Taurine levels of live preys were q

Taurine levels of live preys were quantified following acid hydrolysis with 6 N HCl at 110 C for 16 h (AOAC 1995). Hydrolysates were neutralized with 2 M potassium carbonate and prepped for injection. Taurine was quantified according to (Fleming et al., 1992) utilizing an Agilent 1100 series HPLC and o-phthaldialdehyde precolumn derivatization of amino acids. Next, 100 μL of the hydrolysate was prepped for injection with 1.2 mL water, 100 μL 1.2% benzoic acid, and 100 μL saturated potassium tetraborate. After vortexing, the mixture was filtered through a 0.22-mm syringe filter. Samples were derivatized with o-phthaldialdehyde (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) immediately prior to injection on a 5-um Agilent Hypersil AA ODS column (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) using an automated injection sequence.

Larvae for enzyme assays were tailed and/or headed prior to grinding as previously described (Salze et al., 2012) to ensure easy and complete homogenization. Larvae from 3–10 dph were headed, 11–16 dph larvae were headed and tailed and for 22–27 dph larvae the whole gut was excised. All dissections were realized on an ice-chilled glass slides using a binocular dissecting microscope. Samples were homogenized using an etched-glass tissue grinder (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Each larva up to 16 dph was homogenized in 50 μL of buffer (20 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, 10 mM CaCl2, pH = 7.4). For larvae of 22 dph larvae and older, 100 μL of homogenization buffer was used. The homogenate was centrifuged in an Eppendorf refrigerated microcentrifuge (14,000 rpm, 10 min, 3 °C), and the supernatant pipetted into new tubes and frozen at − 80 °C until assay. Since enzyme activities are reduced following successive freezing/thawing cycles (Hale et al., 2005 and Jameel et al., 1998), all analyses were conducted over 2 days, and no sample was refrozen more than once.

Enzyme kinetic assays were conducted in a SpectraMax Plus384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) plate reader using spectrophotometric methods. At all time-points, homogenates as well as the standard solutions were analyzed in duplicate, and each time point consisted of 3 samples (i.e. n = 3 in duplicate). Lipase and amylase activities were assayed using commercial kits (Pointe Scientific Inc, Canton, MI). Lipase and amylase plates were incubated at 30 °C for 4 min and the increase in absorbance recorded at 550 nm and 405 nm respectively, over 10 min.

