Twenty-four hours after microdialys

Twenty-four hours after microdialysis the animals were kept under anesthesia (Ketanest-S/Dormitor 3:1, v/v) and intracardially perfused with 300 ml 4% paraformaldehyde. After decapitation the microdialysis probe was removed and the brain was extracted and post-fixed in paraformaldehyde overnight. The brain was then subbed in a 20% sucrose solution for 2 days and frozen at −80 °C. The brains were cut on a cryostat into 20 μm coronal sections and collected in NaPi. At least 10 sections containing the lesion track of the microdialysis probe were carefully mounted onto polylysine-precoated slides and air-dried. A subset of the slides was then labeled with Nissl staining. The remaining slides were alternately labeled with immunofluorescent markers to illustrate the ischemic brain area. Therefore, DAPI (Boehringer, Germany) was combined with histochemistry either for OX-42 (purified mouse anti-rat monoclonal antibody 1:800, Pharmingen, San Diego), GFAP (rabbit polyclonal antibody 1:500, Progen, Heidelberg), or MAP-2 (SMI 52 monoclonal mouse antibody 1:5000, Sternberger Monoclonals, MD, USA) according to standard staining procedure. Secondary antibodies were GFAP: Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG, MAP-2 and OX-42: Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (1:500, Molecular Probes, Eugene). After that half of the double-labeled sections were additionally stained with Fluoro-Jade C (FJ-C) as described by Schmued et al. [19]. The slides were then dried, cleared, and coverslipped with Immu-Mount (Thermo Shandon, Pittsburgh). The fluorescent labels were visualized by standard fluorescent microscopy (Axiophot, Zeiss) and digitalized.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจาก microdialysis สัตว์ที่ถูกเก็บไว้ภายใต้ยาชา (3 S/Ketanest-Dormitor: v 1, v) และ intracardially perfused กับ paraformaldehyde 4% 300 ml หลังจาก decapitation microdialysis โพรบถูกเอาออก และสมองถูกสกัด และหลังถาวรใน paraformaldehyde ค้างคืน สมองมี subbed ในโซลูชันซูโครส 20% 2 วัน แล้วหยุด −80 องศาเซลเซียส สมองถูกตัดใน cryostat ที่เป็น μm 20 ส่วน coronal และรวบรวมใน NaPi ส่วนน้อย 10 ประกอบด้วยติดตามรอยโรคของโพรบ microdialysis ถูกติดตั้งลงในภาพนิ่ง polylysine precoated อย่างระมัดระวัง และ air-dried ชุดย่อยของภาพนิ่งที่ป้ายแล้ว มี Nissl ย้อมสี ภาพนิ่งที่เหลือถูกสลับชื่อพร้อมเครื่องหมาย immunofluorescent เพื่อแสดงพื้นที่สมองสำรอก ดังนั้น DAPI (Boehringer เยอรมนี) ถูกรวมเข้ากับ histochemistry เพื่อวัว-42 (บริสุทธิ์เมาส์หนูป้องกัน monoclonal แอนติบอดี 1:800, Pharmingen, San Diego), GFAP (กระต่ายแอนติบอดี polyclonal 1: 500 ไฮเดลเบิร์ก Progen), หรือแผนที่-2 (SMI 52 เมาส์โมโนแอนติบอดี 1:5000, Sternberger Monoclonals, MD สหรัฐอเมริกา) ตามมาตรฐานขั้นตอนการย้อมสี แอนตี้รองได้ GFAP: Alexa Fluor 546 แพะกระต่ายป้องกัน IgG แผนที่ 2 และวัว-42: Alexa Fluor 546 เมาส์ป้องกันแพะ IgG (1: 500, Probes โมเลกุล Eugene) หลังจากนั้น ครึ่งส่วนป้ายคู่ได้นอกจากนี้สีกับเจด Fluoro C (FJ C) ตามที่อธิบายไว้โดย Schmued et al. [19] ภาพนิ่งที่ถูกอบแห้ง ลบ และ coverslipped กับ Immu-เมาท์ (แชนดอนเทอร์โม พิตส์เบิร์ก) ป้ายเรืองแสงมี visualized โดยมาตรฐานฟลูออเรส microscopy (Axiophot, Zeiss) และดิจิทัล

