2.10 SDS-page and Western blotsTota

2.10 SDS-page and Western blots
Total protein extracts (see Section 2.5) were thawed and 50 μL sample was transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube with 50 μL denaturing sample buffer containing 125 mM Tris HCl buffer pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 4% (w/v) SDS and 0.0025% (w/v) Bromophenol Blue. The solution was heated at 65 °C for 5 min and subsequently cooled to room temperature. All proceeding steps were carried out at room temperature. Samples corresponding to 0.75 μg total protein were loaded into a Novex 10–20% Tris-Glycine Gel. Gel electrophoresis was carried out in a XCell SureLock Mini-Cell System, following the manufacturer's instructions and employing a Tris-Glycine SDS Running Buffer containing 25 mM Tris Base pH 8.3, 192 mM Glycine and 0.1% (w/v) SDS. After migration, proteins were transferred to Invitrolon PVDF Membranes in a XCell II Blot Module, following manufacturer's instructions with a transfer buffer containing 12 mM Tris pH 8.3, 96 mM glycine and 20% (v/v) methanol. Membranes were blocked overnight at 4 °C in TBS buffer with 5% (w/v) non-fat dry milk. Antibodies recognizing the D1 protein of PSII (Agrisera, #AS0584) and the beta subunit of ATP synthase, which recognized both the mitochondrial and chloroplastic forms (ATPB, Agrisera, #AS0585), were diluted 1:10,000 and 1:50,000, respectfully, in TBS with 0.5% non-fat dry milk. The membranes were challenged for 1 h. Membranes were washed three times for 5 min in TBS with 0.5% non-fat dry milk at room temperature. Membranes were then challenged with secondary antibody (horseradish peroxidase conjugated donkey anti-rabbit, Pierce, #31,458), diluted 1:50,000 in TBS with 0.5% non-dry fat milk for 1 h. Cross-reacting bands were visualized with SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (ThermoScientific), following the manufacturer's instructions. Relative band image intensities were quantified with ImageJ software, version 1.48 (http://imageJ.nih.gov/ij/). D1 protein abundance was calculated after normalization to ATPB content and relative to 2nd Dawn.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.10 จัดหน้า SDS และตะวันตกสารสกัดจากโปรตีนทั้งหมด (ดูส่วน 2.5) ถูกเตรียม และ 50 μL อย่างถูกถ่ายโอนไป 1.5 mL หลอด Eppendorf μL denaturing บัฟเฟอร์ตัวอย่างที่ประกอบด้วย 125 มม.ทริสเรทติ้ง HCl บัฟเฟอร์ pH 6.8 กลีเซอรอล 20% (v/v) 4% (w/v) SDS และ 0.0025% (w/v) Bromophenol Blue 50 การแก้ปัญหาความร้อนที่อุณหภูมิ 65 ° C 5 นาที และต่อมาเย็นที่อุณหภูมิห้อง ขั้นตอนการดำเนินการทั้งหมดได้ดำเนินการที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างที่สอดคล้องกับ 0.75 μโปรตีนทั้งหมดถูกโหลดเป็นเจลทริสเรทติ้ง Glycine 10 – 20% Novex อิเจได้ดำเนินการใน XCell SureLock มินิเซลล์ระบบ ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และใช้ทริสเรทติ้ง Glycine SDS ใช้บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยทริสเรทติ้งด่าง 8.3, Glycine 192 มม. 25 มม.