Trypsin activity was measured using Nα-P-Tosyl-L-Arginine methyl ester Hydrochloride (TAME, Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) as a substrate according to Walsh et al. (1970). TAME has the advantage as a substrate in being highly sensitive and selective toward trypsin (Uys and Hecht, 1987). This method was adapted to a microplate assay. Briefly, 100 μL of dH2O, sample homogenate, or standard solution were pipetted in designated wells, and allowed to warm to 30 °C. Then 300 μL of buffered substrate solution were added to each well and the increase in absorbance recorded at 247 nm for 8 min.

Pepsin-like activity was assayed using bovine hemoglobin (Hb, Sigma-Aldrich) as a substrate according to the method described by Ryle (1984) and adapted by Salze et al. (2012). After centrifugation of the reaction tubes, 250 μl of the supernatant were loaded in a 96-well plate, and the absorbance (endpoint) read against the blank supernatant at 280 nm. The pepsin activity unit is defined as ΔA280 min− 1 = 0.001(Anson, 1938) under experimental conditions (30 °C, pH = 1.7, light path = 1 cm). Anson's unit UHb is defined as the ΔA280 between sample mean and blank by reference to a standard curve using Hb. The following formulae were used:

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ระดับ taurine ของโลกใต้ท้องอยู่ที่วัดต่อกรดย่อยกับ 6 N HCl 110 c เป็นเวลา 16 ชม. (aoac หรือ 1995) Hydrolysates neutralized ได้กับ 2 เมตรโพแทสเซียมคาร์บอเนต และเตรียมสำหรับฉีด Taurine เป็นวัดตาม (Fleming et al. 1992) ใช้เป็นชุด Agilent 1100 HPLC และ o-phthaldialdehyde derivatization precolumn กรดอะมิโน ถัดไป μL 100 การฉีดถูกเตรียมสำหรับฉีดน้ำ 1.2 มิลลิลิตร 100 μL 1.2% กรดเบนโซอิก และ 100 μL อิ่มตัว tetraborate โพแทสเซียม หลังจาก vortexing ส่วนผสมได้กรองผ่านตัวกรอง 0.22 มม.เข็ม ตัวอย่างที่ derivatized กับ o-phthaldialdehyde (บริษัท Sigma Aldrich, St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ก่อนที่จะฉีดทันทีบนอุ 5 คอลัมน์ Agilent Hypersil AA ODS (Agilent เทคโนโลยี คาร์ลอส CA, USA) ใช้ลำดับการฉีดอัตโนมัติตัวอ่อนสำหรับเอนไซม์ assays เป็นหาง หรือหัวก่อนบดเป็นก่อนหน้านี้อธิบาย (Salze et al. 2012) เพื่อให้ง่าย และสมบูรณ์ homogenization ได้หัวอ่อนจากดีพีเอช 3-10, 11 – 16 ดีพีเอชอ่อนมีหัว และหาง และตัวอ่อนดีพีเอช 22 – 27 ลำไส้ทั้งหมดถูกสรรพสามิต Dissections ทั้งหมดได้รับรู้บนสไลด์แก้วที่แช่น้ำแข็งการใช้กล้องจุลทรรศน์ dissecting ส่องทางไกล ตัวอย่างที่ homogenized ใช้การบดเยื่อแก้วสลัก (Fisher วิทยาศาสตร์ พิตส์เบิร์ก PA) แต่ละตัวอ่อนได้ถึง 16 ดีพีเอชถูก homogenized ใน μL 50 ของบัฟเฟอร์ (20 มม.ทริ – HCl, EDTA 1 มม. 10 มม. CaCl2 ค่า pH = 7.4) ตัวอ่อนตัวอ่อนดีพีเอช 22 และเก่า μL 100 homogenization บัฟเฟอร์ถูกใช้ Homogenate ถูกเหวี่ยงในการ Eppendorf ตู้เย็นไมโคร (14,000 รอบต่อนาที 10 นาที 3 ° C), และ supernatant pipetted ลงในหลอดใหม่ และแช่แข็งที่− 80 ° C จนถึงทดสอบ ตั้งแต่กิจกรรมของเอนไซม์จะลดลงต่อไปนี้ต่อเนื่องละลายแช่แข็ง/รอบ (เฮล et al. 2005 และญะ et al. 1998), ทั้งถูกวิเคราะห์มากกว่า 2 วัน และถูก refrozen ตัวอย่างมากกว่าหนึ่งครั้งเอนไซม์ assays เคลื่อนไหวได้ดำเนินการใน SpectraMax Plus384 (อุปกรณ์โมเลกุล Sunnyvale, CA) ใช้วิธี spectrophotometric อ่านแผ่น เวลาทั้งหมดจุด homogenates