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจาก microdialysis สัตว์ที่ถูกเก็บไว้ภายใต้การระงับความรู้สึก (Ketanest-S / Dormitor 3: 1, v / v) และ perfused intracardially 300 มล. 4% paraformaldehyde หลังจากศีรษะสอบสวน microdialysis จะถูกลบออกและสมองถูกสกัดและหลังการแก้ไขใน paraformaldehyde ในชั่วข้ามคืน สมองถูก subbed แล้ว 20% วิธีการแก้ปัญหาน้ำตาลซูโครสเป็นเวลา 2 วันและแช่แข็งที่ -80 องศาเซลเซียส สมองถูกตัดใน cryostat เป็น 20 ไมครอนส่วนเวียนและรวบรวมไว้ใน Napi อย่างน้อย 10 ส่วนที่มีการติดตามแผลของการสอบสวน microdialysis ถูกติดตั้งอย่างรอบคอบบนสไลด์ polylysine-Precoated และอากาศแห้ง เซตของภาพนิ่งถูกตราหน้าว่าแล้วกับการย้อมสี Nissl ภาพนิ่งที่เหลือมีป้ายสลับกับเครื่องหมาย immunofluorescent เพื่อแสดงให้เห็นพื้นที่สมองขาดเลือด ดังนั้น DAPI (Boehringer, เยอรมนี) ได้ร่วมกับ histochemistry ทั้ง OX-42 (เมาส์บริสุทธิ์ต่อต้านหนูแอนติบอดีที่ 1: 800, PharMingen, ซานดิเอโก) GFAP (กระต่ายแอนติบอดีโพลี 1: 500, Progen ไฮเดลเบิร์ก) หรือ MAP-2 (SMI โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ 52 เมาส์ที่ 1: 5000 Sternberger Monoclonals, MD, USA) เป็นไปตามขั้นตอนการย้อมสีมาตรฐาน แอนติบอดีรองคือ GFAP: Alexa Fluor 546 แพะ IgG ต่อต้านกระต่าย MAP-2 และ OX-42: Alexa Fluor 546 แพะต่อต้านเมาส์ IgG (1: 500 Probes โมเลกุลยูจีน) หลังจากที่ครึ่งหนึ่งของส่วนที่สองที่มีข้อความว่านอกจากนี้ยังมีการย้อมด้วย Fluoro-หยก C (FJ-C) ตามที่อธิบาย Schmued et al, [19] สไลด์แห้งแล้วล้างและ coverslipped กับ Immu ติด (เทอร์โมชานตง, พิตต์) ป้ายเรืองแสงมองเห็นได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงมาตรฐาน (Axiophot, Zeiss) และดิจิตอล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจาก microdialysis สัตว์ที่ถูกเก็บไว้ภายใต้ยาชา ( ketanest-s / dormitor 3 : 1 v / v ) และ intracardially หนู 300 ml 4% พาราฟอร์มาลดิไฮด์ . หลังจากตัดการ microdialysis โพรบจะถูกลบออกและสมองถูกสกัดและโพสต์คงที่ในพาราฟอร์มาลดิไฮด์ในชั่วข้ามคืน สมองก็ซับในสารละลายซูโครส 20% เป็นเวลา 2 วันและแช่แข็งที่− 80 องศาสมองที่ถูกตัดใน Cryostat เป็น 20 μ M มีส่วน และเก็บใน napi . อย่างน้อย 10 ส่วนที่มีรอยโรคที่ติดตามของ microdialysis สอบสวนถูกติดลงบนแผ่นสไลด์ polylysine อย่างระมัดระวังและอากาศแห้ง เป็นเซตย่อยของภาพนิ่งจากนั้นป้ายด้วย blue แสดง stainingภาพนิ่งที่เหลือมีสลับชื่อกับ immunofluorescent เครื่องหมายแสดงบริเวณสมองขาดเลือด ดังนั้น dapi ( Boehringer เยอรมนี ) ถูกรวมกับ histochemistry ทั้ง ox-42 ( เมาส์หนูด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน 1:800 pharmingen , San Diego ) gfap ( กระต่ายใช้เหล็โปรเจนแอนติบอดี , ไฮเดลเบิร์ก ) หรือ map-2 โมโนโคลนอลแอนติบอดี 1:5000 ( SMI 52 เมาส์ ,sternberger monoclonals , MD , USA ) ตามมาตรฐาน 4 ขั้นตอน แอนติบอดี IgG anti รองเป็น gfap : กระต่าย Alexa Fluor 546 แพะและ map-2 ox-42 : Alexa Fluor 546 แพะ IgG anti เมาส์ ( 1 : 500 โมเลกุลโพรบ ยูจีน ) หลังจากที่ครึ่งหนึ่งของคู่ข้อความบางส่วนถูกย้อมด้วยหยกและฟลูออโรซี ( fj-c ) ตามที่อธิบายไว้โดย schmued et al . [ 19 ] สไลด์แล้วแห้งล้างและ coverslipped กับ immu ภูเขา ( เทอร์โมซ่าน , พิตส์เบิร์ก ) ป้ายเรืองแสงถูกตรวจโดยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ ( axiophot ไซซ์มาตรฐาน , และ จบ .