Two H. volcanii uracil auxotrophic

Two H. volcanii uracil auxotrophic strains were developed
for constitutive GFP-expression and cell imaging by CLSM
and epifluorescence microscopy (see Additional file 1:
Table S2). The strain H1206(pJAM1020) was based on
selection through novobiocin resistance using a previously
developed vector [59], and a second strain H1206
(pSC409GFP) was based on the gene pyrE2 and uracil
autotrophy [44,46,47]. Plasmid pSC409GFP was constructed
by amplifying the region from pJAM1020
containing red-shifted GFP and P2 promoter for constitutive
expression in haloarchaeal species [59], and
inserting this construct into the shuttle vector pTA409
[101] (see Additional file 1: Tables S2 and S3). Each plasmid
was transformed into the strain H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)
using the PEG-based method as previously developed
[49,102,103], and transformants were selected on Hv-
Ca medium without uracil for H1206(pSC409GFP) orcontaining novobiocin for H1206(pJAM1020). H. volcanii
H1206 is identical to H26 other than an additional deletion
of the mrr gene, which encodes a restriction endonuclease
that cleaves methylated foreign DNA, allowing transformation
without passage through an Escherichia coli dam
mutant [46]. Growth kinetics of each GFP strain in liquid
Hv-YPC medium were measured by optical density and
were unchanged from the parental strain

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มีพัฒนาสายพันธุ์ auxotrophic uracil volcanii H. สองสำหรับนิพจน์ GFP ขึ้นและเซลล์ภาพ โดย CLSMและ epifluorescence microscopy (ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 1:ตาราง S2) เป็นไปตามสายพันธุ์ H1206(pJAM1020)เลือก โดยใช้ความต้านทาน novobiocin ที่ก่อนหน้านี้พัฒนา เวกเตอร์ [59] และต้องใช้สอง H1206(pSC409GFP) ขึ้นอยู่กับยีน pyrE2 และ uracilautotrophy [44,46,47] Plasmid pSC409GFP ถูกสร้างขึ้นโดยมือภูมิภาคจาก pJAM1020มีสีแดงเปลี่ยน GFP และ p 2 โปรโมเตอร์สำหรับขึ้นนิพจน์ในชนิด haloarchaeal [59], และแทรกโครงสร้างนี้เป็น pTA409 เวกเตอร์รถ[101] (ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 1: ตาราง S2 และ S3) แต่ละ plasmidถูกเปลี่ยนเป็นสายพันธุ์ H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)โดยใช้วิธียึดตรึงเป็นก่อนหน้านี้มีพัฒนา[49,102,103], และ transformants ได้ถูกเลือกบน Hv -กลาง Ca โดย uracil สำหรับ novobiocin orcontaining H1206(pSC409GFP) สำหรับ H1206(pJAM1020) H. volcaniiH1206 จะเหมือนกับ H26 ไม่ใช่การลบเพิ่มเติมของยีน mrr ซึ่งจแมป endonuclease จำกัดที่แยกออก methylated DNA ต่างประเทศ ช่วยให้การเปลี่ยนแปลงไม่ มีเส้นทางผ่านมี Escherichia coli เขื่อนmutant [46] จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของแต่ละสายพันธุ์ GFP ในของเหลวHv YPC กลางถูกวัด โดยความหนาแน่นออปติคอล และไม่เหมือนสายพันธุ์โดยผู้ปกครอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สอง H. volcanii uracil auxotrophic สายพันธุ์ได้รับการพัฒนา
สำหรับส่วนประกอบแสดงออก GFP และการถ่ายภาพมือถือโดย CLSM
และกล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S2) H1206 ความเครียด (pJAM1020) ก็ขึ้นอยู่กับ
ตัวเลือกผ่านความต้านทาน novobiocin ใช้ก่อนหน้านี้
ได้รับการพัฒนาเวกเตอร์ [59] และสายพันธุ์ที่สอง H1206
(pSC409GFP) ก็ขึ้นอยู่กับยีน pyrE2 และ uracil
autotrophy [44,46,47] พลาสมิด pSC409GFP ถูกสร้างขึ้น
โดยขยายภูมิภาคจาก pJAM1020
มีโปรโมเตอร์แดงขยับ GFP และ P2 เป็นส่วนประกอบสำหรับ
การแสดงออกในรูป haloarchaeal [59] และ
ใส่นี้สร้างเป็นรถรับส่งเวกเตอร์ pTA409
[101] (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1 ตาราง S2 และ S3 ) พลาสมิดแต่ละ
ก็กลายเป็นสายพันธุ์ H1206 (ΔpyrE2Δmrr)
โดยใช้วิธี PEG-based เช่นการพัฒนาก่อนหน้านี้
[49102103] และ transformant ที่ได้รับการคัดเลือกใน Hv-
กลาง Ca โดยไม่ต้อง uracil สำหรับ H1206 (pSC409GFP) orcontaining novobiocin สำหรับ H1206 (pJAM1020) H. volcanii
H1206 เป็นเหมือน H26 อื่น ๆ นอกเหนือจากการลบเพิ่มเติม
ของยีน MRR ซึ่ง encodes endonuclease ข้อ จำกัด
ที่แข็งกระด้าง methylated ดีเอ็นเอต่างประเทศช่วยให้การเปลี่ยนแปลง
ได้โดยไม่ต้องผ่านทาง Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [46] จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของแต่ละสายพันธุ์ GFP ในของเหลว
กลาง HV-YPC ถูกวัดโดยความหนาแน่นของแสงและ
มีการเปลี่ยนแปลงไปจากสายพันธุ์ของพ่อแม่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . volcanii ยูราซิล auxotrophic สายพันธุ์ที่ถูกพัฒนาสำหรับการแสดงออกของ GFP และภาพ

