Western blot. For western blots, pr

Western blot. For western blots, proteins from dissociated ectosymbionts were
separated by reduced SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) on NuPAGE
4–12% Bis-Tris pre-cast gels (Invitrogen), followed by transfer to Hybond ECL
nitrocellulose membranes (Amersham Biosciences). Membranes were blocked for
45 min in PBS containing 5% (wt/vol) nonfat milk (PBSM) at room temperature and
incubated overnight at 4 °C with either a rabbit polyclonal anti-E. coli FtsZ
antibody34 (1:400 dilution) or a sheep polyclonal anti-E. coli pili antibody (ab35292,
Abcam) raised against E. coli K88 fimbrial protein AB/FaeG (http://www.uniprot.
org/uniprot/P02970; 1:1,000 dilution) in PBSM. For the negative control, the
primary antibody was omitted at this step. After three washing steps in PBSM to
remove unbound antibody, the blots were incubated for 1 h at room temperature
with a horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-sheep secondary
antibody (1:5,000, Amersham Biosciences) in PBSM. Protein–antibody
complexes were visualized using ECL Plus detection reagents and films
(Amersham Biosciences).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

น้าตะวันตก สำหรับตะวันตกจัด โปรตีนจาก ectosymbionts พ้นได้แยก โดยลด SDS – การตรวจสอบวิเคราะห์เจอิ (หน้า) ใน NuPAGE4 – 12% ทริสเรทติ้ง bis ก่อนโยนเจ (Invitrogen), ตาม ด้วยโอนไป Hybond ECLไนโตรเซลลูโลสเยื่อ (Amersham ออก) ถูกบล็อคสำหรับเยื่อหุ้ม45 นาทีใน PBS ที่ประกอบด้วยนม nonfat 5% (wt/vol) (PBSM) ที่อุณหภูมิห้อง และรับการกกข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 ° C ด้วยเป็นกระต่ายโพลีแอนติป้องกัน-E. โคไล FtsZantibody34 (เจือจาง 1: 400) หรือการแกะโพลีแอนติป้องกัน e coli pili แอนติบอดี (ab35292Abcam) ขึ้นกับ E. coli K88 fimbrial โปรตีน AB/FaeG (http://www.uniprotองค์กร/uniprot/P02970 1:1,000 เจือจาง) ใน PBSM สำหรับควบคุมการลบ การแอนติบอดีหลักถูกตัดออกในขั้นตอนนี้ หลังจากซักสามขั้นตอนใน PBSM ไปเอาผูกแอนติบอดี จัดได้รับการกก 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องมีเป็ดน้ำผันฮอสกระต่ายป้องกัน หรือต่อต้านแกะรองแอนติบอดี (1:5, 000, Amersham ออก) PBSM โปรตีน – แอนติบอดีคอมเพล็กซ์ถูกแสดงเป็นภาพใช้ ECL บวกการตรวจหาสารรีเอเจนต์และภาพยนตร์(Amersham ออก)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blot . สำหรับ blots ตะวันตก โปรตีนจาก ectosymbionts ทางใจคือแยกจากกันโดย SDS - polyacrylamide gel electrophoresis ลดลง ( หน้า ) nupage4 – 12 % ทวิโดยก่อนโยนเจล ( Invitrogen ) รองลงมา คือ การ hybond ECLเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส ( ชาม Biosciences ) เยื่อที่ถูกบล็อกสำหรับ45 นาทีใน PBS ที่มีถึง 5 % ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) นมไขมันต่ำ ( pbsm ) ที่อุณหภูมิห้องบ่มค้างคืนที่ 4 ° C กับกระต่ายใช้ anti-e. coli ftszantibody34 ( 1 : 400 ( ) หรือ แกะใช้ anti-e. coli พิไล ( ab35292 แอนติบอดี ,ABCAM ) ขึ้นต่อเชื้อ E . coli k88 fimbrial โปรตีน AB / faeg ( http://www.uniprot .uniprot org / / p02970 ; 000 dilution ) ใน pbsm . สำหรับควบคุมลบแอนติบอดีหลักถูกละเว้นในขั้นตอนนี้ หลังจากที่สามขั้นตอนในการล้าง pbsmลบจับกับแอนติบอดี , blots ถูกบ่มไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วยเอนไซม์ conjugated มะรุมป้องกันกระต่ายหรือ anti แกะทุติยภูมิแอนติบอดี ( 1:5000 ชาม , ชีววิทยา ) ใน pbsm . แอนติบอดีต่อโปรตีนจำกัดเป็นภาพเชิงซ้อนโดยใช้การทดสอบเพื่อตรวจจับและภาพยนตร์พลัส( ชาม Biosciences )