เป็นโซลูชั่นมาตรฐานถูกวิเคราะห์ในรายการซ้ำ และแต่ละจุดเวลาประกอบด้วยตัวอย่างที่ 3 (เช่น n = 3 ในซ้ำ) เอนไซม์ไลเปสและ amylase ได้ assayed ใช้ชุดพาณิชย์ (Pointe วิทยาศาสตร์ Inc, Canton, MI) ได้รับการกกเอนไซม์ไลเปสและ amylase แผ่นที่ 30 ° C สำหรับ 4 นาทีและเพิ่มขึ้นใน absorbance ที่บันทึกไว้ที่ 550 nm และ 405 nm ตามลำดับ กว่า 10 นาทีทริปซินกิจกรรมมีวัดโดยใช้เอส methyl Nα-P-Tosyl-L-Arginine ไฮโดรคลอไรด์ (TAME, Sigma Aldrich, St Louis, MO) เป็นพื้นผิวตามวอลช์ et al. (1970) สัตว์ป่ามีประโยชน์เป็นพื้นผิวได้สูงเป็นสำคัญ และเลือกไปทริปซิน (Uys และนโทนี่ชต์ 1987) วิธีนี้ไม่เหมาะกับการทดสอบ microplate สั้น ๆ μL 100 dH2O ตัวอย่าง homogenate หรือโซลูชันมาตรฐาน pipetted ในหลุมที่กำหนด และการอุ่น 30 องศาเซลเซียส แล้ว μL 300 โซลูชันบัฟเฟอร์พื้นถูกเพิ่มไปยังแต่ละอย่างและการเพิ่มขึ้น absorbance ที่บันทึกที่ 247 nm สำหรับ 8 นาทีกิจกรรมเพพซินเหมือนถูก assayed ใช้วัวฮีโมโกลบิน (Hb, Sigma Aldrich) เป็นพื้นผิวตามวิธีการอธิบาย โดย Ryle (1984) และดัดแปลงจาก Salze et al. (2012) หลังจากการหมุนของหลอดปฏิกิริยา μl 250 ของ supernatant ถูกโหลดในแผ่นดี 96 และ absorbance (ปลายทาง) อ่านกับ supernatant เปล่าที่ 280 nm หน่วยกิจกรรมน้ำย่อยถูกกำหนดเป็น 1 = 0.001(Anson, 1938) min− ΔA280 ภายใต้เงื่อนไขทดลอง (30 ° C, pH = 1.7 เส้นทาง = 1 cm) หน่วยของ Anson UHb ถูกกำหนดเป็น ΔA280 หมายถึงตัวอย่างและว่างเปล่า โดยเส้นโค้งมาตรฐานใช้ Hb ใช้สูตรต่อไปนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ระดับ Taurine ของเหยื่อสดถูกจองจำปริมาณกรดต่อไปนี้มี 6 N HCl ที่ 110 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 16 ชั่วโมง (AOAC 1995) ไฮโดรไลเซถูกเป็นกลางกับ 2 M โพแทสเซียมคาร์บอเนตและเตี๊ยมสำหรับฉีด ทอรีนได้รับการวัดตาม (เฟลมมิ่ง et al., 1992) การใช้ประโยชน์ Agilent 1100 ชุด HPLC และ O-phthaldialdehyde อนุพันธ์ precolumn ของกรดอะมิโน ถัดไป 100 ไมโครลิตรไฮโดรไลเซถูกเตี๊ยมสำหรับฉีดน้ำ 1.2 มิลลิลิตร 100 ไมโครลิตร 1.2% กรดเบนโซอิกและ 100 ไมโครลิตรอิ่มตัวโพแทสเซียม tetraborate หลังจาก vortexing, ส่วนผสมที่ถูกกรองผ่านตัวกรองเข็มฉีดยา 0.22 มม ตัวอย่าง derivatized กับ O-phthaldialdehyde (Sigma-Aldrich Co. , St. Louis, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) ทันทีก่อนที่จะฉีดใน 5 UM Agilent Hypersil AA ODS คอลัมน์ (Agilent Technologies, พาโลอัลโต, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ใช้โดยอัตโนมัติ ลำดับการฉีด. ตัวอ่อนสำหรับเอนไซม์ถูกเทลด์และ / หรือก่อนที่จะมุ่งหน้าไปบดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Salze et al., 2012) เพื่อให้แน่ใจว่าเป็นเนื้อเดียวกันที่ง่ายและสมบูรณ์ ตัวอ่อน 3-10 DPH กำลังมุ่งหน้าไป, 11-16 DPH ตัวอ่อนกำลังมุ่งหน้าไปและเทลด์และ 22-27 DPH ตัวอ่อนไส้ทั้งหมดถูกตัดทิ้ง เบามือทั้งหมดได้ตระหนักถึงบนน้ำแข็งแช่เย็นกระจกสไลด์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ผ่าตัดตา ตัวอย่างที่ถูกปั่นโดยใช้เครื่องบดเนื้อเยื่อกระจกสลักลาย (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) แต่ละตัวอ่อนถึง 16 DPH ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน 50 