epifluorescence เซลล์ โดย clsm และกล้องจุลทรรศน์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1
ตาราง S1 ) สายพันธุ์ h1206 ( pjam1020 ) ขึ้นอยู่กับการเลือกใช้ผ่านโนโวไบโอซิน

พัฒนาความต้านทานก่อนหน้านี้เวกเตอร์ [ 59 ] , และสองสายพันธุ์ h1206
( psc409gfp ) บนพื้นฐานของยีนและ pyre2 ยูราซิล
[ 44,46 ออโตทรอพ ,47 ] พลาสมิด psc409gfp ถูกสร้างขึ้นโดยขยายพื้นที่จาก pjam1020

ที่มีสีแดงขยับ GFP และผู้ก่อการ P2 สำหรับรธน.
การแสดงออกใน haloarchaeal ชนิด [ 59 ] ,
แทรกนี้สร้างเป็นรถเวกเตอร์ pta409
[ 101 ] ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S2 และ S3 ) แต่ละสายพันธุ์
กลายเป็นความเครียด h1206 ( Δ pyre2 Δ MRR )
การใช้หมุดตามวิธีที่เคยพัฒนา 49102103
[ ] , และพลาสมิดถูกเลือกใน HV -
CA กลางโดยไม่ Name สำหรับ h1206 ( psc409gfp ) orcontaining โนโวไบโอซินสำหรับ h1206 ( pjam1020 ) ชั่วโมง volcanii
h1206 เป็นเหมือน h26 นอกเหนือจาก
ลบเพิ่มเติมของเป็นยีนที่เข้ารหัสเป็นดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
คลีฟส์ต่างประเทศ methylated ให้เปลี่ยนแปลง
โดยไม่ผ่านการเชื้อ Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [ 46 ] จลนศาสตร์การเจริญเติบโตของ GFP ในแต่ละสายพันธุ์ของเหลว
HV ypc กลางวัดความหนาแน่นของแสงและ
อยู่ไม่เปลี่ยนแปลงจากสายพันธุ์พ่อแม่