2.3. Analysis of AFM1 in milkUp to

2.3. Analysis of AFM1 in milk
Up to 50 ml of raw milk samples were collected from dairy
farmers and milk collectors. Milk samples were centrifuged in 10
C
for 5 min with 4000 g. After discarding the upper cream layer, the
lower phases were used for quantitative testing. All milk samples
were first screened with high sensitivity ELISA that detects AFM1 in
the concentration range between 0.05 and 0.1 mg/L (Helica Biosystem
Inc., San Diego, USA). Milk samples with higher concentration
than 0.1 mg/L were rerun with Helica 2000 M1 ELISA kit that
has a detection range between 0.1 and 2.0 mg/L.
Assay procedure was followed according to the protocol provided
by the manufacturer. Briefly, sample solutions or standards of
50 ml together with 200 ml of assay diluent kept at room temperature
were added to mixing wells. Next, 100 ml solutions from the
mixing wells were transferred to the assay wells coated with AFM1
antibodies and incubated for 10 min at room temperature in the
dark. After adding 100 ml horseradish peroxidase as a conjugate to
AFM1, incubation continued for further 30 min. Then the liquid was
poured out of the wells and wells were washed with PBS-Tween 20
buffer solution three times.Wells were tapped face down on a layer
of absorbent to remove the residual wash buffer. In the next stage,
100 ml of tetramethylbenzidine (TMB) as enzyme substrate was
added into each well and incubation was allowed for 10 min at
room temperature in the dark, and then 100 m1 of the stop solution
was added to the microplate wells, which changes the color from
blue to yellow. The optical density (OD) was measured at 450 nm
using a microplate reader (BioTek Instruments, Inc., USA). All
samples were run in duplicates. For low concentration range assay,
200 ml samples and standards were directly added into the assay
well and incubated for 2 h. Then the liquid was poured out of the
wells and wells were washed with buffer solution, and similar
procedurewas followed as described above in order to measure the
OD at 450 nm microplate reader.
Two sets of standard solutions were used for AFM1 calibration
curves, specifically, one for lower concentrations in the range of
0.05e0.1 mg/L, and another for higher concentrations in the range of
0.1e2.0 mg/L. Those samples, which were beyond the range of the
highest standard concentration, were diluted and ELISA experiments
were repeated.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การวิเคราะห์ afm1 นม
ถึง 50 มิลลิลิตร จำนวนตัวอย่างน้ำนมดิบจากเกษตรกร
และสะสมนม ตัวอย่างนมอยู่ในระดับ 10
C
5 นาทีกับ 4000 กรัม หลังจากทิ้งชั้นครีมบน
ลดขั้นตอนที่ใช้สำหรับการทดสอบเชิงปริมาณ ทั้งหมดตัวอย่างนม
ก่อนฉายความไวสูง ) ที่ตรวจพบในช่วงความเข้มข้นระหว่าง afm1
005 และ 0.1 mg / l ( helica biosystem
อิงค์ , ซานดิเอโก , สหรัฐอเมริกา )
ตัวอย่างนมที่มีความเข้มข้นสูงกว่า 0.1 มก. / ล. พบฉายซ้ำด้วย helica 2000 M1 ชุด ELISA ที่
มีการตรวจจับช่วงระหว่าง 0.1 และ 2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร ขั้นตอนการทดสอบตามตาม

รับให้โดยผู้ผลิต สั้น , ตัวอย่าง โซลูชั่น หรือมาตรฐานของ
50 ml 200 มิลลิลิตร ร่วมกับวิธีเจือจางอยู่
อุณหภูมิห้องที่ถูกผสม เวลส์ ถัดไป , 100 ml โซลูชั่นจาก
ผสม คือ บ่อ ( บ่อเคลือบด้วย afm1
แอนติบอดีบ่มเป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิห้องใน
มืด หลังจากเพิ่ม 100 ml . มีเป็นคู่

afm1 บ่มอย่างต่อเนื่อง , ต่อไป 30 นาที จากนั้นของเหลว
เทออกจากบ่อ และบ่อถูกล้างด้วย pbs Tween 20
สารละลายบัฟเฟอร์ 3 ครั้ง เวลส์ ถูกทาบทามลงบนใบหน้าของชั้น
ดูดซับเอาสารบัฟเฟอร์ล้างส่วนที่เหลือ ในขั้นตอนต่อไป
100 มิลลิลิตรของ tetramethylbenzidine ( TMB ) ของเอนไซม์และสับสเตรทคือ
เพิ่มในแต่ละ และบ่มเพาะให้ 10 นาทีที่
อุณหภูมิห้องในที่มืด และ 100 ของ M1
หยุด โซลูชั่นถูกเพิ่มลงในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย เวลส์ ซึ่งการเปลี่ยนแปลงสีจาก
สีฟ้าสีเหลือง ความหนาแน่นของแสง ( OD ) เป็นวัดที่ 450 nm
ใช้อ่านพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( USA biotek เครื่องมือ , Inc . , ) ตัวอย่างทั้งหมด
ถูกใช้ซ้ำกัน สำหรับในช่วงความเข้มข้นต่ำ
200 ml ตัวอย่างและมาตรฐานโดยตรงเพิ่มเป็น 3
ดีและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นก็เทของเหลวออกจาก
บ่อ และบ่อถูกล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ และ procedurewas คล้ายกัน
ตามตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เพื่อที่จะวัดค่า OD ที่ 450 nm พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยอ่าน
.
2 ชุดโซลูชั่นมาตรฐานที่ใช้สำหรับการสอบเทียบ afm1
โค้งโดยเฉพาะ สำหรับลดความเข้มข้นในช่วง
0.05e0.1 มก. / ล. และ อื่น สูงกว่า ความเข้มข้นในช่วง
0.1e2.0 มิลลิกรัมต่อลิตร นั้น ตัวอย่างซึ่งนอกเหนือจากช่วงของ
มาตรฐานสูงสุด ความเข้มข้น ลดและ ELISA การทดลอง
เป็นซ้ำ