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ (20 มิลลิเมตร Tris-HCl 1 มิ EDTA, 10 มิลลิ CaCl2 ค่า pH = 7.4) สำหรับตัวอ่อนของตัวอ่อน 22 DPH และผู้สูงอายุ 100 ไมโครลิตรของ buffer เป็นเนื้อเดียวกันถูกนำมาใช้ homogenate ถูกปั่นในไมโคร Eppendorf ตู้เย็น (14,000 รอบต่อนาที, 10 นาที, 3 ° C) และสารละลายปิเปตเข้าไปในท่อใหม่และแช่แข็งที่ - 80 องศาเซลเซียสจนการทดสอบ เนื่องจากการทำงานของเอนไซม์จะลดลงต่อไปรอบเนื่องแช่แข็ง / ละลาย (เฮล et al., ปี 2005 และ Jameel et al., 1998) การวิเคราะห์ทั้งหมดถูกดำเนินการในช่วง 2 วันและตัวอย่างไม่มี refrozen มากกว่าหนึ่งครั้ง. เอนไซม์ตรวจการเคลื่อนไหวได้ดำเนินการใน SpectraMax Plus384 (โมเลกุล Devices, ซันนีเวล, แคลิฟอร์เนีย) อ่านแผ่นโดยใช้วิธีสเปก ในทุกครั้งที่จุด homogenates เช่นเดียวกับการแก้ปัญหามาตรฐานการวิเคราะห์ในที่ซ้ำกันและจุดในแต่ละครั้งประกอบด้วย 3 ตัวอย่าง (เช่น n = 3 ในที่ซ้ำกัน) เอนไซม์ไลเปสและอะไมเลสกิจกรรมและนำไปวิเคราะห์โดยใช้ชุดพาณิชย์ (ปวงวิทยาศาสตร์ Inc, แคนตัน, MI) เอนไซม์ไลเปสและอะไมเลสแผ่นถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาทีและเพิ่มขึ้นในการดูดกลืนแสงที่บันทึกไว้ที่ 550 นาโนเมตรและ 405 นาโนเมตรตามลำดับในช่วง 10 นาที. กิจกรรม Trypsin ถูกวัดโดยใช้Nα-P-Tosyl-L-Arginine เมทิลเอสเตอร์ไฮโดรคลอไร (เชื่อง , Sigma-Aldrich, St-Louis, มิสซูรี) เป็นสารตั้งต้นตามวอลช์, et al (1970) เชื่องมีประโยชน์เป็นสารตั้งต้นในการเป็นอย่างสูงที่มีความสำคัญและเลือกไปทาง trypsin (Uys และชต์ 1987) วิธีการนี้จะได้รับการปรับให้เข้ากับการทดสอบไมโคร สั้น ๆ , 100 ไมโครลิตรของ dH2O, homogenate ตัวอย่างหรือสารละลายมาตรฐานปิเปตในหลุมที่กำหนดและได้รับอนุญาตให้อุ่นถึง 30 ° C แล้ว 300 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาสารตั้งต้นบัฟเฟอร์ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละดีและเพิ่มขึ้นในการดูดกลืนแสงที่บันทึกไว้ที่ 247 นาโนเมตรเป็นเวลา 8 นาที. กิจกรรมน้ำย่อยเหมือนได้รับการวิเคราะห์โดยใช้วัวฮีโมโกล (Hb, Sigma-Aldrich) เป็นสารตั้งต้นตามวิธีการที่อธิบายโดย Ryle (1984) และดัดแปลงโดย Salze et al, (2012) หลังจากการหมุนเหวี่ยงของหลอดปฏิกิริยา 250 ไมโครลิตรของสารละลายที่ถูกโหลดในแผ่น 96 หลุมและการดูดกลืนแสง (ปลายทาง) อ่านกับสารละลายว่างเปล่าที่ 280 นาโนเมตร หน่วยกิจกรรมน้ำย่อยถูกกำหนดให้เป็นΔA280 min- 1 = 0.001 (แอนสัน, 1938) ภายใต้เงื่อนไขการทดลอง (30 ° C ค่า pH = 1.7 เส้นทางแสง = 1 ซม.) แอนสันหน่วย UHB ถูกกำหนดให้เป็นตัวอย่างΔA280ระหว่างค่าเฉลี่ยและที่ว่างเปล่าโดยอ้างอิงถึงโค้งมาตรฐานใช้ Hb สูตรต่อไปนี้ถูกนำมาใช้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ระดับของเหยื่อถูก quantified นมีชีวิตต่อไปด้วย 6 N HCl กรด   16  ที่ 110 C H ( ไม่ 1995 ) ของถูก neutralized ด้วย 2 ไหม M โพแทสเซียมคาร์บอเนตและเตรียมตัวสำหรับการฉีด ไม่ก็วัดได้ตาม ( เฟลมมิ่ง et al . , 1992 ) ใช้เป็น Agilent 1100 ชุด HPLC o-phthaldialdehyde และ precolumn กับกรดอะมิโน หน้า 100  μ L ของผู้ถูก prepped สำหรับฉีดน้ำ 1.2   100  μ L 1.2% กรดเบนโซอิกและ 100  μผมอิ่มตัวโพแทสเซียมเตตระบอเรต . หลังจาก vortexing ส่วนผสมถูกกรองผ่าน 0.22-mm เข็มตัวกรอง จำนวน derivatized กับ o-phthaldialdehyde ( ซิกม่า Aldrich Co . , St . Louis , MO , USA ) ทันทีก่อนที่จะฉีดใน 5-um Agilent ขน AA ODS คอลัมน์ ( Agilent Technologies , พาโลอัลโต , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ) ใช้ฉีดอัตโนมัติตามลําดับตัวอ่อนสำหรับตรวจเอนไซม์เป็น หาง และ / หรือจะไปก่อนคัฟตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( salze et al . , 2012 ) เพื่อให้ง่ายและสมบูรณ์การ . ตัวอ่อนจาก 3 – 10 Inc มุ่งหน้า 11 – 16 Inc ( หัวและหางและ 22 – 27 Inc หนอนลำไส้ทั้งหมดถูกเอาออก ทั้งหมด dissections ได้ตระหนักในน้ำแข็งแช่เย็นกระจกสไลด์โดยใช้กล้องสองตาผ่ากล้องจุลทรรศน์ กลุ่มตัวอย่างที่ใช้เป็นกระจกแกะสลักเครื่องบดบดเนื้อเยื่อ ( ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , Pittsburgh , PA ) แต่ละตัวถึง 16 Inc ถูกบดใน 50  μ L ของบัฟเฟอร์ ( 20 มม. นอกจากนี้ –  HCl 1 mM EDTA 10  มม. ผลิตพีเอชรึเปล่า = ไหม 7.4 ) สำหรับตัวอ่อนของ 22 Inc ตัวอ่อนและเก่า 100  μ l การบัฟเฟอร์ที่ใช้ โดยแยกเป็นระดับในเพนดอร์ฟตู้เย็นไมโครเซนตริฟิวจ์ ( 14 , 000   10  รอบต่อนาที , มิน , 3  ° C ) และ สูง pipetted เป็นหลอดใหม่และแช่แข็งที่อุณหภูมิ 80 C −  °จนกว่าการทดสอบ ตั้งแต่กิจกรรมเอนไซม์จะลดลงตามความหนาว / ละลายรอบ ( เฮล et al . , 2005 และสำนักงาน   et al . , 1998 ) , การวิเคราะห์จำนวนกว่า 2 รึเปล่า วัน และไม่มีตัวอย่าง refrozen มากกว่าหนึ่งครั้งเอนไซม์ ) มีวัตถุประสงค์ใน spectramax plus384 ( อุปกรณ์โมเลกุล , Sunnyvale , CA ) อ่านแผ่นโดยใช้วิธีการ ) . ณ จุดเวลา ทั้งหมด homogenates เช่นเดียวกับโซลูชั่นมาตรฐานวิเคราะห์ซ้ำ และแต่ละจุดเวลา จำนวน 3 ตัวอย่าง เช่น N รึเปล่า = ไหม 3 ซ้ำ ) กิจกรรมเอนไซม์อะไมเลสเป็นเอนไซม์ชนิดและใช้ในเชิงพาณิชย์ ( Pointe วิทยาศาสตร์ Inc , กวางตุ้ง , มิ ) เอนไซม์อะไมเลสและแผ่นถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30  ° C 4 รึเปล่า มิน และการเพิ่มขึ้นของค่าการดูดกลืนแสงที่บันทึก 550 nm และ 405 nm ตามลำดับ    กว่า 10 นาทีกิจกรรมของเอนไซม์ถูกวัดโดยใช้ N แอลฟาเมทิลเอสเทอร์ของ p-tosyl-l-arginine ไฮโดรคลอไรด์ ( เชื่อง , ซิกม่า Aldrich เซนต์หลุยส์ โม ) เป็นสารตั้งต้นตามวอลช์ et al . ( 1970 ) เชื่องมีข้อได้เปรียบที่เป็นสารตั้งต้นในการเลือกความไวสูงต่อเอนไซม์ ( และ uys แฮ็ชท์ , 1987 ) วิธีนี้ถูกดัดแปลงให้พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ตามลำดับ สั้น 100  μ l dh2o ตัวอย่างแยก หรือโซลูชั่นมาตรฐาน ได้แก่ pipetted ในเขตบ่อและอนุญาตให้อุ่น 30  ° C แล้ว 300  μลิตร 2 แผ่น โซลูชั่น เพิ่ม กัน และการเพิ่มค่าการดูดกลืนแสงที่บันทึกแล้วทำไม nm 8 รึเปล่าคะเตยหอมชอบกิจกรรมซีรั่มใช้ฮีโมโกลบิน ( Hb ) , Sigma ดิช ) เป็นสารตั้งต้นตามวิธีการที่อธิบายโดยไรล์ ( 1984 ) และดัดแปลงโดย salze et al . ( 2012 ) หลังการปั่นเหวี่ยงของปฏิกิริยาหลอด 250  μ L ของน่านถูกโหลดใน 96 ดีจานและการดูดกลืนแสง ( endpoint ) อ่านต่อที่นำอะไรว่างที่ 280 nm . หน่วยกิจกรรมเอนไซม์เปปซิน หมายถึง Δ a280 มิน−  1 ไหม = = ( ทำไมแอนสัน , 1938 ) ภายใต้สภาวะการทดลอง ( 30  ° C , pH รึเปล่า =   1.7 , ไฟทางเดินรึเปล่า = ไหม 1 รึเปล่าซม. ) แอนสัน เป็นหน่วย uhb หมายถึงΔ a280 ระหว่างตัวอย่างและว่างเปล่า โดยอ้างอิงกับมาตรฐานโค้งใช้ HB . สูตรต่อไปนี้ใช้