และ 0.1% (w/v) SDS หลังจากโยกย้าย โปรตีนถูกโอนย้ายไปเยื่อ PVDF Invitrolon ในโมดูซับ XCell II คำแนะนำของผู้ผลิตต่อ ด้วยการถ่ายโอนกันชน 12 มม.ที่มีทริสเรทติ้ง pH 8.3, glycine 96 มม.และเมทานอล 20% (v/v) เยื่อหุ้มได้ถูกบล็อกชั่วข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 ° C ในบัฟเฟอร์ TBS กับนมแห้งปลอดไขมัน 5% (w/v) แอนติบอดีที่ตระหนักถึงโปรตีน D1 ของ PSII (Agrisera, #AS0584) และย่อยเบต้าของ ATP synthase ซึ่งยอมรับได้ทั้งแบบ chloroplastic และยลฟอร์ม (ATPB, Agrisera, #AS0585), 1:10,000 เจือจางและ 1:50, 000 กราบ ใน TBS ด้วยไม่ใช่ 0.5% ไขมันแห้งนม เยื่อที่ท้าทายสำหรับเยื่อ 1 h. ถูกล้าง 3 ครั้งสำหรับ 5 นาทีใน TBS กับนมแห้งปลอดไขมัน 0.5% ที่อุณหภูมิห้อง เยื่อหุ้มแล้วถูกท้าทาย ด้วยแอนติบอดีรอง (ดิชฮอสผันลาป้องกันกระต่าย Pierce, #31,458), เจือจาง 1:50,000 ใน TBS กับนมไขมัน-แห้ง 0.5% สำหรับ 1 h. Cross-reacting วงถูกแสดงเป็นภาพ ด้วย SuperSignal ตะวันตกถือสูงสุดความไวแสงพื้นผิว (ThermoScientific), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต มีวัดความเข้มภาพวงญาติ ด้วย ImageJ ซอฟต์แวร์ เวอร์ชัน 1.48 (http://imageJ.nih.gov/ij/) ความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีน D1 ถูกคำนวณหลังจากฟื้นฟูเนื้อหา ATPB และสัมพันธ์ กับรุ่งอรุณ 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.10 SDS หน้าและ blots ตะวันตก
รวมสารสกัดจากโปรตีน (ดูมาตรา 2.5) มาละลายและตัวอย่างไมโครลิตร 50 ถูกย้ายไปยังหลอด 1.5 มล Eppendorf 50 ไมโครลิตร denaturing บัฟเฟอร์ตัวอย่างที่มี 125 มิลลิเมตร Tris HCl บัฟเฟอร์ค่า pH 6.8, 20% (v / V ) กลีเซอรอล, 4% (w / v) SDS และ 0.0025% (w / v) Bromophenol สีฟ้า วิธีการแก้ปัญหาที่ถูกความร้อนที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีและต่อมาระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้อง ขั้นตอนการดำเนินการทั้งหมดถูกดำเนินการที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างที่สอดคล้องกับ 0.75 ไมโครกรัมโปรตีนทั้งหมดถูกโหลดลงใน Novex 10-20% Tris-Glycine เจล gel electrophoresis ได้ดำเนินการในระบบ Mini-Cell XCell SureLock ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิตและจ้าง Tris-Glycine SDS เล่นบัฟเฟอร์ที่มี 25 มม Tris ฐานค่า pH 8.3 192 มิลลิ Glycine และ 0.1% (w / v) SDS หลังการโอนย้ายโปรตีนถูกย้ายไป Invitrolon PVDF เยื่อใน XCell II เปรอะเปื้อนโมดูลทำตามคำแนะนำของผู้ผลิตที่มีการถ่ายโอนบัฟเฟอร์ที่มี 12 มมทริสพีเอช 8.3, 96 มิลลิ glycine และ 20% (v / v) เมทานอล เยื่อถูกบล็อกค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียสใน TBS buffer 5% (w / v) นมแห้งที่ไม่มีไขมัน แอนติบอดีตระหนักถึงโปรตีน D1 ของ PSII (Agrisera # AS0584) และหน่วยย่อยเบต้าของเอทีพีเทสซึ่งได้รับการยอมรับทั้งยลและรูปแบบ chloroplastic (ATPB, Agrisera # AS0585) ถูกเจือจาง 1: 10,000 และ 1: 50,000 นับถือ ใน