ 500 นาโนแบบไพรเมอร์ ( Takara , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) ที่ถูกเพิ่มเข้ามา 10 มม. dntps
diethylpyrocarbonate - ( depc - ) น้ำจะเป็นเล่มสุดท้ายของ 20 จะ ปฏิกิริยาที่ถูกริเริ่มใช้ m-mlv reverse transcriptase ( promega เมดิสัน , WI , USA ) ต่อไปนี้ของผู้ผลิตโปรโตคอล .

งานวาง . เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์ ( qpcr )
ที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ qpcr [ 12 ] ยีน ชื่อ หมายเลขภาคยานุวัติ ไปข้างหน้าและย้อนกลับลำดับอยู่ในรองพื้นโต๊ะ 1 โดยมีวัตถุประสงค์ในการเพิ่มช 4tm ตรวจจับ ( biorad , USA ) เป็นหมัน , 96 ด้วย PCR แผ่น ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย ) ทุกตัวอย่าง วิเคราะห์เป็นรายบุคคล และประมวลผลทั้งสามใบ บนพื้นฐานของการศึกษาก่อนหน้านี้เบต้าแอคติน ( b-actin ) ระดับการแสดงออกไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในการเปลี่ยนแปลงกลุ่ม และถูกเลือกเป็นระบบควบคุมภายในเพื่อหาข้อมูล [ 13 ] หลังจากตรวจสอบแล้วว่าโดยการเพิ่มประสิทธิภาพของการเลือกยีนและ b-actin ประมาณเท่ากัน ความแตกต่างของระดับการแสดงออกได้

2.6
สถิติสถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์มีการปฏิบัติด้วย SPSS ( รุ่น 3.2 ; สหรัฐอเมริกา ) ค่าทั้งหมดที่ถูกแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD และวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้โปรแกรมสำเร็จรูป SPSS for ชนะทั้งซอฟต์แวร์ การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวตามทดสอบทดสอบใช้เพื่อตรวจสอบว่าผลของการรักษาแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติจากกลุ่มควบคุม ( p < 0.05 ) นอกจากนี้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก ( PCA ) ถูกใช้เพื่อกำหนดพารามิเตอร์ที่สำคัญที่สุดซึ่งสามารถใช้เป็นปัจจัยที่สำคัญสำหรับการเปลี่ยนแปลงส่วนบุคคล
โดยใช้สถิติจาก