TBS กับนมแห้งไม่มีไขมัน 0.5% เยื่อถูกท้าทายเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เยื่อถูกล้างสามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีใน TBS กับนมแห้ง 0.5% ไม่มีไขมันที่อุณหภูมิห้อง เยื่อถูกท้าทายแล้วกับแอนติบอดีรอง (มะรุม peroxidase ผันลาต่อต้านกระต่าย, เพียร์ซ, # 31458) เจือจาง 1: 50,000 ใน TBS กับนมไขมันที่ไม่แห้ง 0.5% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ข้ามปฏิกิริยาวงดนตรีที่ได้รับการมองเห็นด้วย SuperSignal ตะวันตก Femto สูงสุดความไวแสงของพื้นผิว (ThermoScientific) ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต ญาติวงเข้มภาพถูกวัดด้วยซอฟแว ImageJ รุ่น 1.48 (http://imageJ.nih.gov/ij/) D1 อุดมสมบูรณ์โปรตีนที่คำนวณได้หลังจากการฟื้นฟูเพื่อ ATPB เนื้อหาและเมื่อเทียบกับ 2 รุ่งอรุณ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.10 SDS blots ตะวันตกหน้าสารสกัดโปรตีนทั้งหมด ( ดูที่ส่วน 2.5 ) ถูกละลายและ 50 μ l ตัวอย่างไปเป็น 1.5 ml หลอดเพนดอร์ฟกับ 50 μ L ี่ 125 มม. นอกจากนี้ บัฟเฟอร์ที่มีตัวอย่าง HCl บัฟเฟอร์พีเอช 6.8 , 20 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) กลีเซอรอล 4% ( w / v ) SDS และ 0.0025 % ( w / v ) โบรโมฟีนอลสีฟ้า สารละลายที่อุณหภูมิ 65 องศา C เป็นเวลา 5 นาทีและต่อมาเย็นที่อุณหภูมิห้อง ทุกขั้นตอนดำเนินการทดลองที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างที่μ 0.75 กรัมรวมโปรตีนถูกโหลดเข้าไปใน novex 10 – 20% นอกจากนี้ยังเจล เจล ได้ทำการศึกษาใน xcell surelock มินิเซลล์ระบบ ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต และจ้างบริษัทที่มีบัฟเฟอร์ที่มี SDS วิ่ง 25 มิลลิเมตร โดยฐาน pH 8.3 192 มิลลิเมตร ไกลซีนและ 0.1% ( w / v ) t . หลังจากการย้ายถิ่น โปรตีนที่ถูกโอนไปยังเยื่อ invitrolon PVDF ใน xcell 2 ลบโมดูล ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ด้วยการบรรจุ 12 มม. หรือบัฟเฟอร์ pH 8.3 96 มม. ไกลซีนและ 20 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) เมทานอล เยื่อแผ่นแบบบล็อก 4 ° C ในชั่วข้ามคืนที่ TBS buffer 5% ( w / v ) ไม่อ้วนแห้งนม แอนติบอดีต่อโปรตีนของตัว D1 psii ( agrisera # , as0584 ) และเบต้า subunit ของ ATP synthase ซึ่งได้รับการยอมรับทั้งใน และ chloroplastic ยลฟอร์ม ( atpb agrisera # , , as0585 ) และลด 1:10000 : ด้วยความเคารพใน TBS 0.5 ปลอดไขมันแห้งนม เมมเบรนเยื่อแผ่นแบบถูกท้าทายสำหรับ 1 ชั่วโมงล้างสามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีใน TBS 0.5 ปลอดไขมันนมแห้งที่อุณหภูมิห้อง เยื่อแล้วท้าทายกับระดับแอนติบอดี ( พืชชนิดหนึ่ง peroxidase และลาป้องกันกระต่าย , เพียซ # 31458 ) เจือจางใน TBS : 0.5 ไม่แห้ง ไขมันในนมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงทำปฏิกิริยาข้ามกับ supersignal ตะวันตกยังรัดมองเห็นพื้นผิว ( ความไวสูงสุด thermoscientific ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ญาติวงดนตรีภาพเข้มถูกวัดด้วยโปรแกรม ImageJ , รุ่น 1.48 ( http : / / ImageJ . NIH . gov / IJ / ) D1 โปรตีนอุดมสมบูรณ์คำนวณหลังจากการฟื้นฟูเพื่อ atpb เนื้อหาและญาติ 2 รุ่งอรุณ